劉慧梅 顏學(xué)兵

1.徐州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇徐州 221000；2.江蘇省徐州市傳染病醫(yī)院結(jié)核科，江蘇徐州 221000；3.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科，江蘇徐州 221000

結(jié)核病的有效控制關(guān)鍵在于對結(jié)核患者的快速檢測及治療。 傳統(tǒng)的實驗室診斷方法存在諸多不足，如抗酸菌涂片鏡檢方法操作簡便、快速、特異、經(jīng)濟，但靈敏性較低[1-2]；固體培養(yǎng)法價格較低廉，敏感性較涂片鏡檢法高，但耗時達數(shù)周；液體培養(yǎng)法雖然可以提高敏感度、縮短報告時間，但經(jīng)濟成本非常高[3-4]。因此尋找一種可以快速診斷結(jié)核病的實驗室方法顯得非常重要[5]。近年來，利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術(shù)（Xpert MTB/RIF）實驗逐漸受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。 該檢測方法國內(nèi)臨床應(yīng)用剛剛起步，缺乏對其診斷性能的報道。 本研究旨在對Xpert MTB/RIF 實驗與T-spot 實驗等檢測方法在結(jié)核病診斷中的臨床價值進行對比研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014 年10 月～2015 年5 月徐州市傳染病醫(yī)院結(jié)核科收治的237 例患者，分為結(jié)核組和非結(jié)核組，分別為195 例和42 例，診斷均符合中華結(jié)核病診治指南診斷標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)核組包括： 肺結(jié)核組160 例，男77 例，女83 例，年齡5～78 歲；肺外結(jié)核組35 例，男22 例，女13 例，年齡3～72 歲，主要包括結(jié)核性腹膜炎10 例、結(jié)核性腦膜炎3 例、骨結(jié)核3 例、淋巴結(jié)核6 例、腸結(jié)核7 例、腎結(jié)核3 例、女性生殖系統(tǒng)結(jié)核3 例。 非結(jié)核組42 例，主要是肺炎、肺癌等患者，男26 例，女16 例，年齡22～83 歲。

1.2 方法

囑咐患者清晨嗽口后用力咳出深部濃痰，一式3 份，一份用于結(jié)核分枝桿菌（MTB）培養(yǎng)，一份用于痰涂片檢查，一份用于XpertMTB/RIF 檢測。標(biāo)本收集的注意事項：①痰液標(biāo)本收集以清晨為最佳，因為該時間段患者痰量多，含菌量多；②在醫(yī)生或護士指導(dǎo)下取樣，不得私自取樣；③囑咐患者漱口3 遍以上，以除去淺表固有細(xì)菌。 如果患者昏迷或無力咳嗽，不宜收集樣本，醫(yī)護人員應(yīng)該協(xié)助患者采取合適體位，叩背以使痰液松動，再用吸痰器吸引，在吸痰器吸管中段搜集痰液，按吸痰法將痰液吸入集痰器內(nèi)。

1.3 結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點（T-spot）、液體培養(yǎng)、Xpert MTB/RIF 及藥敏實驗

T-spot 實驗：采集肝素抗凝外周血5 mL，分離外周單個核細(xì)胞（PBMC）放入包被γ-INF 抗體的微孔板，加入結(jié)核特異性抗原早期分泌靶向抗原（early se creting antigen target 6，ESAT-6）和培養(yǎng)濾過蛋白（culture filtrate protein 10，CFP-10）作為刺激原，溫箱培養(yǎng)24 h 后，洗去抗原致敏效應(yīng)T 淋巴細(xì)胞，加入生物素標(biāo)記的二抗，再經(jīng)酶聯(lián)顯色，在細(xì)胞因子分泌的地方形成斑點，通過記錄斑點讀數(shù)檢測結(jié)核特異抗原致敏效應(yīng)T 淋巴細(xì)胞數(shù)量。 結(jié)果判定：當(dāng)空白對照孔內(nèi)斑點數(shù)為0～5 個時，任一實驗孔斑點數(shù)減去空白孔斑點數(shù)≥6 個，結(jié)果為陽性；如果空白對照孔斑點數(shù)＞6 個時， 任一實驗孔斑點數(shù)≥空白孔斑點數(shù)的2 倍，結(jié)果同樣表明陽性結(jié)果；如果上述標(biāo)準(zhǔn)不符合且陽性質(zhì)控對照孔正常時，檢測結(jié)果為陰性。

