文│何叢薇 王姣姣 趙春娟 高文惠（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院）

分子印跡技術(shù)在農(nóng)獸藥殘留檢測中的應(yīng)用

文│何叢薇 王姣姣 趙春娟 高文惠（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院）

一、引言

分子印跡技術(shù)（MIT）是指把某一個(gè)特定的目標(biāo)分子作為模板分子，制備對該目標(biāo)分子具有特異選擇性聚合物的過程，通常被定義為制備與識(shí)別“分子鑰匙”的“人工鎖”的技術(shù)。MIT是將要被分離的目標(biāo)分子作為模板分子，通過交聯(lián)劑和引發(fā)劑的作用，在聚合物的單體溶液中聚合得到單體-模板分子復(fù)合物，然后除去模板分子，便得到“印跡”了目標(biāo)分子的空間孔穴的分子印跡聚合物（MIPs），聚合物中就留下了空間大小、形狀及功能基團(tuán)與印跡分子匹配的“記憶”，這樣的空穴對模板分子具有選擇性。MIT起源于20世紀(jì)40年代，直到1993年Vlatakis等在Nature上發(fā)表了有關(guān)茶堿分子印跡聚合物的報(bào)道后，才因?yàn)樗耐ㄓ眯院土Ⅲw專一識(shí)別性的特點(diǎn)，引起了許多科研工作者的興趣。分子印跡聚合物具有選擇性較高、耐受能力強(qiáng)、穩(wěn)定性較好、使用壽命長、應(yīng)用范圍廣等眾多特點(diǎn)，越來越受到人們的青睞。

近年來，分子印跡技術(shù)已廣泛應(yīng)用到環(huán)境保護(hù)、藥物研發(fā)、生物技術(shù)及食品安全等領(lǐng)域，并顯示出廣闊的前景。隨著人們健康意識(shí)的增強(qiáng)，對于食品和飼料中農(nóng)獸藥的殘留問題日益關(guān)注。目前國內(nèi)外對食品和飼料中農(nóng)獸藥殘留限量的要求越來越低，因此我們需要尋找選擇性好、靈敏度高、操作簡單快速、成本低且高效可靠的檢測技術(shù)來適應(yīng)農(nóng)獸藥殘留檢測技術(shù)的發(fā)展，由于分子印跡技術(shù)的特點(diǎn)順應(yīng)了農(nóng)藥獸藥殘留檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢，因此在農(nóng)藥獸藥殘留檢測領(lǐng)域有很廣闊的應(yīng)用前景。

二、分子印跡技術(shù)的應(yīng)用

1.MIT在色譜分離中的應(yīng)用。MIT在色譜分離技術(shù)中的應(yīng)用最重要的是將MIPs用于色譜固定相。其應(yīng)用涉及高效液相色譜（HPLC）、薄層色譜（TLC）、毛細(xì)管電色譜（C E C）和超臨界流體色譜（SFC）。

高效液相色譜具有分離效能高、分析速度快、靈敏度高和分析范圍寬等優(yōu)點(diǎn)而廣泛用于生化、食品分析和藥物分析等領(lǐng)域。李莉等在2007年以磺胺甲噁唑?yàn)槟０宸肿樱迷痪酆戏ㄖ苽淞司哂刑囟ㄗR(shí)別性能的棒狀分子烙印聚合物。將它作為高效液相色譜的固定相實(shí)現(xiàn)了磺胺甲噁唑與其結(jié)構(gòu)類似物的分離?；前芳讎f唑烙印聚合物與目標(biāo)分子間的相互作用除了有特異性的氫鍵作用外，還存在著疏水作用。本試驗(yàn)還考察了含水量和流速對其分離的影響，同時(shí)論證了分子烙印聚合物選擇性專一的作用原理。結(jié)果表明，這種棒狀分子烙印聚合物對模板分子及其類似物有很好的分離能力。

