陳亮宇，劉麗波，李新星，喻博，洪楊，鄭健，于奇，薛一雪，劉云會

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110004；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，沈陽 110122）

·論著·

MiR-429對人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及其作用機(jī)制

陳亮宇1，劉麗波2，李新星1，喻博1，洪楊1，鄭健1，于奇1，薛一雪2，劉云會1

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110004；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，沈陽 110122）

目的研究miR-429對人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及可能機(jī)制。方法培養(yǎng)人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞，應(yīng)用Lipofectamine?LTX試劑將pre-miR-429質(zhì)粒以及anti-miR-429質(zhì)粒（shRNA質(zhì)粒載體）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞，real-time PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率后，應(yīng)用CCK-8檢測增殖能力的變化；使用Transwell小室法檢測人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化；應(yīng)用real-time PCR和Western blot檢測E盒結(jié)合鋅指蛋白1（ZEB1）mRNA和蛋白表達(dá)含量變化；將ZEB1分別轉(zhuǎn)染至U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞或miR-429過表達(dá)的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞，應(yīng)用Transwell小室檢測miRNA-429和ZEB1分別過表達(dá)或二者雙過表達(dá)對人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響。結(jié)果與對照組比較，miR-429過表達(dá)顯著抑制了人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力；顯著降低了ZEB1在人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的mRNA和蛋白表達(dá)水平；ZEB1過表達(dá)顯著增強(qiáng)了人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力；并且ZEB1過表達(dá)有效阻斷了miR-429抑制U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。結(jié)論miR-429能夠通過抑制ZEB1降低人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力。

miR-429；E盒結(jié)合鋅指蛋白1；人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞；增殖；遷移；侵襲

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）起源于神經(jīng)外胚層，大約占成人顱內(nèi)腫瘤的1/4，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的高度惡性腫瘤。即使采用手術(shù)聯(lián)合放化療等積極的治療，GBM的中位生存期也僅為12～15個月［1］，預(yù)后不良。因此，深入研究GBM發(fā)生發(fā)展機(jī)制，能夠?yàn)镚BM的診斷和治療提供重要依據(jù)［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是由21～25個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子?？梢栽谵D(zhuǎn)錄后水平通過降解或抑制靶mRNA翻譯過程而發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用，其影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程對人體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要的調(diào)節(jié)作用［3］。MiR-429是miR-200家族中的一員，在乳腺癌、卵巢癌等腫瘤中相對于正常組織低表達(dá)，作為腫瘤抑制性miRNA發(fā)揮作用，能夠抑制腫瘤的發(fā)生［4～6］。

E盒結(jié)合鋅指蛋白1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，位于人類10號染色體短臂，包含2個鋅指結(jié)構(gòu)簇和1個同源結(jié)構(gòu)域［7］。近來有研究表明，ZEB1在肺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌，包括膠質(zhì)瘤中呈高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用［8～11］。包括miR-429在內(nèi)的miR-200家族與ZEB1形成負(fù)反饋平衡系統(tǒng)，ZEB1與miR-200家族成員之間在上皮以及間質(zhì)相互轉(zhuǎn)化以及彼此基因的表達(dá)水平方面相互負(fù)性調(diào)控。ZEB1對miR-200家族的調(diào)控是轉(zhuǎn)錄抑制；miR-200家族對ZEB1的作用為轉(zhuǎn)錄后抑制［12～14］。本研究旨在探討miR-429對U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用以及相關(guān)機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DMEM（高糖）細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；人pre-miR-429和antimiR-429的shRNA質(zhì)粒載體（上海吉瑪制藥有限公司）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?LTX（美國Invitrogen公司）；G418（美國Sigma-Aldrich公司）；Cell Counting Kit-8（日本同仁化學(xué)研究所）；Transwell小室（美國Corning公司）；Matrigel基底膜（美國BD公司）；Trizol（美國life公司）；miR-429以及U6引物（美國Applied Biosystems公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；正置顯微鏡（日本Olympus公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Forma Scientific公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Real-time PCR儀（（美國ABI公司）；ZEB1過表達(dá)質(zhì)粒（美國origene公司）；TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit（美國life公司）；TaqMan?Universal PCR Master Mix II，with UNG（美國life公司）；一步法熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；miR-429、ZEB1引物序列（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；兔抗ZEB1抗體、鼠抗GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠及羊抗兔二抗（美國SANTA CRUZ公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞株由中國醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室保存。用DMEM高糖培養(yǎng)基加10%胎牛血清培養(yǎng)U87細(xì)胞，置37℃、5%CO2培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