液體培養(yǎng)及藥敏試驗：在Ⅱ級生物安全操作柜中接種環(huán)刮取菌落，涂抹至羅氏培養(yǎng)基斜面，旋緊螺旋蓋，在渦旋振蕩器上振蕩10～20 s，制成均勻的菌液。靜置10 min 后，用吸管接種約0.1 mL 至中性羅氏培養(yǎng)及斜面上。 傳代后的培養(yǎng)基放置在36℃培養(yǎng)，每周觀察菌落生長情況，于肉眼可見菌落出現(xiàn)后1～2 周進行藥敏試驗。 制備菌液：在磨菌瓶中加入1～2 滴10%吐溫-80℃水溶液，用無菌吸管尖端刮取2～3 周新鮮菌落，置于磨菌瓶中。旋緊瓶蓋，在渦旋振蕩器上振蕩10～20 s。 靜置5 min，小心打開瓶蓋，加入約2 mL 滅菌生理鹽水，靜置片刻，使菌液中的大塊物質(zhì)沉淀。用無菌吸管吸取上部的菌液，約1 mL，轉(zhuǎn)移到另一無菌試管中，與標(biāo)準(zhǔn)買時比濁管比濁。 逐漸滴加滅菌生理鹽水，直至菌液濁與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁芤恢?，即得? mg/mL的菌液。 接種：在無菌帶有螺旋蓋的試管中以無菌手法加入2mL 滅菌生理鹽水備用，每株待測菌準(zhǔn)備2 管。菌液靜置，帶顆?；蚓鷫K沉淀。 用22 SWG 標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)2 滿環(huán)1 mg/mL 的菌液，平移至2 mL 滅菌生理鹽水中，即稀釋成1×10-2mg/mL 菌液。 用同樣方法再進行100 倍稀釋，即成1×10-4mg/mL 菌液。 用22 SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)分別取1 滿環(huán)1×10-2mg/mL 和1×10-4mg/mL的菌液，用劃線法均勻接種菌量為1×10-4mg 和1×10-6mg。接種后的培養(yǎng)基直立放置于恒溫培養(yǎng)內(nèi)，36℃培養(yǎng)，培養(yǎng)4 周后報告結(jié)果。

