惠 勇

黑龍江省牡丹江市第二人民醫(yī)院老年病科，黑龍江牡丹江 157011

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是常見的心血管疾病， 常伴有心血管系統(tǒng)血流動(dòng)力學(xué)障礙及神經(jīng)內(nèi)分泌代謝功能紊亂[1-2]。 世界范圍內(nèi)大約有15 億例CHF 患者，每年新增病例400 萬例[3]。現(xiàn)階段，CHF 是65 歲老人住院的主要原因[4]。 因此，尋找CHF安全有效的治療方法或治療藥物顯得尤為重要。白首烏C21甾苷能夠清除超氧陰離子自由基和羥自由基，是白首烏中的主要活性成分[5]，但是，其對(duì)CHF 的影響鮮見報(bào)道。 本研究旨在觀察白首烏C21甾苷對(duì)CHF大鼠左心室順應(yīng)性、微血管密度（MVD）、CD34+細(xì)胞動(dòng)員及胰島素樣生長因子-1 （insulin-like growth factor-1，IGF-1）表達(dá)的影響，為明確白首烏C21甾苷防治CHF 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)Wistar 系大鼠40 只，體重200～250 g，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：P00102012， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK （黑）2012-033。 飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境， 自由飲食，12 h 光照周期。 所有實(shí)驗(yàn)操作均遵守《中國動(dòng)物實(shí)用指南》。

1.2 白首烏C21 甾苷的提取

白首烏C21甾苷由牡丹江市第二人民醫(yī)院炮制室制備。經(jīng)紫外分光光度法分析，C21甾苷含量達(dá)65%左右（按孕甾烯醇酮計(jì)）。

1.3 方法

1.3.1 心肌梗死后CHF 模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 參照文獻(xiàn)[6-8] 方法實(shí)施左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎術(shù)建立CHF 模型。共成功建立CHF 模型17 只，成功率為56.7%。隨機(jī)分為兩組：模型組8 只，給予等體積生理鹽水；白首烏C21甾苷組9 只，參照文獻(xiàn)[9]并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給予白首烏C21甾苷1.0 g/kg。另設(shè)假手術(shù)組10只，開胸后在左冠狀動(dòng)脈前降支下方只穿線不結(jié)扎，等體積生理鹽水灌胃。 各組均為1 次/d 灌胃，共3 周。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù) 大鼠尾靜脈采血0.5 mL、枸櫞酸鈉抗凝、Pharmingen 染色緩沖液稀釋。取2 根試管，各加入100 μL 全血， 然后1 管加入20 μL PE/cy5 antimouse CD34， 另1 管加入20 μL anti-CD34-FITC 暗處孵育25 min 后，加入2 mL 紅細(xì)胞裂解液，混勻，上機(jī)分析，計(jì)數(shù)10 000 個(gè)細(xì)胞。Cell Quest Pro 軟件進(jìn)行分析CD34+細(xì)胞陽性率。

1.3.3 左心室舒張期壓力-容積曲線 大鼠斷頸處死、心包膜剪開、肺動(dòng)脈切斷、主動(dòng)脈插管、制備Langendorff 心臟。 通過貝朗Infusomat P 型容積輸液泵灌流改良KH（Krebs-Henseleit）灌流液。 由心尖部將雙腔心導(dǎo)管引入左心室，另一端連接HM10 高精度壓力傳感器。 把心臟放入37℃保溫槽，逆灌10 min，改為順灌10 min，穩(wěn)定10 min。 剪開左心耳，經(jīng)左心房將自制頂端有乳膠球囊的聚乙烯導(dǎo)管插入左心室，乳膠球囊注入37℃KH 液。 最初量為0.1 mL， 并以此量遞增，共7 次，終容積為0.7 mL，4 s/次。 SLY-B 四道生理記錄儀同步記錄不同球囊容積時(shí)左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張期末壓（LVEDP）、平均左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率（±dp/dtmax）。 以LVEDP 為縱坐標(biāo)，左心室球囊容積為橫坐標(biāo)，繪制左心室壓力-容積曲線，以此反映心肌舒張期順應(yīng)性[10-12]。 測(cè)定完成后，取心臟，剪去心房和血管組織，從心室處沿室間隔剪開，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 MVD 測(cè)量 心肌組織標(biāo)本4.0%多聚甲醛固定、石蠟包埋、蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡觀察。隨機(jī)選擇3 個(gè)高倍視野進(jìn)行拍照。Image-pro Plus 6.0 軟件系統(tǒng)進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，取其平均值。

1.3.5 Western blot 分析 心肌組織標(biāo)本在蛋白酶抑制劑存在下勻漿，以獲得蛋白提取物。 Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。 95℃變性5 min，隨后進(jìn)行電泳。 電泳后，電轉(zhuǎn)至0.45 μm 硝酸纖維素膜，5%的脫脂奶粉PBST 封閉1 h，分別加入抗IGF-1 抗體（1∶2000 稀釋）4℃孵育過夜。 加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶2000 稀釋）室溫孵育2 h。 按同樣的方法與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體孵育。 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯色，通過Bio-Rad 凝膠成像進(jìn)行目的條帶的表達(dá)檢測(cè)及分析。蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度=目標(biāo)蛋白表達(dá)強(qiáng)度/GAPDH 蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

