樊秀敏

(遼寧省朝陽(yáng)市建平縣畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所,遼寧建平 122400)

用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)豬尿中的沙丁胺醇

樊秀敏

(遼寧省朝陽(yáng)市建平縣畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所,遼寧建平 122400)

沙丁胺醇俗稱瘦肉精，人食用含有瘦肉精殘留的動(dòng)物性食品，會(huì)出現(xiàn)肌肉震顫、心悸、過(guò)敏、頭痛、惡心、嘔吐、發(fā)燒等癥狀，中國(guó)已明令禁止其用于食品動(dòng)物。沙丁胺醇酶聯(lián)免疫試劑盒具有方便、快速、靈敏等特點(diǎn)，適用于大批量樣品篩查。

酶聯(lián)免疫吸附法 檢測(cè) 沙丁胺醇

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平的不斷提高及生活質(zhì)量的不斷改善，人們的膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，動(dòng)物性食品所占的比例在不斷增加。為了滿足人們對(duì)動(dòng)物性食品需求的增長(zhǎng)，大量的獸藥被應(yīng)用于現(xiàn)代畜禽生產(chǎn)的許多環(huán)節(jié)，造成動(dòng)物性食品中獸藥殘留，使人民的身體健康和生命安全受到影響，2006年發(fā)生的“蘇丹紅”紅心鴨蛋事件、“瘦肉精”中毒事件都是這個(gè)問(wèn)題的有力證明。

瘦肉精是一類動(dòng)物用藥，有數(shù)種藥物被稱為瘦肉精，例如沙丁胺醇、萊克多巴胺及克倫特羅等。將瘦肉精添加于飼料中，可以提高胴體瘦肉率，降低生產(chǎn)成本。人食用含有瘦肉精殘留的動(dòng)物性食品，會(huì)出現(xiàn)肌肉震顫、心悸、過(guò)敏、頭痛、惡心、嘔吐、發(fā)燒等癥狀，中國(guó)已明令禁止其用于食品動(dòng)物。

檢測(cè)瘦肉精的常用方法有：高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)機(jī)法和酶聯(lián)免疫吸附法，目前酶聯(lián)免疫吸附法是最常用最適合的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備

1.1 準(zhǔn)備樣品

隨機(jī)抽取代表性樣品（豬尿）41個(gè)，每個(gè)樣品抽取約100ml，平均分成3份，每份約30m l，分裝于樣品瓶中密封，用記號(hào)筆寫(xiě)上相應(yīng)順序編號(hào)。其中兩份由抽樣人員帶回用于檢驗(yàn)和留樣用，另一份封存于被抽檢單位，作為對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)復(fù)檢用。檢測(cè)前豬尿如果混濁可離心5min。

1.2 試劑盒

沙丁胺醇酶聯(lián)免疫試劑盒（96孔）。北京維德維康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 設(shè)備和實(shí)驗(yàn)耗材

冰箱、離心機(jī)（4000g）、百得單、雙道移液槍、計(jì)時(shí)器、洗板機(jī)、酶標(biāo)儀（檢測(cè)波長(zhǎng)450nm，參考波長(zhǎng)630 nm）、打印機(jī)、電腦、離心管、離心管架、槍頭盒、槍頭、加樣槽、去離子水、吸水紙、記號(hào)筆。

1.4 試劑盒回溫

從冰箱冷藏區(qū)取出試劑盒，將盒內(nèi)各組分放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上恢復(fù)至室溫23℃～27℃。

1.5 添加陽(yáng)性對(duì)照

用移液槍取8.1ppb濃度的標(biāo)準(zhǔn)品工作液100μl，豬尿305μl（陰性對(duì)照品），將二者放在離心管中混勻用記號(hào)筆作標(biāo)記后，放在離心管架上，使之成為2ppb濃度的陽(yáng)性對(duì)照品，用于計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照回收率。

2 檢測(cè)步驟及注意事項(xiàng)

（1）取出酶標(biāo)板條固定在酶標(biāo)板架上，做雙孔平行，記錄標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置。檢測(cè)樣品數(shù)量較少時(shí)，將剩余的板條立即用自封袋密封后放置于冰箱冷藏區(qū)。整塊板條最好一次用完，剩余板條有時(shí)因各種原因準(zhǔn)確度降低。

（2）在標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi)依次加入標(biāo)準(zhǔn)品工作液（0、0.1、0.3、 0.9、2.7、8.1ppb）20μl，在樣品孔內(nèi)依次加入陽(yáng)性對(duì)照品20μl，陰性對(duì)照品20μl，其他待測(cè)樣品（豬尿）20μl。每次加完兩個(gè)平行孔后都要更換槍頭，防止交叉污染。