薄層色譜是用于化合物快速分離和微量物質(zhì)半定量分析的一種實(shí)用技術(shù)，具有操作簡單、分析快速和應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)。R.Suedee等利用薄層色譜，制備了偽麻黃堿與去甲麻黃堿的分子印跡聚合物作為手性固定相，并用制備的手性固定相對腎上腺素類藥物（偽麻黃堿，麻黃素，去甲麻黃堿和腎上腺素）的對映體的分辨率進(jìn)行了研究。在分子印跡聚合物的制備中，甲基丙烯酸和衣康酸作為功能單體，甲醇或乙腈作為流動(dòng)相，并且研究了流動(dòng)相中乙酸含量的影響?；谟靡驴邓嶙鳛楣δ軉误w的去甲麻黃堿的分子印跡聚合物，用含有1%乙酸的甲醇流動(dòng)相，去甲麻黃堿的手性分離獲得最好的分辨率。這些MIPs能夠分析對應(yīng)于印跡分子化合物的外消旋體的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，基于這種MIPs的薄層色譜能作為一種分離方法成功分離腎上腺素類藥物的對映體。該方法為光學(xué)活性化合物的質(zhì)量控制提供了一種快速、靈敏和可靠的方法。

2.MIT在固相萃取中的應(yīng)用。固相萃取技術(shù)具有操作簡單、價(jià)格便宜、吸附容量大、易與檢測儀器聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)，而基于分子印跡聚合物作為吸附劑的分子印跡-固相萃取（MISPE）是一種比傳統(tǒng)固相萃取技術(shù)更高效和高特異性的技術(shù)。采用分子印跡聚合物作為固相萃取技術(shù)的填料，其識(shí)別能力可以在識(shí)別目標(biāo)物的同時(shí)，除去大部分干擾，方便儀器分析，因此成為農(nóng)獸藥分析的重要手段。

楊磊以四環(huán)素作為模板分子，丙酮-十二醇-聚乙二醇作為溶劑，α-甲基丙烯酸（MAA）作為功能單體，用乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）和三羥甲基丙烷三丙烯酸酯（TMPTA）作為交聯(lián)劑，最終制備了分子印跡有機(jī)整體柱，并將它作預(yù)柱使用，對奶粉樣品中的四環(huán)素類抗生素進(jìn)行了凈化與富集。在優(yōu)化的在線固相萃取條件下，凈化、富集效果很好，對鹽酸土霉素、四環(huán)素，美他環(huán)素的加標(biāo)回收率均大于84.2%，富集倍數(shù)分別為18.9、19.3、17.8，檢出限分別為9.25、8.48、11.74克/千克，定量限為30.8、28.3、39.1克/千克。該試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了分子印跡有機(jī)整體柱作為預(yù)柱使用來與高效液相色譜聯(lián)用測定奶粉樣品中痕量四環(huán)素類抗生素的殘留。

劉博等建立了分子印跡固相萃取-高效液相色譜法檢測飼料中聯(lián)苯三唑醇。采用本體聚合法自制聯(lián)苯三唑醇分子印跡聚合物，并以此聚合物為固相萃取劑，對飼料樣品中聯(lián)苯三唑醇進(jìn)行了分離富集。利用高效液相色譜法測定其在飼料中的殘留情況。結(jié)果表明：該方法線性范圍為1～200微克/毫升，檢測限為0.5微克/毫升，平均回收率為76.4%～89.0%。

高文惠等利用虛擬模板分子印跡固相萃取技術(shù)對食品中的聯(lián)苯三唑醇與烯唑醇進(jìn)行了分離富集，并建立高效液相色譜檢測方法。以腈菌唑?yàn)槟０宸肿樱０窞楣δ軉误w，EDMA為交聯(lián)劑，乙腈為致孔劑，采用本體聚合法制備得到了腈菌唑分子印跡聚合物，以此聚合物為固相萃取劑，制備固相萃取柱，對食品中聯(lián)苯三唑醇和烯唑醇進(jìn)行分離富集，并采用高效液相色譜法測定其在食品中的殘留。采用C18色譜柱分離，以甲醇-水（體積比為90∶10）溶液為流動(dòng)相，紫外檢測波長為210納米，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，聯(lián)苯三唑醇和烯唑醇的平均回收率分別為89.40%～90.88%和81.37%～83.26%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.08%～2.04%和1.29%～2.52%，檢測限均為0.20微克/克。此聚合物對兩種殺菌劑具有良好的吸附能力，擬模板分子印跡固相萃取技術(shù)可以用于這兩種殺菌劑的分離檢測。