標(biāo)本符合以下特點可直接用于藥敏試驗：①出現(xiàn)肉眼可見菌落后1～2 周的新鮮菌落；②沒有其他污染菌共存；③涂片確認(rèn)為抗酸菌。

Xpert MTB/RIF 實驗：以1：2 的比例，往痰液標(biāo)本中加入處理液，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩15～30 s，室溫靜置15 min，使痰標(biāo)本充分液化。 再將混合液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)盒中，將反應(yīng)試劑盒放入Gene Xpert 儀器（美國Cepheid 公司生產(chǎn)）中，按說明書進行檢測，約2 h即可讀取結(jié)果。 結(jié)果判斷： 依照探針的循環(huán)閾值（Ct值），當(dāng)內(nèi)對照探針Ct 值≤38 時為陽性，反之則為無效， 提示標(biāo)本的DNA 提取不合格或含有PCR 抑制物。 5 個探針中至少2 個探針Ct 值≤38 即為檢測到MTB，可進一步按照Ct 值對MTB 進行半定量。Ct 值＜16 為高含量，Ct 值為16～22 為中等含量，Ct 值為22～28 為低含量，Ct 值＞28 為極低含量。 檢測利福平耐藥的基礎(chǔ)在于MTB 特異性分子信標(biāo)早期Ct 值和晚期Ct 值之差。 即△Ct 值。 系統(tǒng)設(shè)置的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為△Ct＞3.5 提示對利福平耐藥，△Ct＜3.5 提示對利福平敏感。由于終止循環(huán)數(shù)為38 個循環(huán)，因此當(dāng)早期探針Ct 值＞34.5 或晚期探針Ct 值＞38 時，利福平耐藥結(jié)果為不確定。 目前研究表明95%的利福平耐藥菌株在rpoB 基因81 bp 區(qū)域（RRDR）存在基因突變。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 痰涂片結(jié)果判定 按照中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會制訂的實驗室檢查規(guī)程進行[6-7]。①抗酸桿菌陰性（-）：連續(xù)觀察300 個不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。②報告抗酸桿菌菌素：1～8 條/300 個視野。③抗酸桿菌陽性（+）：每100 個視野發(fā)現(xiàn)3～9 條抗酸桿菌。④抗酸桿菌陽性（++）：每10 個視野發(fā)現(xiàn)1～9 條抗酸桿菌。⑤抗酸桿菌陽性（+++）：每個視野發(fā)現(xiàn)1～9 條抗酸桿菌。 ⑥抗酸桿菌陽性（++++）：每個視野發(fā)現(xiàn)平均10 條抗酸桿菌。

1.4.2 藥敏結(jié)果判定 （-）：無菌落生長；報告實際菌落數(shù)：＜50 個菌落；（+）：50～100 個菌落；（++）：100～200 個菌落；（+++）：大部分融合（200～500 個菌落）；（++++）：融合（＞500 個菌落）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。 Kappa＞0.4，表示兩種實驗檢驗一致性結(jié)果較好；Kappa＜0.4，表示檢驗結(jié)果一致性較差。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Xpert MTB/RIF 實驗與其他結(jié)核檢測方法的結(jié)果比較

結(jié)核組患者Xpert MTB/RIF 實驗檢測敏感性顯著高于液體培養(yǎng)（χ2=36.691，P = 0.000）和痰涂片（χ2=6.934，P = 0.008），與T-spot 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.347，P=0.541）。非結(jié)核組4 種方法特異性均較高且差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.346、0.346、1.012，P=0.557、0.557、0.314）。基于入組情況將患者分為肺結(jié)核、肺外結(jié)核進行分析，4 種檢測方法均表明肺結(jié)核組結(jié)核分枝桿菌檢測敏感性（Xpert MTB/RIF、T-spot 痰涂片、液體培養(yǎng)）明顯高于肺外結(jié)核組（χ2=8.915、5.880、7.142、7.457，P = 0.003、0.015、0.008、0.006）。 見表1。

表1 結(jié)核敏感性及非結(jié)核特異性比較[n（%）]

2.2 Xpert MTB/RIF 實驗與其他幾種檢測結(jié)果一致性的比較

Xpert MTB/RIF 實驗與T-spot 實驗檢出結(jié)果符合率為86.9%，一致性Kappa=0.737，一致性結(jié)果較好；Xpert MTB/RIF 實驗與痰涂片檢出結(jié)果符合率為61.2%，一致性Kappa=0.200，一致性結(jié)果較差；Xpert MTB/RIF 實驗與液體培養(yǎng)檢測結(jié)果符合率為78.5%，一致性Kappa=0.563，一致性結(jié)果較好。 見表2。

表2 Xpert MTB/RIF 實驗與痰涂片和液體培養(yǎng)檢測結(jié)果一致性的比較（例，n=237）

2.3 利福平耐藥檢測結(jié)果

在237 例可疑結(jié)核患者中，液體培養(yǎng)陽性有85 例，9 例Xpert MTB/RIF 實驗檢測失敗，共76 例可進行利福平耐藥檢測效能分析。傳統(tǒng)比例法藥敏實驗檢測出耐藥菌9 株，耐藥率為11.8%（9/76）。比例法耐藥的的患者標(biāo)本中，XpertX 系統(tǒng)檢測出8 株為耐藥菌，敏感性為88.9%，比例法藥敏實驗檢測敏感菌67 例中，有1 例Xpert 系統(tǒng)檢測出為耐藥菌，特異性為98.5%（66/67）。 見表3。

