劉賢潔，孫原，馬小力

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110001；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科重癥病房，河北 唐山 063000）

·論著·

單純皰疹病毒Ⅰ型的Th細(xì)胞和B細(xì)胞表位重組核酸疫苗的構(gòu)建及真核表達(dá)

劉賢潔1，孫原2，馬小力1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110001；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科重癥病房，河北 唐山 063000）

目的構(gòu)建單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV-1）糖蛋白B（gB）和糖蛋白D（gD）的Th細(xì)胞和B細(xì)胞表位重組串聯(lián)核酸疫苗，并鑒定其真核表達(dá)。方法利用生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)HSV-1 gB和gD的Th細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位，結(jié)合已發(fā)表文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)合成HSV-1的Th細(xì)胞和B細(xì)胞表位重組串聯(lián)抗原基因（Th/B基因）。將Th/B基因定向克隆入真核表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-Th/B。用制備的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，裂解細(xì)胞后經(jīng)Western blot鑒定其蛋白表達(dá)。結(jié)果預(yù)測(cè)得到了HSV-1 gB和gD的Th細(xì)胞和B細(xì)胞表位，成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-Th/B，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列正確。SDS-PAGE分離出相應(yīng)大小的蛋白表達(dá)片段，經(jīng)Western blot鑒定并證實(shí)該重組核酸疫苗能夠在體外真核細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建HSV-1 Th細(xì)胞和B細(xì)胞表位重組串聯(lián)核酸疫苗，并能夠在體外真核細(xì)胞中表達(dá)，為HSV-1核酸疫苗的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

單純皰疹病毒；Th細(xì)胞和B細(xì)胞表位；核酸疫苗

單純皰疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virusⅠ，HSV-1）是一個(gè)嗜神經(jīng)的雙鏈DNA病毒，可以終身潛伏性感染神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。HSV-1感染宿主后引起角膜免疫病理反應(yīng)并發(fā)生單純皰疹病毒性角膜炎，感染的HSV-1長(zhǎng)期潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)，導(dǎo)致角膜反復(fù)感染而最終導(dǎo)致失明，是一種嚴(yán)重的致盲性眼?。?］。目前單純皰疹病毒性角膜炎的治療主要還是依賴抗病毒藥物，但現(xiàn)有抗病毒藥物不但具有一定的毒副作用，使耐藥毒株增加，而且不能預(yù)防病毒感染和復(fù)發(fā)。因此，研制預(yù)防HSV-1感染及復(fù)發(fā)的疫苗具有重要意義［2，3］。本研究通過(guò)預(yù)測(cè)HSV-1糖蛋白B（glycoprotein B，gB）和糖蛋白D（glycoprotein D，gD）的Th細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位，構(gòu)建HSV-1 Th細(xì)胞和B細(xì)胞表位重組串聯(lián)抗原疫苗，為今后進(jìn)一步研究HSV-1核酸疫苗打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種及細(xì)胞：pVAX1質(zhì)粒和表達(dá)菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。COS-7細(xì)胞為非洲綠猴的腎細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 分子生物學(xué)試劑：NheⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Polymerase Taq DNA聚合酶、質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)于大連寶生物工程有限公司。Histag抗體購(gòu)于康為世紀(jì)公司，羊抗小鼠IgG-HRP購(gòu)于碧云天公司，Attractene轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于QIAGEN公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純以上產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 HSV-1 Th細(xì)胞、B細(xì)胞表位重組串聯(lián)抗原疫苗的設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank上公布的HSV-1（17株）的基因序列，獲得gB和gD的氨基酸序列。利用生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)HSV-1 gB和gD糖蛋白抗原的Th細(xì)胞和B細(xì)胞表位。生物信息學(xué)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類(lèi)分子預(yù)測(cè)采用BIMAS（http：//wwwbimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/）和 IEDB（http：// www.iedb.org）。生物信息學(xué)B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)采用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器Bcepred（http：//www.imtech.res.in/raghava/ bcepred/bcepred_submission.html）和IEDB。結(jié)合已發(fā)表的文獻(xiàn)，優(yōu)化選擇抗原表位的編碼基因，綜合各項(xiàng)結(jié)果確定HSV-1 gB和gD糖蛋白抗原的Th細(xì)胞和B細(xì)胞表位。按照表位在基因組上的順序，在各表位間添加適合的Linker設(shè)計(jì)Th細(xì)胞和B細(xì)胞表位盒，并通過(guò)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器SOPMA（http：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_auomat.pl? page=/NPSA/npsa_sopma.html）和蛋白酶體切割預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器PAPROC（http：//www.Paproc.de）優(yōu)化表位盒的構(gòu)成和Linker的選擇。在此基礎(chǔ)上在表位盒中加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)引導(dǎo)序列（Igκ鏈信號(hào)序列）和泛DR輔助T細(xì)胞表位（pan-DR helper T cell epitope，PADRE），以輔助表位更好地突破主要組織相容性復(fù)合體限制性而發(fā)揮功能，加入蛋白酶有限識(shí)別基序（GPGPG）作為間隔序列，起始端引入Kozak序列［4］介導(dǎo)mRNA翻譯起始，末端加入His標(biāo)簽，兩端加入NheⅠ/XhoⅠ酶切位點(diǎn)。根據(jù)設(shè)計(jì)的表位盒，復(fù)原其核苷酸序列，并參照真核優(yōu)勢(shì)密碼子規(guī)則進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)Th/B基因。