胡靜等建立了分子印跡固相萃取-高效液相色譜法檢測食品中兩種三唑類殺菌劑殘留的方法。分別以三唑醇、烯唑醇為模板分子，MAA為功能單體，EDMA為交聯(lián)劑，采用本體聚合法合成分子印跡聚合物。將制得的三唑醇、烯唑醇聚合物按質(zhì)量比1∶1混合，制成固相萃取柱用于樣品的前處理，并采用高效液相色譜法檢測。結(jié)果：在低和高濃度添加水平下，平均回收率在78.7%～94.3%之間，RSD在1.8%～2.4%之間（n＝5）。結(jié)論：該方法靈敏度高，精密度好，適合于同時(shí)檢測食品中三唑醇和烯唑醇兩種三唑類殺菌劑殘留。

魏艷玲等建立了基于分子印跡固相萃取-高效液相色譜同時(shí)測定雞血漿中環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺的殘留方法，實(shí)現(xiàn)了用離子對反相高效液相色譜紫外同時(shí)分析檢測，環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺在0.10～10.0微克/毫升范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，雞血漿中三聚氰胺和環(huán)丙氨嗪的回收率均高于70%，RSD＜10%，檢出限達(dá)0.05微克/毫升，為血漿等復(fù)雜基質(zhì)中二者的同時(shí)測定提供了一種高選擇性、高效和靈敏的分析方法。

肖琴等將分子印跡固相萃取和高效液相色譜法聯(lián)用，建立了一種檢測魚肉中孔雀石綠和結(jié)晶紫及其代謝產(chǎn)物殘留的新方法。該方法對魚肉樣品的回收率為97.06%～111.83%，RSD為1.54%～10.49%。他建立的新方法簡單快速、準(zhǔn)確可行，而且有機(jī)溶劑用量少，被成功地用于魚肉中孔雀石綠和結(jié)晶紫及其代謝產(chǎn)物殘留的測定。

3.MIT在膜分離中的應(yīng)用。分子印跡膜將膜分離的可連續(xù)化操作與MIPs的高選擇性相結(jié)合，合成的具有分子識(shí)別功能的薄膜將是功能材料研究領(lǐng)域中一個(gè)重要的發(fā)展方向。目前制備的分子印跡膜主要有3種：分子印跡填充膜、分子印跡整體膜和分子印跡復(fù)合膜。

Zhu等在尼龍膜表面將甲基丙烯酸作為功能單體，甲苯作為致孔劑合成了對殺蟲劑久效磷具有選擇性吸附的分子印跡復(fù)合膜，結(jié)果表明該印跡復(fù)合膜對久效磷具有較高的選擇性。L.Donato等采用光聚合法把聚丙烯平板膜作為基膜，S-蔡普生作為模板分子，4-乙烯吡啶作為功能單體，制備了S-萘普生分子印跡復(fù)合膜。試驗(yàn)結(jié)果表明該復(fù)合膜對S-萘普生的選擇性吸附因子為1.6。

王靖宇采用熱聚合方法和原子轉(zhuǎn)移自由基聚合方法以萘普生和茶堿作模板分子和聚偏氟乙烯平板膜或中空纖維膜為基膜，制備了分子印跡膜。聚合后在聚偏氟乙烯基膜表面形成了一層印跡膜。用高效液相色譜系統(tǒng)測試分子印跡膜的分離效果，結(jié)果表明外消旋的萘普生通過分子印跡柱后的色譜圖中出現(xiàn)兩個(gè)峰，分別對應(yīng)于S-萘普生和R-萘普生，該分子印跡體系的分離機(jī)理為促進(jìn)滲透機(jī)理。

