趙曉莉，錢新宏，潘凱麗，李迎俠，王英娟

(1.陜西省第四人民醫(yī)院兒科，陜西 西安 710043；2.第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院兒科，陜西 西安 710032)

Notch1蛋白在兒童急性白血病中的表達及意義

趙曉莉1，錢新宏2，潘凱麗2，李迎俠2，王英娟2

(1.陜西省第四人民醫(yī)院兒科，陜西 西安 710043；2.第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院兒科，陜西 西安 710032)

目的 探討兒童急性白血病(AL)骨髓細胞中Notch1蛋白表達及其與免疫分型的關系。方法 收集2009年10月至2011年11月初診的42例AL患兒和22例正?；蚍菒盒匝翰和?對照組)骨髓涂片，采用免疫組織化學方法檢測骨髓中Notch1蛋白表達情況。結果 42例AL患兒中，急性淋巴細胞白血病(ALL)32例，其急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)25例，急性T淋巴細胞白血病(T-ALL)7例；急性髓細胞白血病(AML)10例。Notch1蛋白在兒童急性白血病中的表達情況，AML組表達率為60.0%(6/10)，T-ALL組為71.4%(5/7)，B-ALL組為28.0%(7/25)，對照組為13.6%(3/22)。與對照組相比，AML組和T-ALL組Notch1蛋白表達率均明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為7.311、8.878，均P<0.05)；B-ALL組Notch1蛋白表達率亦高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。T-ALL患兒和B-ALL組比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.400，P<0.05)。Notch1蛋白陽性細胞表達率按照ALL-LR、ALL-MR、ALL-HR依次升高，HR組高于LR組及MR組，但組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 Notch1蛋白在不同類型的兒童AL中表達有明顯差異，T-ALL發(fā)病與異常的Notchl信號有關。Notch1信號可能在AL中起著重要作用，但需要進一步收集資料論證。

急性白血?。籒otch1蛋白；免疫細胞化學；兒童

急性白血病(acute leukemia，AL)是兒童時期最常見的惡性腫瘤，起源于造血系統(tǒng)的惡性增生，是兒童的主要死亡原因之一。近年來，兒童急性白血病患兒數(shù)呈顯著提高，雖然經(jīng)合理的規(guī)范化化療，目前急性淋巴細胞白血病(ALL)的治愈率已達到80%左右[1]，但仍然有很多患兒對化療反應不佳。研究顯示，急性T淋巴細胞白血病(T-ALL)的發(fā)生與Notch1蛋白(Notch1)密切相關[2]。目前對Notch1在乳腺癌、食管癌等實體瘤及成人各型白血病特別是T-ALL中的作用研究較多，Notch1在兒童AL中的報道甚少。成人作為成熟期的個體，各種類型白血病的研究結果是否與處于生長發(fā)育期的兒童相一致？因此采用免疫細胞化學技術檢測AL患兒骨髓液中的Notch1蛋白表達，期待能對兒童白血病的靶向治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

實驗組(42例)為西京醫(yī)院兒科2009年10月至2011年11月收治的患兒，全部符合2006年參考文獻[2-3]的兒童急性白血病診斷標準。42例初診的AL兒童中，ALL 32例，急性髓細胞白血病(AML)10例。ALL組中，男22例，女10例；LR 10例，MR 14例，HR 8例；T-ALL 7例，急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)25例；年齡2～14歲，中位年齡4歲。AML組中，男6例，女4例；AML-M2 5例，AML-M3 3例，AML-M5 2例；年齡2.6～10歲，中位年齡5歲。42例患兒中有40例接受治療，2例放棄治療。接受治療的患兒均按標準進行系統(tǒng)規(guī)范化治療[3-4]。

對照組為西京醫(yī)院同期收治的22例確診后為非惡性血液病兒童，其中血小板減少性紫癜16例，再生障礙性貧血4例，其他2例。其中男12例，女10例；年齡1～14歲，中位年齡6.5歲。

