王宇翀, 薛春雨

綜 述

組織工程化皮膚的研究進(jìn)展與展望

王宇翀, 薛春雨

組織工程； 皮膚； 表皮替代物； 真皮替代物； 復(fù)合皮替代物

組織工程化皮膚是將體外培養(yǎng)的活細(xì)胞種植于天然或人工合成的細(xì)胞外基質(zhì)，在體外培養(yǎng)一定時間后，植入皮膚缺損區(qū)，以達(dá)到修復(fù)重建的目的[1]。與自體皮移植、異體皮移植等傳統(tǒng)修復(fù)皮膚缺損的方法相比，組織工程化皮膚的優(yōu)點(diǎn)包括：減少對供體組織的需求；減輕創(chuàng)面結(jié)痂和收縮現(xiàn)象；對大面積急性創(chuàng)面實現(xiàn)快速覆蓋；免疫排斥性??；可傳遞外界生長因子等[2]。因此，組織工程化皮膚已成為一個有著良好前景的熱點(diǎn)領(lǐng)域，全世界的研究者為此做出了巨大的努力。按照目前常用的分類方法，組織工程化皮膚分為表皮替代物、真皮替代物和復(fù)合皮替代物。筆者對這3種皮膚替代物的研究、應(yīng)用進(jìn)展作一綜述，分析各種組織工程化皮膚的優(yōu)缺點(diǎn)及未來的發(fā)展方向。

1 表皮替代物

早在1975年，Rheinwald和Green[3]就利用3T3成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，首次培養(yǎng)并擴(kuò)增了人體表皮朊細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)與人類表皮極為相似。1979年，Green等首次將這種自體表皮膜片應(yīng)用于臨床，成功封閉了大面積燒傷患者切痂后的創(chuàng)面；此后,組織工程表皮廣泛應(yīng)用于各種皮膚缺損的創(chuàng)面修復(fù)。為了使較少的表皮替代物能覆蓋較大的創(chuàng)面，可以利用生長因子促進(jìn)表皮細(xì)胞生長和擴(kuò)增[4]。主要生長因子包括表皮生長因子(epidermal growth factor， EGF)[5]、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factors， FGF)[6]、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor， PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)[7]等。目前的組織工程表皮產(chǎn)品在修復(fù)大面積燒傷[8]、創(chuàng)傷、凍傷等創(chuàng)面[9]中，都已經(jīng)非常成熟。

應(yīng)用表皮替代物救治大面積皮膚缺損的患者,至今仍是其應(yīng)用較多的方法之一。表皮替代物的優(yōu)點(diǎn)：⑴少量的自體表皮即可獲得大面積的永久性創(chuàng)面覆蓋；⑵能迅速恢復(fù)皮膚的屏障作用。其缺點(diǎn)：⑴細(xì)胞培養(yǎng)周期長，成本高；⑵成活率低；⑶成活后的膜片缺乏彈性及韌性，耐磨性差，易出現(xiàn)水泡及破潰，色素沉著明顯，晚期瘢痕攣縮嚴(yán)重。這些不足促使研究者對真皮替代物進(jìn)行研制與應(yīng)用。

2 真皮替代物

有研究表明，真皮成分越多，皮膚愈合越快，創(chuàng)面質(zhì)量改善越明顯，還可減少供皮區(qū)切取的厚度，加快供皮區(qū)愈合。創(chuàng)面置入真皮替代物后，成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管會逐漸長入其中，2～3周便可以在其上方移植表皮，從而達(dá)到修復(fù)創(chuàng)面的目的[10]。真皮替代物可大致分為天然真皮替代物和人工合成的真皮替代物。

2.1 天然真皮替代物 天然真皮替代物是將天然的生物材料，如異體皮、羊膜等，去除具有抗原性的細(xì)胞成分，制作出保留膠原結(jié)構(gòu)的各種脫細(xì)胞基質(zhì)。去除表皮層的異體真皮是將異體皮植入到創(chuàng)面后，去除表皮層，隨后，在其表面植入自體表皮或培養(yǎng)的自體表皮細(xì)胞膜片。無細(xì)胞真皮是通過酶消化、高滲鹽水浸泡等方法去除異體皮中的表皮層和真皮細(xì)胞成分，僅保留正常的膠原三維結(jié)構(gòu)和基質(zhì)的真皮支架，如脫細(xì)胞羊膜等[11]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸從天然的生物材料中提取出膠原蛋白[12]、纖維連接蛋白、纖維蛋白、透明質(zhì)酸[13]、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)、殼聚糖等物質(zhì)，應(yīng)用這些物質(zhì)，也可以構(gòu)建出活性皮膚，作為良好的皮膚創(chuàng)傷覆蓋物。

天然真皮替代物在皮膚重建中廣泛應(yīng)用。天然真皮替代物的優(yōu)點(diǎn)：⑴具有完整的膠原三維結(jié)構(gòu)和真皮支架；⑵具有良好的生物相容性；⑶具有一定的孔隙率，適于細(xì)胞生長；⑷降解速率與生物體的改建速率相當(dāng)。其缺點(diǎn)：⑴制作過程復(fù)雜；⑵天然生物材料來源有限；⑶存在傳播疾病的危險。