Kochkodan等在聚偏氟乙烯膜表面涂敷一層敵草凈印跡聚合物薄層制備了分子印跡復(fù)合膜，將其用于水溶液中敵草凈的選擇性分離。該膜對敵草凈具有很高的特異吸附性，水通量可達(dá)4.59升/（平方米·小時(shí)）。在對影響膜表面修飾度及膜性能的因素研究中發(fā)現(xiàn)，膜的修飾度預(yù)涂敷過程中膜表面引發(fā)劑的濃度和聚合時(shí)間對其有影響，聚合時(shí)間越長，修飾度越高，膜表面沉積層厚度增加，膜孔徑變小，印跡位點(diǎn)增多，表觀吸附量增大。

張春靜等選用多孔的醋酸纖維膜為支撐層，首先將其浸入含奎寧模板分子的氯仿溶液中30分鐘，然后在4℃氮?dú)夥諊杏?60納米紫外燈光下聚合48小時(shí)得到分子印跡膜，該復(fù)合膜保持了醋酸纖維膜良好的通量，奎寧在該膜上結(jié)合量達(dá)到20.6微摩爾/克。試驗(yàn)結(jié)果表明，多孔醋酸纖維膜具有較好的耐有機(jī)溶劑性和耐紫外光照性能，能夠使分子印跡膜獲得較大的滲透量。

4.MIT在傳感器中的應(yīng)用。傳感器是由信號(hào)轉(zhuǎn)換器和識(shí)別元件兩部分構(gòu)成，識(shí)別元件以某種方式位于轉(zhuǎn)換器的表面，當(dāng)所檢測的目標(biāo)分子與識(shí)別元件結(jié)合時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)物理或化學(xué)信號(hào)，這時(shí)轉(zhuǎn)換器就會(huì)將此信號(hào)轉(zhuǎn)換成一個(gè)可定量的輸出信號(hào)，通過監(jiān)測輸出的信號(hào)對目標(biāo)分子進(jìn)行實(shí)時(shí)測定。將分子印跡聚合物作為識(shí)別元件，結(jié)合不同種類轉(zhuǎn)換器而制得的分子印跡傳感器既具有生物傳感器的專一識(shí)別性，又有化學(xué)傳感器的機(jī)械穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性，因而成為傳感器領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)。自1987年Tabushi首次用分子印跡聚合物作為敏感材料，對維生素進(jìn)行檢測之后，人們就對分子印跡聚合物傳感器產(chǎn)生興趣。分子印跡傳感器的應(yīng)用包括光學(xué)傳感器、電化學(xué)傳感器等。

張挪威采用光聚合法在一次性絲網(wǎng)印刷電極上制備琥珀酸氯霉素分子印跡膜，其后將絲網(wǎng)印刷電極通過電極插口與電化學(xué)分析裝置相連接，組裝成檢測琥珀酸氯霉素殘留的電化學(xué)傳感器，利用與傳感裝置相連接的記錄儀記錄響應(yīng)的結(jié)果。本傳感器建立了檢測氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線并測試了實(shí)際牛奶樣品中氯霉素含量的方法。電鏡觀察表明，與非印跡膜相比，在印跡膜表面形成大量直徑約為100納米的印跡微孔。本傳感器裝置檢測琥珀酸氯霉素具有很高的靈敏度和特異性，檢出限為2×10-9摩爾/升，檢測線性范圍為1×10-8～1.2×10-5摩爾/升，基于牛奶樣品的檢測回收率介于93.5%～95.5%之間。

馬永飛制備了一種對莠去津有識(shí)別特性的分子印跡膜，即在含和不含模板分子的情況下，利用循環(huán)伏安技術(shù)在金電極表面沉積2-巰基苯并咪唑，制備了2-巰基苯并咪唑聚合膜。利用循環(huán)伏安法對印跡和非印跡膜行為進(jìn)行了評(píng)價(jià)，對分子印跡膜的影響因素進(jìn)行了篩選和優(yōu)化。試驗(yàn)表明，該分子印跡膜對莠去津具有良好的選擇性和靈敏度。莠去津的還原峰電流與濃度在1.2×10-8～8.0×10-5摩爾/升范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（r＝0.99862），檢出限可達(dá)3.0×10-9摩爾/升。此傳感器測定土壤中的莠去津，回收率在90.8%～98.2%之間，取得了很好的效果。