所有兒童的骨髓樣本采集均征得患兒家長或/和患兒本人同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫分型及融合基因檢測

所有AL患兒在初發(fā)時采集骨髓液1～1.5mL使用流式細胞儀進行免疫分型，根據(jù)白血病細胞表面抗原表達類別分為T-ALL、B-ALL、AML；采集骨髓液3mL進行BCR/ABL融合基因及染色體(9，22)異位的檢測，所有AL患兒BCR/ABL融合基因及染色體(9，22)異位的檢測呈陰性。

1.2.2 試劑

兔抗人Notch1多克隆抗體，購自美國Santa Cruz公司。免疫組化染色試劑盒(HistostainTM-Plus Kits)，濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidin，DAB)試劑盒(ZLI-9032)，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。免疫分型標本來源于AL患兒初診時的骨髓細胞，免疫分型用單克隆抗體購自BD公司。

1.2.3 實驗步驟

質量控制：陰性對照：以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，其余所加試劑及步驟一致。

1.2.3.1標本采集 用干凈的載玻片將實驗組和對照組兒童骨髓液約0.3mL推平在防脫載玻片上，骨髓涂片要厚薄均勻，頭、體、尾分明，室溫下放置40min，自然晾干，每1份標本涂片2張，一張用于滴加Notch1抗體，另一張用于做陰性對照。把骨髓涂片置37℃孵育箱24h，有助于待檢細胞貼壁。用4%多聚甲醛室溫孵育固定30min，常溫下自然干燥后，-20℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.2.3.2 Notch1蛋白檢測 取出-20℃冰箱保存的骨髓涂片，室溫放置15min。用0.2%TritonX-100，透化2～5min。PBS沖洗3次，每次3min(每次沖洗時用滴管輕柔操作，避免備檢細胞脫片)。加1滴3%H2O2去離子水孵育10min(孵育均在濕盒內(nèi))，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。用PBS沖洗3次，每次3min。滴加試劑A(封閉用山羊血清)，室溫孵10min。倒掉或者吸干液體。每張玻片上加1:200稀釋的一抗或者PBS液，4℃冰箱過夜。用PBS沖洗3次，每次3min。每張玻片上滴加試劑B(生物素標記山羊抗兔IgG)，室溫孵育15min。PBS沖洗3次，每次3min。每張玻片上加1滴試劑C(辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，S-A/HRP)，室溫孵育15min。PBS洗滌3次，每次3min。每張玻片上加一滴新鮮配制的DAB顯色液，常溫避光顯色2～15min，在顯微鏡下觀察顯色情況。1×PBS沖洗玻片，終止顯色。蘇木素復染襯染胞核：蘇木素染色液染色5～10min，根據(jù)染色結果調(diào)整時間。PBS沖洗終止顯色，晾干。脫水，透明，中性樹膠封片：95%乙醇脫水2min；換用新鮮95%乙醇再脫水2min；二甲苯透明5min；換用新鮮二甲苯，再透明5min；用中性樹膠封片。顯微鏡下觀察、拍照，計數(shù)Notch1受體蛋白陽性細胞的百分率，具體見統(tǒng)計分析。

1.2.4 結果判斷

顯微鏡下，Notch1蛋白表達陽性細胞，細胞膜/細胞漿/細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色物質，主要定位于細胞漿與細胞膜，陽性細胞散在分布；陰性對照，細胞的細胞漿及細胞核全部呈藍色。每例高倍鏡視野下隨機計數(shù)100個白血病細胞，按照參考文獻的方法稍作改動，從細胞著色強度及陽性細胞占同類細胞總數(shù)的百分比進行綜合評分[5]：細胞無著色計0分，棕黃色計1分，棕褐色計2分；Notch1蛋白陽性細胞數(shù)<5%為0分，Notch1蛋白陽性細胞數(shù)5%～10%為1分， 10～30%為2分，>30%為3分，兩項結果總分>2分為陽性，<2分為陰性。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0中文版統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)用百分率表示，率的比較采用χ2檢驗及Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 急性白血病兒童Notch1蛋白的表達