在24孔板中，每孔接種4×104個U87細(xì)胞，培養(yǎng)基不加抗生素。待細(xì)胞生長至80%融合度時，按照Lipofectamine?LTX說明書，分別給予pre-miR-429以及anti-miR-429質(zhì)粒以及空質(zhì)粒對照，并且每孔0.5 μL Plus Reagents以及1.7μL LTX。使用0.4 mg/mL G418篩選細(xì)胞。4周后，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系：pre-miR-429、pre-miR-429-NC、anti-miR-429和antimiR-429-NC。按照上述程序，針對pre-miR-429-NC以及pre-miR-429細(xì)胞系，將ZEB1穩(wěn)轉(zhuǎn)其中。篩選出以下穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系：pre-NC+ZEB1（+）、pre-NC+ ZEB1-NC、pre-miR-429+ZEB1（+）和pre-miR-429+ ZEB1-NC。

1.4 細(xì)胞活力測定

細(xì)胞活力采用CCK-8方法檢測。制備U87細(xì)胞懸液，以每孔100 μL含1×104細(xì)胞數(shù)接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，各組終止反應(yīng)棄去培養(yǎng)液，加入10 μL的CCK-8溶液，孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔光吸收值。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR

1.5.1 miR-429檢測：用Trizol提取細(xì)胞的總RNA，使用分光光度儀計量RNA水平；應(yīng)用Invitrogen公司的Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit，Taqman Universal Master MixⅡ試劑盒，以U6為內(nèi)參基因，檢測miR-429。采用比較Ct值法（2-ΔΔCt法）對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析。

1.5.2 ZEB1檢測：用Trizol提取細(xì)胞的總RNA，使用分光光度儀計量RNA水平；一步法熒光定量PCR試劑盒，以GAPDH為內(nèi)參基因，檢測ZEB1。采用比較Ct值法（2-ΔΔCt法）對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析。

1.6 體外遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

在孔徑為8 μm的Transwell小室的上室底膜表面鋪40 μL稀釋的Matrigel膠（1∶3），37℃孵育30 min。用無血清DMEM培養(yǎng)液將各組細(xì)胞的濃度調(diào)整為2×105/mL，在上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h；棄去上室培養(yǎng)液，無水甲醇固定30 min，濕棉簽擦去上室未過膜細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色20 min；在倒置顯微鏡下計數(shù)上室底膜上、下、左、右、中5個視野的細(xì)胞總數(shù)（×200）。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)除上室底膜未用Matrigel膠包被外，其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.7 蛋白免疫印跡

檢測miR-429過表達(dá)組和沉默組中ZEB1的蛋白表達(dá)。用RIPA裂解液分別提取各組總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，然后應(yīng)用SDS-PAGE進(jìn)行電泳，后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，在含有5%脫脂奶粉TTBS溶液中常溫封閉2 h，然后分別加入兔抗ZEB1抗體（1∶1 000稀釋）和鼠抗GAPDH抗體（1∶5 000稀釋），4℃孵育過夜。TTBS洗滌，經(jīng)相應(yīng)二抗（1∶5 000稀釋），室溫孵育2 h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測免疫復(fù)合物的表達(dá)。采用Chemi Imager 5500 V2.03軟件對蛋白條帶進(jìn)行掃描，用Fluor Chen 2.0計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計算各條帶整合光密度值（integrated density values，IDV）。結(jié)果以ZEB1/GAPDH的IDV比值表示。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-429相關(guān)表達(dá)變化