1.2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-Th/B的構(gòu)建：Th/B基因由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。Th/B基因定向克隆入真核載體pVAX1構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-Th/B，將質(zhì)粒pVAX1-Th/B轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，NheⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定并交付金唯智公司DNA測(cè)序。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的COS-7細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞懸液2 mL，每孔接種細(xì)胞5× 105個(gè)。于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)平衡30 min后，加入轉(zhuǎn)染試劑Attractene轉(zhuǎn)染試劑和去內(nèi)毒素提取的pVAX1-Th/B質(zhì)粒，另設(shè)空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組，每組均設(shè)2個(gè)復(fù)孔，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后收集細(xì)胞。

1.2.4 Western blot鑒定蛋白表達(dá)：將收集到的細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，靜置5 min，用低溫冷凍離心機(jī)離心10 min（12 000 r/min，4℃），分離上清為所得到的蛋白質(zhì)抽提物。用5×Loading Buffer和PBS稀釋蛋白樣品，在沸水浴中煮沸5 min，制成上樣液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳（濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為13%，本次實(shí)驗(yàn)的上樣體積20 μL，含40 μg蛋白，加入蛋白Marker體積為5 μL）。取適當(dāng)大小的PVDF膜用“三明治”法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜進(jìn)行封閉。以稀釋比例1∶1 500的His-tag抗體為一抗工作液，倒入雜交袋中，放入封閉好的PVDF膜，壓膜機(jī)封口后置于4℃冰箱過(guò)夜孵育一抗。將孵育一抗后的PVDF膜從雜交袋中取出，洗膜。以稀釋比例1∶1 500的羊抗小鼠IgG-HRP為二抗工作液，倒入雜交袋中，放入漂洗好的PVDF膜，壓膜機(jī)封口后置于37℃溫箱45 min孵育二抗。將孵育二抗后的PVDF膜從雜交袋中取出，以ECL底物發(fā)光法在暗室進(jìn)行曝光。

2 結(jié)果

2.1 HSV-1 gB和gD糖蛋白抗原的Th細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位

利用生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)HSV-1 gB和gD糖蛋白抗原的Th細(xì)胞和B細(xì)胞表位，結(jié)合已發(fā)表文獻(xiàn)，篩選出10個(gè)抗原表位，各抗原表位來(lái)源及氨基酸序列見(jiàn)表1。進(jìn)一步優(yōu)化表位設(shè)計(jì)，確定Th/B基因序列，設(shè)計(jì)的重組多表位串聯(lián)基因長(zhǎng)873 bp，編碼280個(gè)氨基酸殘基。

