■王 津 馬 蕊 韓 燁郭曉倩周志江鄭成江范 寰

（1.天津大學(xué)，天津300072；2.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300384；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津300384）

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，由于抗生素過(guò)量和不合理的使用導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)藥物殘留、細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)等問(wèn)題，給畜禽業(yè)及人類健康造成嚴(yán)重危害?？股仉m可以抑制病原菌，但對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的益生菌有抑制作用，從而破壞了動(dòng)物腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡。尋找新的替代品以取代抗生素在動(dòng)物防病及促生長(zhǎng)方面的作用，以減少甚至取代抗生素的應(yīng)用是目前的研究熱點(diǎn)。

益生素又被稱為微生態(tài)制劑，是一類能夠維持腸內(nèi)菌群生態(tài)平衡，對(duì)機(jī)體起有益作用的活的微生物制劑。它可直接通過(guò)增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)腸內(nèi)有害微生物的抑制作用或通過(guò)增強(qiáng)非特異性免疫功能來(lái)預(yù)防疾病，從而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)或提高飼料轉(zhuǎn)化率。國(guó)內(nèi)外許多研究表明，微生態(tài)制劑對(duì)平衡動(dòng)物腸道菌群和改善腸道微生態(tài)、環(huán)境等方面具有十分重要的作用，對(duì)家禽消化道疾病（如沙門氏菌、大腸桿菌等細(xì)菌性疾?。┚惺诛@著的防治作用。

微生態(tài)制劑用于提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和健康水平，效果差異較大，原因之一就是菌株定植的宿主特異性。因此，理想的微生態(tài)制劑菌株最好來(lái)自于同源動(dòng)物的腸道，只有這樣才能增強(qiáng)益生菌功效。本研究目的是從肉雞盲腸內(nèi)分離出芽孢桿菌，并圍繞菌株的形態(tài)、抑菌性能、耐酸性和耐膽鹽性等幾個(gè)方面進(jìn)行了益生菌株的篩選，為今后開發(fā)安全、有效的微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

NB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)芽孢桿菌，配方如下：蛋白胨1 g、牛肉膏0.3 g、氯化鈉0.5 g、蒸餾水100 ml，pH值7.0。

LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)抑菌試驗(yàn)中的指示菌大腸桿菌和雞白痢沙門氏菌，配方如下：大豆蛋白胨1 g、酵母提取物0.5 g、氯化鈉1 g、蒸餾水100 ml，pH值7.0。

1.2 指示菌

大腸桿菌（Escherichia coli）和雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum）由天津市畜牧獸醫(yī)研究所保存。

1.3 芽孢桿菌的分離

用75%酒精消毒雞體表面，剪斷氣管和頸動(dòng)脈，使雞迅速死亡。然后用干凈的載玻片刮取盲腸內(nèi)容物樣品0.5 g，添加到裝有4.5 ml無(wú)菌生理鹽水的試管中，用渦旋式混勻器使其充分混合均勻。將此原液放于100℃水浴鍋中加熱10 min殺死非芽孢的微生物，之后將該原液加入到45 ml NB液體培養(yǎng)基中，37℃富集培養(yǎng)20 h。取富集培養(yǎng)后的菌液500 μl到4.5 ml無(wú)菌生理鹽水中進(jìn)行梯度稀釋，依次梯度稀釋至 10-6。分別取 10-4、10-5、10-6稀釋度的樣品100 μl，滴到NB瓊脂培養(yǎng)基平板上，用涂布棒將其涂布均勻，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，挑取5株單菌落，反復(fù)劃線純化到獲得純菌株為止。將純化好的菌落進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，革蘭氏染色和鏡檢。

1.4 抑菌試驗(yàn)

采用牛津杯法對(duì)篩選出的芽孢桿菌菌株進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。將指示菌大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌按1%（v/v）接種量分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h備用。將芽孢桿菌菌株發(fā)酵液以1%（v/v）接種量接種于NB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)18 h備用。取滅菌培養(yǎng)皿，注入滅菌的NB固體培養(yǎng)基15 ml，水平放置使之凝固，作為底層。放入已滅菌的牛津杯，將含有200 μl指示菌的20 ml的LB半固體培養(yǎng)基混勻倒入平板，冷凝后取出牛津杯。在孔中加入50 μl芽孢桿菌菌液，放置在4℃擴(kuò)散4 h，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。