在雙向穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-429后，應(yīng)用real-time PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。與對照組相比，pre-miR-429-NC組和anti-miR-429-NC組中miR-429的mRNA表達(dá)水平無明顯變化（0.92±0.12 vs 1.00±0.13，P＞0.05；1.17±0.14 vs 1.00±0.13，P＞0.05）；與pre-miR-429-NC組相比，pre-miR-429組中miR-429的mRNA表達(dá)水平增加5.9倍（5.90±0.56 vs 0.92±0.12，P＜0.01）；與anti-miR-429-NC組相比，anti-miR-429組中miR-429的表達(dá)（0.23±0.05）水平降低4.3倍（P＜0.01）。

2.2 miR-429對U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

與對照組相比，pre-miR-429-NC和anti-miR-429-NC組U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力無明顯變化（1.12±0.10 vs 1.00±0.09，P＞0.05；0.93±0.12 vs 1.00± 0.09，P＞0.05）；與pre-miR-429-NC組相比，miR-429過表達(dá)后，U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力明顯下降（0.58±0.07 vs 1.12±0.10，P＜0.01）；與anti-miR-429-NC組相比，miR-429沉默后，U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)（1.67±0.13 vs 0.93±0.12，P＜0.01）。

2.3 miR-429對U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響（圖1）

圖1 穩(wěn)轉(zhuǎn)miR-429過表達(dá)以及沉默質(zhì)粒后細(xì)胞遷移以及侵襲的變化Fig.1 Changes in cell migration and invasion of U87 after stable transfection with pre-miR-429 and anti-miR-429 plasmids

與對照組相比，pre-miR-429-NC和anti-miR-429-NC組U87細(xì)胞穿過人工基底膜Matrigel膠和微孔膜的數(shù)目無明顯變化；與pre-miR-429-NC組相比，miR-429過表達(dá)后，U87細(xì)胞穿過人工基底膜Matrigel膠和微孔膜的數(shù)目顯著降低；與anti-miR-429-NC組相比，miR-429沉默后，U87細(xì)胞穿過人工基底膜Matrigel膠和微孔膜的數(shù)目顯著增多；以上結(jié)果表明miR-429能夠顯著抑制U87細(xì)胞的侵襲能力。此外，miR -429對U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響與侵襲能力相一致，能夠抑制U87細(xì)胞的遷移能力。

2.4 miR-429對ZEB1mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，pre-miR-429-NC和anti-miR-429 -NC組U87膠質(zhì)細(xì)胞中ZEB1的mRNA表達(dá)水平無明顯變化；與pre-miR-429-NC組相比，miR-429過表達(dá)后，U87細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平顯著降低；與anti-miR-429-NC組相比，miR-429沉默后，U87細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平顯著顯著增多；以上結(jié)果表明miR-429能夠顯著抑制U87細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平；此外，miR-429對U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ZEB1蛋白表達(dá)水平的調(diào)控與mRNA的表達(dá)水平變化相一致，上述結(jié)果表明miR-429能夠在mRNA和蛋白水平上抑制ZEB1的表達(dá)（圖2）。

圖2 雙向轉(zhuǎn)染miR-429后ZEB1的mRNA及蛋白水平Fig.2 The expression levels of mRNA and protein of ZEB1 after two-way transfection with miR-429

2.5 miR-429和ZEB1分別過表達(dá)以及二者雙過表達(dá)后的U87細(xì)胞活力改變

與對照組相比，pre-NC+ZEB（+）-NC組U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力無明顯變化（0.95±0.10 vs 1.00± 0.08，P＞0.05）；與pre-NC+ZEB（+）-NC組相比，miR-429過表達(dá)后，U87細(xì)胞的增殖能力明顯下降（0.52± 0.04 vs 0.95±0.10，P＜0.01）；ZEB1過表達(dá)后，U87細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)（1.95±0.17 vs 0.95±0.10，P＜0.01）；二者雙過表達(dá)后U87細(xì)胞的增殖能力無明顯改變（1.13±0.09 vs 0.95±0.10，P＞0.05）。