（3）每孔加入80μl抗體-酶標(biāo)Ⅱ抗混合工作液（1份沙丁胺醇酶標(biāo)Ⅱ抗?jié)饪s液與10份沙丁胺醇抗體工作液充分混勻，配制后要立即使用！），加混合工作液時(shí)，不要讓槍頭沾染孔底的液體。

（4）用蓋板膜蓋好酶標(biāo)板，輕輕用指尖磕碰酶標(biāo)板四周10s，充分混勻，室溫（23℃～27℃）下避光反應(yīng)30min。

（5）配制洗滌工作液，1份濃縮洗滌液加19份去離子水。

（6）把酶標(biāo)板上的蓋板膜揭開(kāi)，倒掉孔中的液體，在每孔中加入260μl洗滌工作液，浸泡15～30s后倒孔中洗液，再重復(fù)清洗3次。（這一步也可用洗板機(jī)清洗酶標(biāo)板）

（7）最后一次清洗后，倒掉孔中洗液，將酶標(biāo)板倒放在吸水紙上，抓緊酶標(biāo)板四周輕輕在吸水紙上拍打至拍干。（如果此時(shí)孔底有氣泡，可用干凈的槍頭將氣泡戳破，戳不同孔底的氣泡應(yīng)更換槍頭）

（8）拍干酶標(biāo)板后，立即在每孔中加入100μl底物A、B混合液（按1：1比例混合在加樣槽中，混合液在5min內(nèi)使用，不能使用金屬盛裝、攪拌試劑?。?。

（9）用蓋板膜蓋好酶標(biāo)板，輕輕用指尖磕碰酶標(biāo)板四周10s，充分混勻，室溫（23℃～27℃）下避光反應(yīng)15～20min。

（10）把酶標(biāo)板上的蓋板膜揭開(kāi)，每孔中加入50μl終止液，輕輕用手指尖磕碰酶標(biāo)板四周10s，充分混勻。

（11）終止后5min內(nèi)，將酶標(biāo)板放在酶標(biāo)儀的載板架上，用酶標(biāo)儀在雙波長(zhǎng)450nm、630 nm下讀取酶標(biāo)板吸光度值，并將數(shù)值打印出來(lái)。

3 計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照回收率

利用電腦r-biopharm數(shù)據(jù)分析軟件，把測(cè)得的數(shù)值按一定順序和要求手工錄入，軟件自動(dòng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出所有檢測(cè)樣品中沙丁胺醇的含量。

回收率（%）=（實(shí)測(cè)陽(yáng)性對(duì)照濃度—實(shí)測(cè)陰性對(duì)照濃度）÷添加濃度（2ppb）×100%

用此試劑盒按上述方法回收率范圍為75%～105%，如果回收率達(dá)不到此要求，應(yīng)該從各個(gè)環(huán)節(jié)入手，細(xì)心查找疏漏，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 討論

4.1 試劑盒的貯存

試劑盒貯存于2℃～8℃環(huán)境中，抗體和酶標(biāo)Ⅱ抗在常溫下容易變性。

4.2 加樣

加樣時(shí)應(yīng)用移液槍把液體物質(zhì)加在酶標(biāo)板孔的底部，可用左手輕輕扶住移液槍的中部，避免將液體加在孔壁上部，并防止液體濺出及氣泡產(chǎn)生。加抗體-酶標(biāo)Ⅱ抗混合工作液、底物A、B混合液和終止液時(shí)，可將試劑倒在加樣槽中，用定量多道移液槍加樣，提高速度，節(jié)省操作時(shí)間，減少實(shí)驗(yàn)誤差。

4.3 保溫

實(shí)驗(yàn)中的保溫避光反應(yīng)步驟，是抗原抗體反應(yīng)的完成過(guò)程，需要有一定的時(shí)間和溫度。因?yàn)榭乖c抗體結(jié)合的機(jī)會(huì)不均等，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸，這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程。

4.4 洗板

洗板在這個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中是很關(guān)鍵的一步。酶聯(lián)免疫吸附法就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的，通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)結(jié)合的物質(zhì)。如果洗滌次數(shù)不夠、注入的洗滌液量不足或洗板間隔太久都會(huì)直接影響檢測(cè)的最終結(jié)果，嚴(yán)重者使實(shí)驗(yàn)失敗。

樊秀敏（1977-），畢業(yè)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，于1998年至現(xiàn)在一直在建平縣畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所工作。