1.5 耐酸和耐膽鹽試驗(yàn)

參見王津等（2014）的方法。

1.6 16S rDNA鑒定

1.6.1 細(xì)菌DNA的制備和擴(kuò)增

將篩選出的芽孢桿菌接種于NB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18 h。取1.5 ml培養(yǎng)液于離心管中，12 000 r/min離心30 s，棄上清，收集菌體進(jìn)行DNA的制備和PCR擴(kuò)增。

1.6.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析

以1倍TAE緩沖液配制1.0%瓊脂糖凝膠。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl，加入溴酚藍(lán)指示劑，混勻后加樣。100 V電泳30 min，溴化乙錠染色20 min，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。

1.6.3 測(cè)序及序列比對(duì)

擴(kuò)增出鑒定細(xì)菌的16S rDNA片段，PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序后做 Blast分析，并在 GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中比對(duì)，獲得鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)特征

試驗(yàn)共分離了5株疑似芽孢桿菌菌株，分別標(biāo)記B1、B2、B3、B4、B5。疑似芽孢桿菌的單菌落呈圓形，直徑4～5 mm，乳白色，表明呈褶皺狀，邊緣為鋸齒狀，質(zhì)地黏稠，革蘭氏染色均為陽(yáng)性，桿狀。

2.2 抑菌試驗(yàn)

菌株對(duì)大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌的抑制作用結(jié)果見表1。由抑菌試驗(yàn)結(jié)果可以看出，所篩選的菌株均對(duì)大腸桿菌和雞白痢沙門氏菌有一定的抑制作用。對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑在10.77～16.99 mm，而對(duì)雞白痢沙門氏菌抑菌圈直徑在11.24～17.36 mm。挑選出對(duì)大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌抑菌圈直徑均超過(guò)15.00 mm的菌株，分別為B3、B4、B5，進(jìn)行下一步的耐酸試驗(yàn)。

表1 菌株對(duì)大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌的抑制作用

2.3 耐酸試驗(yàn)

雞胃中pH值很低，一般為2.0～3.0。因此益生菌必須具有較強(qiáng)的耐酸能力，才能通過(guò)高酸性的胃環(huán)境而達(dá)到腸道發(fā)揮作用。本試驗(yàn)考察2 h內(nèi)不同pH值條件下B3、B4、B5菌株的存活率，結(jié)果見表2。除了B3外，B4、B5菌株均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐酸能力。pH值4.0處理后存活率分別為63.42%和87.01%；pH值3.0處理后存活率分別為41.34%和59.99%；pH值2.0處理后存活率分別為30.22%和40.02%。因此，挑選出B4、B5進(jìn)行下一步的耐膽鹽試驗(yàn)。

表2 不同pH值條件下菌株的存活率（%）

2.4 耐膽鹽試驗(yàn)

小腸內(nèi)膽鹽濃度在0.1%～0.3%。因此，益生菌必須具有較強(qiáng)的耐膽鹽能力，才能通過(guò)小腸內(nèi)膽鹽的高滲透壓環(huán)境。本試驗(yàn)2 h內(nèi)不同膽鹽濃度條件下B4、B5菌株的存活率，結(jié)果見表3。B5表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐膽鹽能力，0.1%處理后存活率為82.34%，0.2%處理后存活率為70.18%，0.3%處理后存活率為48.77%。因此，將菌株B5進(jìn)行16S rDNA鑒定。