2.6 miR-429和ZEB1分別過表達(dá)以及二者雙過表達(dá)后的U87細(xì)胞遷移和侵襲能力改變

與對照組相比，pre-NC+ZEB（+）-NC組U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞穿過人工基底膜Matrigel膠和微孔膜的數(shù)目無明顯變化；與pre-NC+ZEB（+）-NC組相比，miR-429過表達(dá)能夠引起U87細(xì)胞穿過人工基底膜Matrigel膠和微孔膜的數(shù)目明顯下降；ZEB1過表達(dá)導(dǎo)致U87細(xì)胞穿過人工基底膜Matrigel膠和微孔膜的數(shù)目明顯增強(qiáng)；二者雙過表達(dá)后，U87細(xì)胞穿過人工基底膜Matrigel膠和微孔膜的數(shù)目無明顯改變（圖3）。此外，分別過表達(dá)miR-429和ZEB，以及二者雙過表達(dá)對U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響與侵襲能力相一致（圖3）。

3 討論

MicroRNA（miRNA）與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）完全或者不完全互補(bǔ)配對從而發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)的作用，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控［3］。miR-200家族（miR-200b/c/429，miR-200a/141）通過對細(xì)胞周期、分化、凋亡等的調(diào)控作用，參與到腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中。研究發(fā)現(xiàn)，miR-200家族作為發(fā)揮抑制腫瘤作用相對多見［5］。miR-200家族（包括miR-429）在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中是潛在的抑癌基因［12，15］。探討miR-429對腫瘤的影響及機(jī)制，可能為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療及相關(guān)研究提供新的策略。

圖3 分別過表達(dá)miR-429和ZEB，以及二者雙過表達(dá)后U87細(xì)胞的遷移和侵襲能力變化Fig.3 Changes in cell migration and invasion abilities after transfection with single overexpressed and co-expressed miR-429 and ZEB1

ZEB1是一種E盒結(jié)合鋅指蛋白，和其輔助因子共同結(jié)合在上皮性鈣黏蛋白（E-cadherin）啟動子的E盒上，抑制基因轉(zhuǎn)錄和E-cadherin的表達(dá)。所以，作為E-cadherin的重要阻遏蛋白，是研究腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）分子調(diào)控機(jī)制網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵樞紐［16］。而且ZEB1也是胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，ZEB1的末端都有鋅指簇，可識別并結(jié)合CDH1的E-box（CACCTG）序列，抑制CDH1的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控EMT進(jìn)程，控制腫瘤的惡性生物學(xué)行為［17］。miRNA-200是最早被發(fā)現(xiàn)參與EMT調(diào)控的miRNA，miR-200a和miR-200b可通過抑制ZEB1的轉(zhuǎn)錄，阻止細(xì)胞的EMT［18］。在上皮性卵巢癌中，miR-429通過控制ZEB1、ZEB2進(jìn)而調(diào)節(jié)其EMT以及遷移的生物學(xué)行為［12］。

miR-429抑制直結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并且通過靶向Onecut2調(diào)控EMT相關(guān)基因［19］；miR-429調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)皮改變，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性［20］；miR-429通過與ZEB1的相互作用發(fā)揮對骨肉瘤細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用［21］。miR-429在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用，并且其生物學(xué)行為和EMT相關(guān)［19～21］。有報道稱，miR-200a以及miR-200b對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長起抑制作用［22，23］。miR-429與miR-200a、miR-200b同屬miR-200家族，但其是否在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮明顯生物學(xué)作用尚無相關(guān)報道。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-429過表達(dá)后可以顯著抑制U87細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力；沉默時作用相反。提示miR-429在膠質(zhì)瘤中作為抑癌基因發(fā)揮作用。應(yīng)用多種生物預(yù)測軟件，包括TargetScan，microRNA.org，miRDB和PITA均能預(yù)測到miR-429和ZEB1有結(jié)合，而ZEB1在EMT中起重要作用［6，24］，我們進(jìn)一步檢測pre-miR-429以及anti-miR-429處理后U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ZEB1的mRNA以及蛋白表達(dá)水平變化，證實(shí)了miR-429負(fù)性調(diào)控ZEB1的表達(dá)。但miR-429是否通過ZEB1發(fā)揮腫瘤抑制作用，尚不清楚。為此，我們進(jìn)一步檢測了miR-429和ZEB1的分別過表達(dá)，以及二者雙過表達(dá)后對U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)ZEB1可以有效阻斷miR-429對U87細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，miR-429能夠顯著降低人U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機(jī)制可能與miR-429抑制ZEB1的表達(dá)有關(guān)。