連惠婷等基于殼聚糖功能基體的電化學(xué)沉積，將久效磷作為模板分子，在玻碳電極表面直接制備具有記憶功能的分子印跡電化學(xué)傳感器。借助以氫鍵為主的弱的分子間作用力，實(shí)現(xiàn)久效磷在殼聚糖聚合基體內(nèi)的印跡，而施加＋0.6V電壓改變復(fù)合物成鍵的微環(huán)境可以實(shí)現(xiàn)洗脫。對分子印跡膜性質(zhì)、洗脫方式等制備條件進(jìn)行考察，其后采用陽離子型電化學(xué)探針三氯化六銨合釕，研究分子印跡傳感器對久效磷的電化學(xué)響應(yīng)特性。結(jié)果表明，所制備的久效磷分子印跡電化學(xué)傳感器具有較高的選擇性，對久效磷的檢測限可達(dá)0.1微摩爾/升。

劉鎮(zhèn)通過沉淀聚合法制備了獸藥氯霉素的分子印跡聚合物，并構(gòu)建了分子印跡壓電生物傳感器，通過對檢測條件的優(yōu)化，該傳感器對氯霉素具有良好的響應(yīng)，且具有良好的特異性識(shí)別能力，成功應(yīng)用于蝦肉和豬肝臟中氯霉素的殘留檢測，用該方法檢測蝦肉和豬肝臟中的氯霉素具有前處理簡單，設(shè)備便宜，響應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，該方法有望在以后得到實(shí)際應(yīng)用。

廉文靜等通過分子印跡技術(shù)、結(jié)合殼聚糖-碳納米管復(fù)合物和納米金構(gòu)建快速檢測卡那霉素的分子印跡傳感器。用電聚合法將分子印跡聚合物聚合到金電極上，采用循環(huán)伏安法和安培法經(jīng)電化學(xué)工作站檢測傳感器的電流響應(yīng)。結(jié)果表明：該傳感器的檢測線性范圍為3×10-8～4×10-5摩爾/升（r＝0.988），最低檢測限為1.29×10-8摩爾/升（信噪比為3）。重復(fù)試驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%。結(jié)果證實(shí)該分子印跡傳感器具有很強(qiáng)的靈敏度、特異選擇性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，并在實(shí)際樣品檢測中顯示了很好的回收率（95%～102%）。

目前，印跡傳感器技術(shù)可用于莠去津、敵草凈、2，4-D、草甘膦、對硫磷、氯霉素等農(nóng)藥的檢測，對大部分農(nóng)藥檢測限可達(dá)微摩爾/升級(jí)。隨著分子印跡技術(shù)和微電子技術(shù)的發(fā)展，分子印跡傳感器技術(shù)將作為一種新的農(nóng)藥檢測方法，具有廣闊的發(fā)展前景。

三、展望

MIT比傳統(tǒng)分離凈化方法具有很多優(yōu)勢，但目前仍存在一些問題。結(jié)合位點(diǎn)的作用機(jī)理、傳質(zhì)機(jī)理仍不清楚，需開展大量工作從分子水平上更好地理解分子識(shí)別過程；目前合成MIPs需使用大量模板分子，難以從根本上解決模板分子滲漏現(xiàn)象，限制了MIT在痕量分析中的實(shí)際應(yīng)用，采用替代模板聚合法是解決此問題的有效方法；現(xiàn)今多數(shù)MIPs中識(shí)別位點(diǎn)與模板分子之間的分子間作用力以氫鍵為主。當(dāng)用于生物、環(huán)境樣品等水相體系的前處理時(shí)，其識(shí)別過程會(huì)受到水等強(qiáng)極性溶劑干擾，在水溶液或極性溶劑中進(jìn)行分子印跡和識(shí)別仍是難題。

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（10276902D），石家莊市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（12149472A）