表3 不同膽鹽濃度條件下菌株的存活率（%）

2.5 16S rDNA鑒定

分離菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)（見圖1）。由圖1可知，分離的芽孢桿菌菌株得到一條清晰的條帶，與Marker相比，所獲得的擴(kuò)增片段大小在1 500 bp左右，說(shuō)明所得PCR產(chǎn)物為目的產(chǎn)物，可以純化后進(jìn)行測(cè)序。將菌株的16S rDNA序列輸入到GenBank中，尋找與其同源性最高的菌株。菌株B5與Bacillus amyloliquefaciens的16S rDNA序列的同源性達(dá)到了99%。最終確定菌株B5為解淀粉芽孢桿菌。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

3 討論

傳統(tǒng)的微生物鑒定方法是從菌落觀察及一系列復(fù)雜的生理生化試驗(yàn)來(lái)判斷，具有耗時(shí)長(zhǎng)、易干擾、誤差大等缺點(diǎn)。而分子生物學(xué)鑒定技術(shù)從基因水平對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，具有精確、快速的優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)從盲腸篩選出一株芽孢桿菌菌株，進(jìn)行16S rDNA鑒定，經(jīng)同源性比較分析確定為解淀粉芽孢桿菌，同源性達(dá)到99%。

益生菌作為微生態(tài)類的飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用已經(jīng)越來(lái)越普通。然而，其理論上的種種優(yōu)越性能在生產(chǎn)上表現(xiàn)的效果卻常常不盡如人意，究其原因，與益生菌菌株的來(lái)源有很大的關(guān)系。大量研究指出，采用與原宿主、原生態(tài)環(huán)境和原微生態(tài)系統(tǒng)相適應(yīng)的同源動(dòng)物腸道菌群作為益生菌菌株是最為理想的。芽孢桿菌利用氧氣的能力很強(qiáng)，它們?cè)谀c道定植后，能大大消耗腸道內(nèi)的氧氣，造成厭氧環(huán)境，使得腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群——厭氧菌大量繁殖。芽孢桿菌能形成特殊的休眠體芽孢，在飼料加工過(guò)程及進(jìn)入動(dòng)物消化道經(jīng)受各種不利因素的影響方面，具有比乳酸菌更強(qiáng)的抗逆性和耐受性，而且營(yíng)養(yǎng)要求也很簡(jiǎn)單，具有明顯的生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)。因此，本試驗(yàn)以雞的盲腸作為來(lái)源，進(jìn)行芽孢桿菌菌株的分離、篩選和鑒定。

微生態(tài)學(xué)理論認(rèn)為，要保證經(jīng)口服方法飼喂的益生菌能夠?qū)?dòng)物產(chǎn)生各種益生效應(yīng)（增強(qiáng)免疫力、預(yù)防腹瀉、拮抗病原微生物等），先決條件是益生菌能夠在經(jīng)過(guò)胃部到達(dá)消化道后段時(shí)還保持著較多的活菌數(shù)。因此，益生菌必須具備耐受胃中的低pH值，才可能進(jìn)入動(dòng)物消化道后能夠存活、繁殖，發(fā)揮其益生作用。經(jīng)過(guò)了胃部的極端酸性環(huán)境之后，益生菌還需要耐受小腸中膽汁形成的高滲透壓環(huán)境。本試驗(yàn)篩選出的B5菌株有較強(qiáng)的耐酸和耐膽鹽能力。而芽孢桿菌在較低pH值環(huán)境下仍能正常萌發(fā)和生長(zhǎng)繁殖，原因可能是在酸性環(huán)境中，芽孢桿菌通過(guò)調(diào)節(jié)自身膜壁的滲透壓，阻止氫離子進(jìn)入細(xì)胞；或當(dāng)氫離子進(jìn)入細(xì)胞后，用鈉氫泵反向協(xié)助運(yùn)輸將氫離子排出，使細(xì)胞內(nèi)pH值保持中性。

4 結(jié)論

試驗(yàn)通過(guò)抑菌、耐酸、耐膽鹽試驗(yàn)，從肉雞盲腸中篩選出了1株芽孢桿菌菌株。經(jīng)16S rDNA序列同源性比較分析，最終鑒定為解淀粉芽孢桿菌，為今后研究與開發(fā)益生菌劑奠定了理論基礎(chǔ)。

（參考文獻(xiàn)14篇，刊略，需者可函索）