Notch1蛋白在兒童急性白血病中的表達情況：AML組表達率為60.0%(6/10)，T-ALL組為71.4%(5/7)，B-ALL組為28.0%(7/25)，對照組為13.6%(3/22)，見圖1。AML組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.311，P<0.05)，T-ALL組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.878，P<0.05)，B-ALL與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.481，P>0.05)，ALL組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.700，P>0.05)。T-ALL與B-ALL患兒相比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.400，P<0.05)。Notch1受體蛋白陽性細胞的顯微鏡下顯示見圖2。

圖1 Notch蛋白在AL各組和對照組表達率比

Fig. 1 Notch protein expression rate in AL groups and the control group

B-ALL細胞陽性表達 T-ALL細胞陽性表達

AML細胞陽性表達 對照組

注：圖中箭頭指向為陽性細胞，免疫組化SP法，×400。

圖2 Notch1蛋白在AL兒童與對照組骨髓細胞中的表達

Fig. 2 Notch1 protein expression in bone marrow cells of AL children

and the control group

2.2 Notch1蛋白與急性淋巴細胞白血病臨床危險度分型的關系

32例ALL患兒中，Notch1蛋白陽性細胞表達率按照ALL-LR、ALL-MR、ALL-HR依次升高，HR組高于LR組及MR組，但組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 Notch1蛋白在ALL各型的表達[n(%)]

Table 1 Notch1 protein expressions in each types of ALL [n(%)]

3 討論

3.1 關于Notch基因

Notch基因最早發(fā)現(xiàn)于果蠅，是在進化上高度保守的一個信號傳導系統(tǒng)，其功能部分缺失會在果蠅的翅緣造成切跡，Notch基因調(diào)控著從果蠅到人類幾乎所有組織、器官細胞的增殖、分化與凋亡。人類共有4個Notch受體(Notch1～Notch4)和5種Notch配體(Delta-like1、3、4，Jagged1和Jagged2)。目前國內(nèi)外學者對Notch1基因的研究成果頗多[6-8]。相鄰兩個細胞Notch1受體與配體結合后，Notch1信號通路立即激活，經(jīng)過3步蛋白水解過程，從細胞膜上釋放其胞內(nèi)活性成分ICN1(Notch1)，ICN1最終定位于細胞核內(nèi)，參與轉錄激活復合體的形成，經(jīng)過一系列中間過程最終激活下游靶基因Hes-1等的轉錄，對細胞分化的起始過程進行簡單卻精準的調(diào)控。

3.2 Notch1蛋白在兒童急性白血病中的意義

Notch基因與惡性腫瘤的關系最早在人類T-ALL中被發(fā)現(xiàn)。在T-ALL中，存在Notch信號的普遍活化，Notch基因的高表達，T細胞惡性腫瘤幾乎都有Notch信號通路的活化[9]。近年來的研究結果顯示，ICN1增多和T-ALL的發(fā)生有很大關系，將ICN1植入小鼠體內(nèi)，能100%誘發(fā)小鼠T-ALL[10]。目前Notch信號途徑阻斷劑GSI已用于T-ALL的臨床治療，研究指出，在T-ALL的移植模型上進行持續(xù)GSI治療以后能產(chǎn)生有效的抗白血病反應，而且能獲得較好的耐受[11]。盡管GSI會造成胃腸道毒性，但其能逆轉T-ALL的糖皮質激素抵抗，如果將GSI和糖皮質激素聯(lián)合應用能夠減輕其胃腸道毒性[12]，這也提示，針對Notch信號途徑的治療能為T-ALL的治療提供新的治療思路。Notch1作為治療腫瘤的新靶點，在現(xiàn)代腫瘤研究領域中具有十分重要的臨床意義。本實驗中，采用免疫細胞化學方法對42例兒童急性白血病進行研究，發(fā)現(xiàn)Notch1在兒童不同類型AL中的表達有明顯差異，T-ALL發(fā)病與異常的Notchl信號有關。與正常對照相比，在AML患兒中，Notch1蛋白陽性率增高，差異具有統(tǒng)計學意義，但ALL差異沒有統(tǒng)計學意義，而ALL和AML比較，差異同樣無統(tǒng)計學意義，因此，Notch1信號可能在AL中起著重要作用。前期研究曾經(jīng)應用RT-PCR方法對32例ALL患兒mRNA表達陽性率進行半定量分析，發(fā)現(xiàn)Notch1在T-ALL中明顯高表達，而在B-ALL中表達水平較低[13]，這與本實驗結論相一致。