2.2 Western blot鑒定Th/B基因的蛋白表達(dá)

將經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳分離的蛋白條帶經(jīng)Western blot鑒定（圖1），結(jié)果顯示Th/B組出現(xiàn)了Histag的陽(yáng)性識(shí)別條帶，大小約30 kDa。而對(duì)照組則未見(jiàn)該區(qū)域條帶，無(wú)目的蛋白的表達(dá)。

3 討論

HSV-1的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由雙鏈DNA和病毒染色質(zhì)磷蛋白組成核，20面體核殼包繞其上，核殼又被糖蛋白、碳水化合物及脂質(zhì)所構(gòu)成的包膜所包繞。HSV-1的包膜糖蛋白是細(xì)胞免疫和體液免疫的主要靶標(biāo)，也是目前HSV疫苗的研究熱點(diǎn)。目前已知HSV-1至少有12種糖蛋白［5］，其中g(shù)B和gD是病毒復(fù)制、穿入、細(xì)胞間擴(kuò)散以及病毒囊膜與感染的細(xì)胞膜相融合所必需糖蛋白。gD是抗HSV感染中重要的保護(hù)性抗原，能保護(hù)動(dòng)物免受HSV的攻擊，抑制潛伏感染的發(fā)生，甚至在潛伏感染已建立后，也能減輕其復(fù)發(fā)［6］。gB在皰疹病毒家族中是高度保守蛋白，是病毒復(fù)制必需蛋白，也是宿主免疫反應(yīng)的主要靶抗原，能誘導(dǎo)體液免疫、細(xì)胞免疫和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)［7］。目前，以HSV gD和gB為靶標(biāo)的疫苗研究是HSV疫苗研究的熱點(diǎn)［8］，已有研究證實(shí)gB和gD疫苗在預(yù)防角膜炎發(fā)生以及減少角膜新生血管形成上具有顯著療效。雖然gB疫苗或gD疫苗的單一使用均可產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)作用，但不能完全避免單皰病毒性角膜炎的發(fā)生，也不能清除病毒的潛伏感染，單一接種gB或gD疫苗后部分小鼠體內(nèi)仍可檢測(cè)到病毒復(fù)制，說(shuō)明任何單一的糖蛋白疫苗免疫作用均不完善［9］，單皰病毒糖蛋白聯(lián)合疫苗或多表位疫苗可能是預(yù)防和治療HSV較為理想的疫苗。

表1 重組多表位串聯(lián)基因Th/B基因的抗原表位來(lái)源和序列Tab.1 Position and sequence of recombinant multi-epitope gene（Th/B gene）

圖1 重組Th/B基因的蛋白表達(dá)Fig.1 Protein expression of recombinant Th/B gene

核酸疫苗被稱為最有前景的第三代疫苗，作為一種新型的免疫手段，已經(jīng)在感染性疾病和腫瘤的防治中展現(xiàn)了巨大的潛力，日益受到關(guān)注與重視。與傳統(tǒng)的蛋白為基礎(chǔ)的疫苗相比，核酸疫苗不僅可激發(fā)機(jī)體的體液免疫還可激發(fā)細(xì)胞免疫，便于修飾加工、進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，特別是可以把不同抗原的多個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位組合制備多表位疫苗，能夠?qū)C(jī)體形成多特異性、多層次的免疫保護(hù)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單抗原的保護(hù)能力。目前新發(fā)展的基于計(jì)算機(jī)生物信息學(xué)的抗原表位預(yù)測(cè)方法，使新表位的發(fā)現(xiàn)效率提高10～20倍，實(shí)驗(yàn)工作量減少95%，節(jié)約研究成本和時(shí)間，很大程度上加快了新表位的發(fā)現(xiàn)效率［10］，為我們研究HSV-1疫苗提供了新的思路。

