王安杏 馬望歌 陳方圓 黃 欣 周 娟 郭 寧▲

1.陜西省寶雞市中醫(yī)醫(yī)院心血管二科，陜西寶雞721001；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安710061

14-3-3η通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)對H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

王安杏1馬望歌2陳方圓2黃 欣2周 娟2郭 寧2▲

1.陜西省寶雞市中醫(yī)醫(yī)院心血管二科，陜西寶雞721001；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安710061

目的探討14-3-3η通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法構(gòu)建pFLAG-14-3-3η重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞，使用ISO建立心肌細(xì)胞損傷模型。將培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組：正常對照組、ISO組、ISO+pFLAG組、ISO+14-3-3η組。流式細(xì)胞儀檢測H9c2心肌細(xì)胞凋亡；Western blot檢測H9c2心肌細(xì)胞中半胱氨酸蛋白酶（caspase）-3、caspase-12、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GPR78）、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）的表達(dá)情況；采用試劑盒檢測各組細(xì)胞丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。結(jié)果ISO刺激H9c2心肌細(xì)胞后，與正常對照組比較，ISO組細(xì)胞凋亡率顯著增高（P＜0.05），caspase-3與caspase-12的表達(dá)升高（P＜0.05），MDA含量增高（P＜0.05），SOD活性降低（P＜0.05），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志蛋白GPR78與CHOP的表達(dá)顯著增高（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染pFLAG-14-3-3η后再進(jìn)行ISO處理，與ISO組比較，ISO+14-3-3η組心肌細(xì)胞的凋亡率顯著降低（P＜0.05），caspase-3與caspase-12的表達(dá)明顯減少（P＜0.05），MDA含量降低（P＜0.05），SOD活性增大（P＜0.05），GPR78與CHOP的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論14-3-3η可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)減輕ISO誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷。

14-3-3η；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；心肌細(xì)胞

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是機(jī)體在受到有害刺激時做出的自身保護(hù)性應(yīng)答。研究表明，在細(xì)胞受到各種刺激的損害時，適宜的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對細(xì)胞有保護(hù)作用，而過長時間或過強的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會導(dǎo)致細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制不能與損傷相抗衡，此時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)受到損害，使細(xì)胞凋亡[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在腫瘤、糖尿病、神經(jīng)性系統(tǒng)退行性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]。心血管疾病是目前對人類健康威脅最大的疾病之一，近年來多項研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[3]。心肌細(xì)胞凋亡是影響多種心血管疾病病理生理的重要機(jī)制之一[4-5]。最新研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)[6]，并且14-3-3η也參與小鼠心肌細(xì)胞的凋亡的調(diào)節(jié)[7]，同時14-3-3η對ERS誘發(fā)的細(xì)胞凋亡有抑制作用[8]。本研究通過建立異丙腎上腺素（isopro terenol，ISO）損傷H9c2心肌細(xì)胞模型，探討14-3-3η能否通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來保護(hù)心肌細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

載體pFLAG和LipofectamineTM-2000購自Invit rogen公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ與KpnⅠ、ISO、EDTA、胰蛋白酶購自Sigma公司；胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司；大鼠H9c2心肌細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物保藏所；山羊抗鼠14-3-3η、caspase-3、caspase-12、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GPR78）、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP）和β-actin一抗，HRP-標(biāo)記的兔抗山羊二抗購自Pierce公司；AV/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自BD公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 14-3-3η真核表達(dá)質(zhì)粒pFLAG-14-3-3η的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

設(shè)計14-3-3η的PCR擴(kuò)增引物，并在引物兩端加入EcoRⅠ和KpnⅠ兩個限制酶切位點以及保護(hù)性堿基。提取心肌細(xì)胞H9c2的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為PCR模板。PCR的反應(yīng)條件為94℃5 min；94℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，25個循環(huán)；最后在72℃下延伸10 min。用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以及pFLAG質(zhì)粒，收集目的片段后進(jìn)行連接、篩選、質(zhì)粒提取，并進(jìn)行雙酶切鑒定與測序鑒定。LipofectamineTM-2000與DNA以2.0∶0.8比例混合，轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞H9c2；轉(zhuǎn)染24 h后，Western blot檢測14-3-3η蛋白表達(dá)評測轉(zhuǎn)染效率。

1.3 心肌細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理

心肌細(xì)胞H9c2用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代后取對數(shù)期生長狀況良好的細(xì)胞進(jìn)行試驗。細(xì)胞分為4組：正常對照組：未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，未經(jīng)ISO處理，在含5%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；ISO組：在對照組的基礎(chǔ)上加入終濃度為10 μmoL/L的ISO，進(jìn)行6 h孵育；ISO+ pFLAG組：空載質(zhì)粒pFLAG轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞，24 h后處理同ISO組；ISO+14-3-3η組：重組表達(dá)質(zhì)粒pFLAG-14-3-3η轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞24h后，處理同ISO組。