表3 利福平耐藥檢測結(jié)果（例，n=76）

3 討論

我國是世界上22 個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核病患者數(shù)量約500 萬例，居世界第二位，每年新增患者130 萬，死亡病例約13 萬例[8-11]?！?011 年中國衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒》資料顯示，在甲乙類法定報告?zhèn)魅静≈?，我國現(xiàn)階段結(jié)核病發(fā)病率為74.27/10 萬，僅次于病毒性肝炎，位居第二，其死亡率為0.22/10 萬，僅次于艾滋病，亦位居第二，而且發(fā)病人群以青壯年為主[12]。 結(jié)核病的疫情控制與結(jié)核病的早期發(fā)現(xiàn)、合理規(guī)范治療、管理密切相關(guān)。 盡管結(jié)核病的診斷水平有了很大提高，但傳統(tǒng)的結(jié)核病診斷方法依舊存在很多不足之處，嚴(yán)重影響結(jié)核病的診斷工作開展。 Xpert MTB/RIF實驗是針對結(jié)核分枝桿菌rpoB 基因利福平耐藥決定區(qū)設(shè)計引物、探針，檢測其是否發(fā)生突變[13-14]，2 h 內(nèi)即可診斷患者是否感染結(jié)核分枝桿菌以及耐藥性情況[15-16]。 本次研究旨在比較Xpert MTB/RIF 實驗與其他3 種檢測方法檢測結(jié)核分枝桿菌的效能，并以藥敏實驗為金標(biāo)準(zhǔn)，分析其檢測利福平耐藥的應(yīng)用價值。

本研究采用可疑結(jié)核患者血液、痰標(biāo)本分別進行T-spot 實驗、Xpert MTB/RIF 實驗、涂片鏡檢、液體培養(yǎng)以及傳統(tǒng)比例法藥敏實驗檢測患者是否感染結(jié)核分枝桿菌及其對利福平耐藥情況。 結(jié)果顯示，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF 實驗檢測結(jié)核分枝桿菌敏感性為56.9%，與國內(nèi)趙冰等[17]研究結(jié)果基本一致。 Xpert MTB/RIF 實驗檢測結(jié)核分枝桿菌敏感性略高于T-spot 實驗，明顯高于痰涂片鏡檢、液體培養(yǎng)。一致性檢驗結(jié)果表明，Xpert MTB/RIF 實驗與液體培養(yǎng)、T-spot 實驗檢測結(jié)果一致性較好。

研究表明將Xpert MTB/RIF 實驗檢測利福平耐藥情況應(yīng)用于耐藥高危人群（耐藥率＞20%）中開展，檢測結(jié)果更具有價值[17]。 以比例法藥敏實驗作為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF 實驗檢測利福平耐藥的敏感性為88.9%，特異性為98.5%，與既往的研究[18-19]結(jié)果基本一致。但敏感性低于Boehme 等[20]研究結(jié)果。由于本次研究中76 例培養(yǎng)陽性標(biāo)本進行藥敏實驗， 耐藥率僅為11.8%，目標(biāo)人群利福平耐藥率較低，敏感性過低可能是由于利福平耐藥患者過少所致。因此世界衛(wèi)生組織建議如果在利福平耐藥率較低人群中應(yīng)用Xpert MTB/RIF 檢測技術(shù)檢測利福平耐藥情況，檢測結(jié)果為耐藥，樣本仍需采用藥敏實驗進一步驗證Xpert檢測結(jié)果。

綜上所述，Xpert MTB/RIF 實驗操作簡單、檢測快速、敏感性高并且對實驗室要求較低，因此可以很好的輔助臨床醫(yī)生及時診斷目標(biāo)疾病，具有一定的使用前景。

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