2.2 人工真皮替代物 人工真皮替代物是采用生物原料或高分子聚合物等制備而成的真皮支架材料。Yannas等[14]利用膠原硫酸軟骨素氨基葡聚糖共價交聯(lián)合成有孔隙的海綿網(wǎng)格，再在其表面涂上一層硅膠膜而制成組織工程真皮，外層薄硅膠膜相當(dāng)于表皮，可防止體液喪失和微生物入侵，然后移植于燒傷創(chuàng)面，3周后，去除硅膠膜，再在上方移植一層自體皮片。實驗證實，這種人工皮膚能夠誘導(dǎo)血管和成纖維細(xì)胞長入。Copper等[15]在由聚羥基乙酸和丙交酯乙交酯共聚物兩種可吸收線制成的網(wǎng)架上接種新生兒包皮中提取的成纖維細(xì)胞，形成由可降解材料、成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的人工真皮。經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面愈合后瘢痕形成和攣縮較少，皮膚彈性好，臨床應(yīng)用療效滿意。Chu等[16]應(yīng)用一步操作法制成網(wǎng)狀復(fù)合皮片，可以更充分地利用供體皮膚，加快傷口愈合，且愈合后的創(chuàng)面收縮少、外形好。陳偉和姜平[17]用膠原凝膠和成纖維細(xì)胞制成活性真皮替代物，并移植于裸鼠背部修復(fù)全層皮膚，4周后被表皮覆蓋，取材觀察發(fā)現(xiàn)，其具有表皮、真皮及成熟的血管結(jié)構(gòu)。Matsumura等[18]在不同時間點(diǎn)做病理切片，觀察到表皮和真皮顯示基本正常的組織學(xué)外觀，發(fā)現(xiàn)基底膜蛋白質(zhì)出現(xiàn)較晚是其脆弱和易脫落的原因。Mineo等[19]利用透明質(zhì)酸和膠原蛋白為基質(zhì)配合生長因子制備出了帶表皮生長因子的人工真皮，并且制備了不帶表皮生長因子的對照組，結(jié)果證實，含有生長因子的人工真皮在促進(jìn)血管生成、抑制炎癥反應(yīng)和自體皮移植后的成活率方面都明顯優(yōu)于對照組。周顯玉等[20]利用脫細(xì)胞真皮基質(zhì)聯(lián)合自體表皮成功構(gòu)建了人工皮瓣模型，提示人工真皮可以根據(jù)實際需要構(gòu)建出皮瓣，用于創(chuàng)面修復(fù)，為臨床上疑難創(chuàng)面的修復(fù)開辟了一條新的途徑。目前，利用人工真皮修復(fù)創(chuàng)面的最長隨訪時間是22年。Suzuki等[21]用人工真皮(PELNAC)治療了一個5歲男孩背部下方和臀部的巨痣，他們把巨痣切除后的創(chuàng)面用人工真皮覆蓋，3周后在其上方移植刃厚皮片，5年后,臀部人工真皮修復(fù)的皮膚下放置擴(kuò)張器，用擴(kuò)展的皮膚重建肛門周圍殘余的巨痣。22年來，一直保持著良好的外觀和功能。

人工真皮替代物的優(yōu)點(diǎn)：⑴瘢痕形成和攣縮較少，外觀好；⑵操作簡便，可批量化生產(chǎn)；⑶免疫排斥反應(yīng)小。其缺點(diǎn)：⑴需Ⅱ期手術(shù)移植自體表皮；⑵發(fā)生感染、體內(nèi)水電解質(zhì)代謝紊亂的概率高。由此可見，包含自體表皮與真皮，甚至是包含皮膚附屬器，可達(dá)到永久性修復(fù)創(chuàng)面的目的，復(fù)合皮替代物是更為理想的選擇。

3 復(fù)合皮替代物

1981年，Bell等[22]將表皮膜片與新生兒包皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞在凝膠中生長形成的真皮相結(jié)合, 形成了表皮-真皮替代物，并移植成功。在此基礎(chǔ)上，也研制了由人類角化細(xì)胞和成纖維細(xì)胞與牛膠原蛋白組成的表皮-真皮替代物應(yīng)用于中、重度燒傷患者的治療。王旭等[23]將新鮮的尸體進(jìn)行皮處理，并制成固體膠原膜，然后將異體表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分別種植在膜的兩面，形成由纖維細(xì)胞、膠原膜和表皮細(xì)胞構(gòu)成的復(fù)合皮，其機(jī)械強(qiáng)度和柔韌性較好, 并成功修復(fù)了深度燒傷創(chuàng)面, 長期隨訪未發(fā)現(xiàn)明顯排斥現(xiàn)象。金巖等[24]采用胎兒皮膚作為細(xì)胞來源，以牛Ⅰ型膠原為支架，研制出全層組織工程化皮膚。顯微觀察顯示，該皮膚具備表皮層和真皮層，接近正常的皮膚結(jié)構(gòu)。目前，組織工程復(fù)合皮替代物在臨床和實驗室中都已經(jīng)廣泛應(yīng)用，其應(yīng)用范圍包括大面積燒傷、靜脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍[25]及壓瘡性潰瘍等慢性難治性潰瘍[26]和白癜風(fēng)、壞疽性膿皮病等皮膚病。另外，科研人員還將組織工程化皮膚應(yīng)用于疾病模型的構(gòu)建[27]，包括銀屑病模型、色素沉著模型、黑色素瘤模型、創(chuàng)傷修復(fù)模型、過敏原模型、皮膚刺激模型等。這些研究將會給相關(guān)的疾病帶來新的解決思路和方法。