因此，本研究選擇HSV-1 gB和gD作為標(biāo)靶抗原，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)，采用計(jì)算機(jī)表位預(yù)測(cè)方法，預(yù)測(cè)HSV-1 gB和gD的Th細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。為使基因有效表達(dá)，在核酸5’端中加入Kozak序列（AATMG），它是真核生物mRNA 5’端帽子結(jié)構(gòu)后的一段核酸序列，是提高基因表達(dá)的一個(gè)上游調(diào)控元件，可與翻譯起始因子結(jié)合，介導(dǎo)翻譯起始，增強(qiáng)外源基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。添加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引導(dǎo)信號(hào)以促進(jìn)表位信號(hào)更高效率的合成和折疊。另外，在設(shè)計(jì)中還加入了PADRE，由13個(gè)氨基酸殘基組成（AKFVAAWTLKAAA），可以與人類(lèi)的多數(shù)HLA-DR分子及部分小鼠的Ⅱ類(lèi)基因分子結(jié)合。PADRE不僅能增加Th細(xì)胞的反應(yīng)效能，比自然源性Th細(xì)胞表位高1 000倍，能增強(qiáng)核酸疫苗激發(fā)細(xì)胞免疫的能力；也可為B細(xì)胞表位及碳水化合物抗原提供輔助作用，同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫及細(xì)胞免疫，對(duì)人體安全、無(wú)毒副作用。表位間采用了“GPGPG linker”，以減少表位間的干擾使之獨(dú)立發(fā)揮功能。本研究對(duì)HSV-1 Th細(xì)胞、B細(xì)胞表位重組核酸疫苗進(jìn)行了多步優(yōu)化設(shè)計(jì)，并已證實(shí)可在真核細(xì)胞中表達(dá)，為今后的HSV-1疫苗研制打下基礎(chǔ)。目前關(guān)于該疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)性還有待進(jìn)一步研究。

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（編輯 陳 姜）

Construction and Eukaryotic Expression of HSV-1 Th and BLymphocytes Recombinant Multi-epitope DNAVaccine

LIUXian-jie1，SUN Yuan2，MAXiao-li1

（1.Department of Ophthalmology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Neurology，Affiliated Hospital of North China University ofScience and Technology，Tangshan 063000，China）

Objective To construct the recombinant multi-epitope DNA vaccine of HSV-1 Th and B lymphocytes of gB-gD protein，and to identify its eukaryotic expression.MethodsThe epitopes ofHSV-1 gB-gDprotein were analyzed by bioinformatics analysis software.HSV-1 Th and Blymphocyte recombinantmulti-epitope gene（Th/B gene）was designed and synthesized.Th/B gene was cloned into pVAX1 to synthesize pVAX1-Th/B. pVAX1-Th/B was then transfected into COS-7 cell，and the protein expression was identified by Western blot.ResultsThe epitopes of Th and B lymphocytes of HSV-1 gB and gD were predicted，and the eukaryotic expression plasmid pf pVAX1-Th/B was successfully constructed and confirmed by sequencing.In addition，the in vivo protein expression of the recombinant DNA was confirmed by Western blot.ConclusionHSV-1 Th and B lymphocyte recombinant multi-epitope DNA vaccine was successfully synthesized in this study.HSV-1 Th and B lymphocyte recombinant multi-epitope DNAvaccine can be successfully expressed in isolated eukaryotic cells.This study provides a feasible solution fordeveloping DNAvaccine againstHSV-1 infection.

herpes simplex virus；Th cell and B cell epitope；DNA vaccine

R772.2

A

0258-4646（2015）09-0796-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（81200656）；遼寧省博士啟動(dòng)基金（20111097）

劉賢潔（1986-），女，醫(yī)師，碩士研究生.

馬小力，E-mail：xiaolimax@gmail.com

2015-04-20

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：