［1］Ahmed R，Oborski MJ，Hwang M，et al.Malignant gliomas：current perspectives in diagnosis，treatment，and early response assessment using advanced quantitative imaging methods［J］.Cancer Manag Res，2014，6：149-170.

［2］劉麗波，薛一雪，王萍.緩激肽對腦膠質(zhì)瘤大鼠occludin和ZO1mRNA的調(diào)節(jié)和機(jī)制［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，39（7）：497-500.

［3］Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116（2）：281-297.

［4］Ye ZB，Ma G，Zhao YH，et al.miR-429 inhibits migration and invasion of breast cancer cells in vitro［J］.Inter J Oncol，2015，46（2）：531-538.

［5］Ouyang Y，Gao P，Zhu B，et al.Downregulation of microRNA-429 inhibits cell proliferation by targeting p27Kip1 in human prostate cancer cells［J］.Mol Med Rep，2015，11（2）：1435-1441.

［6］Chen J，Wang L，Matyunina LV，et al.Overexpression of miR-429 induces mesenchymal-to-epithelial transition（MET）in metastatic ovarian cancer cells［J］.Gynecol Oncol，2011，121（1）：200-205.

［7］Funahashi J，Sekido R，Murai K，et al.Delta-crystallin enhancer binding protein delta EF1 is a zinc finger-homeodomain protein implicated in postgastrulation embryogenesis［J］.Development（Cambridge，England），1993，119（2）：433-446.

［8］Huang MT，Wei PL，Liu JJ，et al.Knockdown of thrombomodulin enhances HCC cell migration through increase of ZEB1 and decrease of E-cadherin gene expression［J］.Ann Surg Oncol，2010，17（12）：3379-3385.

［9］Singh M，Spoelstra NS，Jean A，et al.ZEB1 expression in type I vs type II endometrial cancers：a marker of aggressive disease［J］.Modern Pathol，2008，21（7）：912-923.

［10］Siebzehnrubl FA，Silver DJ，Tugertimur B，et al.The ZEB1 pathway links glioblastoma initiation，invasion and chemoresistance［J］.EMBO Mol Med，2013，5（8）：1196-1212.

［11］Chen L，Zhang K，Shi Z，et al.A lentivirus-mediated miR-23b sponge diminishes the malignant phenotype of glioma cells in vitro and in vivo［J］.Oncol Rep，2014，31（4）：1573-1580.

［12］Park SM，Gaur AB，Lengyel E，et al.The miR-200 family determines the epithelial phenotype of cancer cells by targeting the E-cadherin repressors ZEB1 and ZEB2［J］.Genes Dev，2008，22（7）：894-907.

［13］Korpal M，Kang Y.The emerging role of miR-200 family of microRNAs in epithelial-mesenchymal transition and cancer metastasis［J］.RNA Biol，2008，5（3）：115-119.

［14］Brabletz S，Brabletz T.The ZEB/miR-200 feedback loop--a motor of cellular plasticity in development and cancer?［J］.EMBO Rep，2010，11（9）：670-677.

［15］Du Y，Xu Y，Ding L，et al.Down-regulation of miR-141 in gastric cancer and its involvement in cell growth［J］.J Gastroenterol，2009，44（6）：556-561.

［16］Zheng H，Kang Y.Multilayer control of the EMT master regulators［J］.Oncogene，2014，33（14）：1755-1763.

［17］Sanchez-Tillo E，Lazaro A，Torrent R，et al.ZEB1 represses E-cadherin and induces an EMT by recruiting the SWI/SNF chromatinremodeling protein BRG1［J］.Oncogene，2010，29（24）：3490-3500.