1.4 流式細(xì)胞法檢測心肌細(xì)胞凋亡

用4℃預(yù)冷的PBS將各組H9c2細(xì)胞洗滌2次，隨后加入0.25%胰酶（含0.0.2%EDTA）消化并收集細(xì)胞。加入1 mL Annexin V結(jié)合緩沖液，800 r/min離心5 min后棄上清，加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。懸液中加入5 mg/L的Annexin V-FITC 10 μL PI 5 μL，混勻后37℃避光孵育30 min。最后以488 nm為激發(fā)波長，530 nm為發(fā)射波長，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)

H9c2細(xì)胞被接種在35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，分組處理后，加入65 μL RIPA細(xì)胞蛋白裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE電泳分離后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別加入1∶3000稀釋的山羊抗鼠14-3-3η、caspase-3、caspase-12、GPR78、CHOP和β-actin一抗，4℃輕搖過夜；隨后加入1∶100比例稀釋的相應(yīng)的HRP-標(biāo)記的兔抗山羊二抗，室溫孵育1 h，漂洗3次；最后X線膠片曝光分析，結(jié)果用Image-Pro Plus處理，以待測蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值作為蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 SOD含量測定

SOD的活性檢測按照試劑盒使用說明完成。每組心肌細(xì)胞中加入酶工作液與水溶性四氮唑鹽（WST）工作液，37℃恒溫孵育20 min，540 nm波長處測量其吸光值。

1.7 MDA含量測定

MDA的含量，用酶聯(lián)法測定。按照MDA試劑盒說明測定各組H9c2心肌細(xì)胞中MDA的含量。收集細(xì)胞，加入20%三氯乙酸（TCA）孵育20 min，隨后加入0.1 mol/L鹽酸（HCl）和0.67%硫代巴比妥酸（TBA）于95℃水浴1 h。離心后在532 nm波長處測量其吸光值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS13.0分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pFLAG-14-3-3η轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后14-3-3η蛋白表達(dá)顯著上調(diào)

Western blot結(jié)果顯示，H9c2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pFLAG-14-3-3η后，14-3-3η蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），表明重組表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞。見圖1。

2.2 pFLAG-14-3-3η轉(zhuǎn)染抑制ISO誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡率升高

結(jié)果顯示：與正常組相比，H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)ISO處理后，細(xì)胞凋亡率顯著增加；當(dāng)轉(zhuǎn)染pFLAG-14-3-3η質(zhì)粒后，ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡受到明顯抑制。見圖2。

2.3 pFLAG-14-3-3η轉(zhuǎn)染抑制ISO引起的凋亡蛋白caspase-3、caspase-12表達(dá)變化

為了進(jìn)一步明確14-3-3η對心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用，采用Western blot方法檢測各組細(xì)胞中凋亡蛋白caspase-3與caspase-12的表達(dá)。結(jié)果表明：在ISO處理組中，caspase-3與caspase-12的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；而在pFLAG-14-3-3η質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中caspase-3與caspase-12的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。見圖3。

2.4 pFLAG-14-3-3η轉(zhuǎn)染抑制ISO誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)MDA、SDO水平變化

結(jié)果顯示：H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)ISO處理后MDA的含量顯著增加（P＜0.05），SOD活性顯著降低（P＜0.05）。在ISO處理前轉(zhuǎn)染pFLAG-14-3-3η質(zhì)粒24 h，可明顯降低ISO引起的MDA含量增加（P＜0.05），并顯著提高SOD的活性（P＜0.05）。見圖4。

2.5 pFLAG-14-3-3η轉(zhuǎn)染抑制ISO誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78及CHOP的表達(dá)

結(jié)果表明：GPR78和CHOP的表達(dá)在ISO處理組中顯著升高（P＜0.05），并在pFLAG-14-3-3η質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中明顯降低（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

近年來，心肌細(xì)胞凋亡一直是心血管領(lǐng)域的研究熱點。14-3-3η是屬于14-3-3蛋白家族其中一個亞型[9]。14-3-3蛋白家族是一類酸性二聚體可溶性蛋白，具有高度保守性，可與包括核轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的多種蛋白相互作用影響細(xì)胞功能，甚至可以與激酶、受體等蛋白結(jié)合，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長、分裂、分化、凋亡、細(xì)胞周期等眾多生理過程中發(fā)揮重要作用[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3蛋白影響多種心血管疾病的病理進(jìn)程[12]。近年來在細(xì)胞水平上對心肌細(xì)胞損傷與保護(hù)的研究已成為國內(nèi)外心血管疾病研究發(fā)展的新方向。其最大的優(yōu)點在于可以精確反映特定的因子對心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。β1腎上腺素受體是心臟功能調(diào)節(jié)的主要受體，ISO是該受體的激動劑，臨床上主要用于房室傳導(dǎo)阻滯、心臟休克、驟停等心血管疾病的治療。目前常用ISO來建立缺血性心臟病以及心力衰竭的動物模型[13-15]。研究發(fā)現(xiàn)用ISO誘導(dǎo)大鼠心肌損傷，會引起心肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[16]。據(jù)此，用ISO建立心肌細(xì)胞損傷模型，轉(zhuǎn)染含有14-3-3η的表達(dá)載體pFLAG-14-3-3η至心肌細(xì)胞H9c2中，通過研究該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染對細(xì)胞凋亡，細(xì)胞損傷程度以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白的表達(dá)的影響，探討14-3-3η對ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