值得注意的是，現(xiàn)有的組織工程化皮膚，大多數(shù)只是結(jié)構(gòu)上與人體皮膚類似，由于缺乏皮膚相關(guān)的細(xì)胞和附件，在皮膚的分泌、排泄及能量交換等方面，與正常皮膚仍有很大的差距[28]。所以，它們只是暫時的皮膚組織替代物，并沒有達(dá)到真正的皮膚重建。將黑色素細(xì)胞、朗格罕氏細(xì)胞，以及毛囊、皮脂腺、汗腺等構(gòu)建入皮膚，也是學(xué)者們一直追求的目標(biāo)。焦虎等[29]根據(jù)毛囊的形成原理，將人的毛乳頭細(xì)胞和表皮細(xì)胞種植在皮膚替代物的真皮層中，構(gòu)建出了毛囊樣結(jié)構(gòu)和皮脂腺樣結(jié)構(gòu)。管樂等[30]通過向組織工程化皮膚插入分離出的毛囊單位，發(fā)現(xiàn)復(fù)合毛囊單位可以促進(jìn)組織工程化皮膚表皮的分化和成熟，這說明，不僅皮膚對毛囊的生長有調(diào)控作用，而且毛囊對皮膚的增殖、修復(fù)、免疫等[31]方面，也具有重要作用。張菊芳等[32]以殼聚糖-明膠薄膜材料作為支架材料，成體黑色素細(xì)胞和表皮角質(zhì)形成細(xì)胞為種子細(xì)胞，有效地構(gòu)建了含黑色素細(xì)胞的組織工程表皮。江蕾薇等[33]對人的角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞分別進(jìn)行培養(yǎng)，在細(xì)胞傳至第3代時，共同接種于人去表皮的真皮中繼續(xù)培養(yǎng)，構(gòu)建了含有黑色素成分的組織工程化皮膚。宋可新等[34]將黑色素細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過適當(dāng)?shù)谋壤旌?，并與Ⅰ型膠原膜復(fù)合，在體外構(gòu)建出了具有黑色素細(xì)胞的組織工程化皮膚。Huang等[35]利用含表皮生長因子的明膠微球構(gòu)建組織工程全層皮膚，再植入培養(yǎng)好的汗腺細(xì)胞，然后移植到全層皮膚缺損的裸小鼠創(chuàng)傷模型中，結(jié)果顯示，這種裸小鼠的傷口愈合程度比沒有汗腺結(jié)構(gòu)的對照組更好?？傊哑つw的附屬器構(gòu)建入組織工程化皮膚，是必然的趨勢，也是未來研究的一大熱點(diǎn)。

4 存在的問題與展望

組織工程化皮膚雖然在臨床應(yīng)用中取得了很大成功，但也面臨著很多嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)：⑴種子細(xì)胞的相關(guān)研究及利用基因工程對細(xì)胞進(jìn)行改造。目前發(fā)現(xiàn)，自體皮膚干細(xì)胞不僅可以解決皮膚移植中的免疫排斥問題，而且將開辟新的種子細(xì)胞來源途徑[36]；⑵細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)增技術(shù)需進(jìn)一步完善；⑶選擇和開發(fā)適合的支架材料；⑷解決免疫排斥、異物反應(yīng)等方面的問題；⑸進(jìn)一步重視皮膚細(xì)胞的研究：細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞之間的相互作用、應(yīng)用與轉(zhuǎn)歸機(jī)制；⑹皮膚附屬器的研究與構(gòu)建等。

綜上所述，理想的皮膚替代物應(yīng)該是可在短時間內(nèi)獲得，方便操作，與創(chuàng)面黏附良好，表皮和真皮成分能盡快完成自身增殖、分化和功能成熟，形成生理性、永久性的皮膚替代物。我們相信，隨著醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、材料科學(xué)等諸多相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，也許在不久的將來，就會出現(xiàn)理想的組織工程化皮膚，并造福人類。

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長海醫(yī)院“1255”學(xué)科建設(shè)計劃項目(CH125530200) 作者單位：200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院 整形外科 第一作者：王宇翀(1987-)，男，江蘇徐州人，住院醫(yī)師，碩士. 通信作者：薛春雨，200433，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院 整形外科，電子信箱: xcyfun@sina.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.02.018

2014-09-28)