［18］Gregory PA，Bert AG，Paterson EL，et al.The miR-200 family and miR-205 regulate epithelial to mesenchymal transition by targeting ZEB1 and SIP1［J］.Nature Cell Biol，2008，10（5）：593-601.

［19］Sun Y，Shen S，Liu X，et al.MiR-429 inhibits cells growth and invasion and regulates EMT-related marker genes by targeting Onecut2 in colorectal carcinoma［J］.Mol Cell Biochem，2014，390（1-2）：19-30.

［20］Wang L，Mezencev R，Svajdler M，et al.Ectopic over-expression of miR-429 induces mesenchymal-to-epithelial transition（MET）and increased drug sensitivity in metastasizing ovarian cancer cells［J］. Gynecol Oncol，2014，134（1）：96-103.

［21］Liu X，Liu Y，Wu S，et al.Tumor-suppressing effects of miR-429 on human osteosarcoma［J］.Cell Biochem Biophy，2014，70（1）：215-224.

［22］劉峰，王占祥，劉才權(quán)，等.miR-200a通過靶向NCAM1基因影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移及侵襲［J］.腫瘤，2013，33（5）：398-403.

［23］趙文健，楊亮，何漢江.miR-200b通過靶向CD133抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長［J］.腫瘤，2014，34（3）：231-237.

［24］Hurt EM，Saykally JN，Anose BM，et al.Expression of the ZEB1（deltaEF1）transcription factor in human：additional insights［J］. Mol Cell Biochem，2008，318（1-2）：89-99.

（編輯 武玉欣）

The Effectand Mechanism ofmiR-429 Regulating Proliferation，Migration and Invasion of Human U87 Glioma Cells

CHENLiang-yu1，LIULi-bo2，LIXin-xing1，YUBo1，HONGYang1，ZHENG Jian1，YUQi1，XUE Yi-xue2，LIUYun-hui1
（1.DepartmentofNeurosurgery，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China；2.DepartmentofNeurobiology，College ofBasic MedicalScience，China MedicalUniversity，Shenyang 110122，China）

Objective To study the effects ofmiR-429 on proliferation，migration and invasion ofhuman glioma U87 cellsand the potentialmechanism.MethodsAfter human U87 glioma cells were cultured，Lipofectamine?LTX was applied to stably transfect U87 glioma cells with pre-miR-429 and anti-miR-429 plasmids（shRNA plasmid vector）.After verification of the efficiency of transfection by real-time PCR，CCK-8 was applied to detect the change in proliferation of U87 cells.The Transwell chamber assay was applied to measure the change in migration and invasion of human U87 glioma cells，the real-time PCR and the Western blotassay were applied to measure the change in mRNA and protein levelsofzinc finger E-box binding homeobox 1（ZEB1）.NormalU87 cells and miR-429-overexpressing U87 cells were transfected with ZEB1，and the Transwellchamber assay was applied to detect the effect of single overexpressed or co-overexpressed miR-429 and ZEB1 on proliferation，migration and invasion of human U87 glioma cells.ResultsCompared with the control group，overexpression of miR-429 significantly inhibited the proliferation，migration and invasion ability of U87 cells and obviously reduced the expression level of mRNA and protein of ZEB1 in human U87 glioma cells.Overexpression of ZEB1 dramatically improved the proliferation，migration and invasion of human U87 glioma cells，furthermore，effectively blocked the function of miR-429 overexpression inhibiting proliferation，migration and invasion.ConclusionMiR-429 reduces proliferation，migration and invasion ofU87 glioma cells by inhibiting ZEB1.

miR-429；zinc finger E-box binding homeobox 1；human U87 glioma cells；proliferation；migration；invasion

R-338.2；R341.6

A

0258-4646（2015）09-0769-06

國家自然科學(xué)基金（81402573，81372484，81372682，81272564，81172197，81171131）

陳亮宇（1980-），男，講師，碩士.

劉云會，E-mail：liuyh@sj-hospital.org

2014-12-26

網(wǎng)絡(luò)出版時間：