本研究首先檢測轉(zhuǎn)染了pFLAG-14-3-3η的H9c2心肌細(xì)胞中的14-3-3η的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的心肌細(xì)胞中14-3-3η的表達(dá)明顯增高（P＜0.05），說明重組表達(dá)質(zhì)粒能在心肌細(xì)胞中有效表達(dá)。通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，ISO組中的細(xì)胞凋亡率顯著增高（P＜0.05），ISO+pFLAG-14-3-3η組的細(xì)胞凋亡率與ISO組相比顯著降低（P＜0.05），提示14-3-3η對ISO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抑制作用，這一結(jié)果與國外學(xué)者觀察到的結(jié)果相同[7]。本研究通過檢測心肌細(xì)胞中凋亡蛋白caspase-3與caspase-12的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)凋亡蛋白在ISO組中表達(dá)升高（P＜0.05），且在pFLAG-14-3-3η轉(zhuǎn)染組中降低（P＜0.05），進(jìn)一步證明了14-3-3η對細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

本研究用MDA含量與SOD活性來衡量心肌細(xì)胞受損傷的程度，結(jié)果顯示14-3-3η可減少有ISO引起的MDA含量升高（P＜0.05），并提高ISO引起SOD活性降低（P＜0.05），說明14-3-3η對ISO的細(xì)胞毒性有逆轉(zhuǎn)作用，對ISO引起的細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。已有研究證明14-3-3η對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用與ERS密切相關(guān)[8]。為進(jìn)一步研究14-3-3η對心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制，本研究檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白的表達(dá)。GRP78又稱免疫球結(jié)合蛋白，是公認(rèn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號系統(tǒng)的上游開關(guān)分子，是ERS的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白[17]。CHOP是ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。正常細(xì)胞中CHOP的表達(dá)非常低，而在細(xì)胞受到刺激產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時，其表達(dá)顯著增加[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GRP78與CHOP的表達(dá)在ISO組中顯著升高（P＜0.05），說明ISO可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，與相關(guān)研究結(jié)果一致[16]。在ISO+ pFLAG-14-3-3η組中，GRP78與CHOP的表達(dá)與ISO相較明顯降低（P＜0.05），表明14-3-3η能夠抑制ISO激活的心肌細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，本研究結(jié)果證實了ISO會引起心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，而轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒pFLAG-14-3-3η可以通過減輕細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來降低心肌細(xì)胞損傷程度，說明14-3-3η可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護(hù)ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

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Protection of 14-3-3η to H9c2 cardiomyocytes injury through inhibiting endoplasmic reticulum stress reaction

WANG Anxing1MA Wangge2CHEN Fangyuan2HUANG Xin2ZHOU Juan2Guo Ning2▲
1.Second Department of Cardiovascular,Chinese Medicine Hospital of Baoji City,Shaanxi Province,Baoji721001, China;2.Department of Vasculocardiology,the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Shaanxi Province, Xi'an710061,China

ObjectiveTo study the effectof 14-3-3η on isoprenaline(ISO)induced H9c2 cardiomyocytes injury through inhibiting endoplasmic reticulum stress.MethodsThe recombinant expression vector pFLAG-14-3-3η was constructed and transfected into H9c2 cells.The cardiomyocytes injury model was established by using ISO.The H9c2 cells were randomly divided into four groups:control group,ISO group,ISO+pFLAG group,ISO+14-3-3η group.Cell apoptosis was detected by flow cytometry.Protein expression levels ofcaspase-3,caspase-12,glucose regulated protein 78(GPR78),and CCAAT/enhancer binding protein homologous protein(CHOP)were examined by western blot.Themaleic dialdehyde(MDA)content and superoxide dismutase(SOD)activity was measured by the MDA and SOD detection kit,respectively.ResultsAfter ISO stimulating H9c2 cardiomyocytes,compared with the control group,in ISO group,the cell apoptosis increased(P＜0.05),the expression levels of caspase-3 and caspase-12 increased(P＜0.05), the content of MDA increased(P＜0.05),the activity of SOD decreased(P＜0.05),and the expression levels of GRP78 and CHOP increased(P＜0.05).After reversed by pFLAG-14-3-3η transfection,dealed with ISO,compared with ISO group,in ISO+14-3-3η group,the expression levels of caspase-3 and caspase-12 decreased(P＜0.05),the content of MDA decreased(P＜0.05),the activity of SOD increased(P＜0.05),and the expression levels of GRP78 and CHOP decreased(P＜0.05).ConclusionThe 14-3-3η over expression protects cardiomyocytes against ISO-induced cell injury via inhibiting endoplasmic reticulum stress.

14-3-3η;Endoplasmic reticulum stress;Cardiomyocytes

R542.2

A

1673-7210（2015）04（b）-0022-05

2015-01-04本文編輯：蘇暢）

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