王冠玲等[5]應用免疫組化的方法對11例AML患兒研究發(fā)現(xiàn)，Notch1受體蛋白陽性表達率較高，表明Notch1在粒系來源的髓性白血病中可能起著重要作用。本研究采用免疫細胞化學方法檢測10例AML兒童骨髓細胞中的Notch1蛋白，得出同樣結論。然而，事實是否真如此，尚需擴大樣本量進一步探討。

Notch信號與B淋巴細胞惡性疾病也關系密切。霍奇金病的惡性B細胞中檢測到Notch1受體的高表達，Notch1受體活化后與配體相結合，信號通路被激活，促進B細胞生長轉化，抑制了亞砷酸引起的細胞凋亡。也有研究指出，Notch高表達可以抑制p53介導的細胞凋亡，若阻斷Notch信號后，p53表達升高并啟動細胞凋亡程序以促使腫瘤消退[14]。本研究結果顯示，與對照組相比，在B-ALL患兒中，Notch1蛋白陽性率雖有增高，但差異并沒有統(tǒng)計學意義，考慮是否與樣本數(shù)較少有關。

另外，本研究對32例ALL患兒Notch1蛋白陽性細胞表達率進行檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率按照ALL-LR、ALL-MR、ALL-HR水平依次升高，盡管組間比較無統(tǒng)計學差異，但是否該檢測與ALL的臨床危險度分型存在關聯(lián)，還需要收集數(shù)據(jù)進一步研究。

在兒童急性白血病中，存在著Notch1信號的活化。其在兒童不同類型急性白血病中的表達有明顯差異，在急性淋巴細胞白血病T-ALL患兒中的Notch1表達高于B-ALL；在兒童急性髓細胞白血病中Notch1也呈異常表達，Notch1在兒童AML的發(fā)病中可能也起著一定的作用。

[1]桂永浩主編.小兒內(nèi)科學高級教程[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2014:328.

[2]Zhu Y M, Zhao W L, Fu J F,etal. Notchl mutations T-cell acute lymphoblastic leukemia:prognostic significance and implication in multifactorial leukemogenesis[J].Clin Cancer Res,2006,12(10):3043-3049．

[3]中華醫(yī)學會兒科學分會血液學組,中華兒科雜志編輯委員會.兒童急性淋巴細胞白血病診療建議(第三次修訂草案)[J].中華兒科雜志,2006,44(5):392-395.

[4]中華醫(yī)學會兒科學分會血液學組,中華兒科雜志編輯委員會.兒童急性髓細胞白血病診療建議[J].中華兒科雜志,2006,44(1):877-878.

[5]王冠玲,胡群,劉雙又,等.急性白血病患兒Notch1蛋白表達及其臨床意義研究[J].中國實用兒科雜志,2010,25(10):783-786.

[6]Kathleen M, Capaccione, Sharon R P. The Notch signaling pathway as a mediator of tumor survival[J].Carcinogenesis,2013,34(7):1420-1430.

[7]Liu W Y, Katherine M. Morgan,etal. Activation of the Notch1 Stem Cell Signaling Pathway during Routine Cell Line Subculture[J].Front Oncol,2014,4:211.

[8]Koyama D, Kikuchi J, Hiraoka N,etal. Proteasome inhibitors exert cytotoxicity and increase chemosensitivity via transcriptional repression of Notch1 in T-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Leukemia,2014,28(6):1216-1226.

[9]Chiaramonte R, Cal Zavara E, Balirdi F,etal. Differential regulation of Notch signal transduction in leukaemia and lymphoma cells in culture[J].Cell Biochem,2003,88(3):569-577.

[10]Ma J，Wu M. The indicative effect of Notch1expression for the prognosis of T-cell acute lymphocytic leukemia: a systematic review[J].Molecular Biology Reports,2012,39(5):6095-6100.

[11]Paganin M, Ferrando A. Molecular pathogenesis and targeted therapies for NOTCH1-induced T-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Blood Rev,2011,25(2):83-90.

[12]Real P J , Ferrando A A. NOTCH inhibition and glucocorticoid therapy in T-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Leukemia,2009,23(8):1374-1377.

[13]趙曉莉,潘凱麗,錢新宏,等.兒童急性白血病Notch1和Jagged1的基因表達[J].中國當代兒科雜志,2012,14(2):105-109.

[14]Wickremasinghe R G, Prentice A G, Steele A J. p53 and Notch signaling in chronic lymphocytic leukemia: clues to identifying novel therapeutic strategies[J].Leukemia,2011,25(9):1400-1407.

[專業(yè)責任編輯：潘凱麗]

Expression of Notch1 protein in children with acute leukemia and its significance

ZHAO Xiao-li1, QIAN Xin-hong2, PAN Kai-li2, LI Ying-xia2, WANG Ying-juan2

(1.DepartmentofPediatrics,FourthPeople’sHospitalofShaanxi,ShaanxiXi’an710043,China;2.DepartmentofPediatrics,XijingHospitalFourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China)

Objective To study the expression of Notch1 protein in children with acute leukemia (AL) and to explore the relationship of Notch1 expression with immunophenotype. Methods The bone marrow smears of 42 cases of AL and 22 healthy children or cases of nonmalignant hematologic disease were collected during October 2009 to November 2011. Immunocytochemical assay was used to detect the expression of Notch1 protein in the cases. Results Of 42 cases of AL, there were 32 cases of acute lymphocytic leukemia (ALL) including 25 cases of B-ALL and 7 cases of T-ALL, and 10 cases of acute myelogenous leukemia (AML). The expression rate of Notch1 protein was 60.0%(6/10), 71.4%(5/7), 28.0%(7/25)and 13.6%(3/22)in AML group, T-ALL group, B-ALL group and the control group, respectively. Compared with the control group, the expression rate of Notch1 protein in AML group and T-ALL group was remarkably increased, and the differences were significant (χ2value was 7.311 and 8.878, respectively, bothP<0.05). The expression rate of Notch1 protein was higher in B-ALL group than in the control group, but the difference was not significant (P>0.05). The difference in the expression of Notch1 protein between T-ALL group and B-ALL group was not significant (χ2=4.400,P<0.05). The expression rate of Notch1 protein positive cells increased gradually in ALL-LR group, ALL-MR group and ALL-HR group, and that was higher in HR group than in LR group and MR group. But the comparison between groups showed no significant difference (P>0.05). Conclusion There are significant differences in the Notch1 protein among children with different types of AL, and abnormal expression of Notch1 is correlated with the occurrence of T-ALL. Notch1 signals might play important role in AL, which needs further researches to confirm.

acute leukemia (AL); Notch1 protein; immunocytochemistry; children

2015-04-26

趙曉莉(1970-)，女，碩士研究生，主要從事兒童血液、消化疾病的診療工作。

潘凱麗，主任醫(yī)師/教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.04.006

R725.5

A

1673-5293(2015)04-0672-04