1.3.6 Real-Time PCR 分析 按照Trizol 試劑盒說明書抽提總RNA。 Nanodrop 2000 檢測(cè)RNA 純度。 使用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（reverse transcriptase kit promega，Japan）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成單鏈的cDNA，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。 利用PubMed 查找相關(guān)基因序列，并利用引物合成軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。 使用Quant SYBR Green PCR kit 按照PCR 引物進(jìn)行擴(kuò)增，用Applied Biosystems 7500 型定量PCR 儀測(cè)出ΔC 值及熔解曲線，計(jì)算出相對(duì)基因表達(dá)量。 每份樣品檢測(cè)3 次。

表1 Real-Time PCR 序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad 5.0 軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t 檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)采用單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠左心室舒張期壓力-容積曲線

隨著左心室球囊容積的逐漸遞增，與假手術(shù)組比較，模型組左心室順應(yīng)性下降（P ＜0.05）。 白首烏C21甾苷組可見曲線較模型組向左上移位 （P ＜0.05），說明白首烏C21甾苷可改善CHF 大鼠左心室心肌順應(yīng)性。 見圖1。

圖1 各組大鼠左心室舒張期壓力-容積曲線

2.2 各組大鼠心肌組織MVD 比較

與假手術(shù)組比較，模型組MVD 明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與模型組比較，白首烏C21甾苷組MVD 明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），說明白首烏C21甾苷促進(jìn)CHF 大鼠新生血管的形成。 見表2。

表2 各組大鼠心肌組織MVD 比較（血管數(shù)/mm2，±s）

表2 各組大鼠心肌組織MVD 比較（血管數(shù)/mm2，±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，＃P ＜0.05；MVD：微血管密度

組別 只數(shù) MVD假手術(shù)組模型組白首烏C21 甾苷組10 89 0.173±0.042 0.018±0.005*0.146±0.037＃

2.3 各組大鼠CD34+細(xì)胞陽性率比較

與假手術(shù)組比較，模型組的CD34+細(xì)胞陽性率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與模型組比較，白首烏C21甾苷組的CD34+細(xì)胞陽性率升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.05）， 說明白首烏C21甾苷可增強(qiáng)CD34+細(xì)胞動(dòng)員到外周血。 見表3。

表3 各組大鼠CD34+細(xì)胞陽性率比較（%，±s）

表3 各組大鼠CD34+細(xì)胞陽性率比較（%，±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，＃P ＜0.05

組別 只數(shù) CD34+細(xì)胞陽性率假手術(shù)組模型組白首烏C21 甾苷組10 89 43.71±11.26 52.87±13.28*68.21±17.11＃

2.4 各組大鼠IGF-1 Western blot 分析結(jié)果

與模型組比較，白首烏C21甾苷組IGF-1 表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 見圖2。

圖2 各組大鼠IGF-1 Western blot 分析結(jié)果

2.5 各組大鼠IGF-1 mRNA Real-Time PCR 分析結(jié)果

與模型組比較，白首烏C21甾苷組的IGF-1 mRNA表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠IGF-1 mRNA Real-Time PCR 分析結(jié)果

3 討論

CHF 是各種心臟疾病的終末階段，是各種心臟病變引起心臟功能和結(jié)構(gòu)的變化，最后導(dǎo)致心室泵血功能低下的臨床綜合征[13-16]。 本研究結(jié)果表明，白首烏C21甾苷可有效改善CHF 大鼠左心室順應(yīng)性，說明其對(duì)衰竭心肌有明顯的保護(hù)作用。

CD34+細(xì)胞是血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞的共同標(biāo)志物，而且是目前公認(rèn)的外周血骨髓干細(xì)胞的標(biāo)志物[17]。 CD34+細(xì)胞能分化為內(nèi)皮細(xì)胞，定向遷移到缺血或損傷部位并參與局部的血管新生[18]。 另有研究表明，IGF-1 在CD34+細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化中也起著十分重要的作用[19]。IGF-1 是重要的心源性激素，發(fā)揮類似胰島素的作用， 在新生血管的形成過程中，起決定性的作用，表現(xiàn)為表達(dá)增強(qiáng)[20]。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白首烏C21甾苷可使CHF 大鼠MVD 顯著增高， 說明其可促進(jìn)新生血管的形成。 為確定其可能機(jī)制，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了外周血CD34+細(xì)胞的陽性細(xì)胞百分率。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白首烏C21甾苷可使CD34+細(xì)胞動(dòng)員至外周血增加，提示其促新生血管形成的作用可能與動(dòng)員CD34+細(xì)胞至外周血有關(guān)。 進(jìn)一步采用Western blot 和Real-Time PCR 分析檢測(cè)了IGF-1 蛋白和IGF-1 mRNA 的表達(dá)， 發(fā)現(xiàn)白首烏C21甾苷可使IGF-1 蛋白和IGF-1 mRNA 呈高表達(dá)。 因此，認(rèn)為白首烏C21甾苷促進(jìn)新生血管的形成機(jī)制可能是其使IGF-1 誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞動(dòng)員至外周血， 從而促進(jìn)新生血管的形成。

綜上所述，白首烏C21甾苷可有效改善CHF 大鼠左心室順應(yīng)性，對(duì)衰竭心肌有明顯的保護(hù)作用。 同時(shí)白首烏C21甾苷促進(jìn)新生血管的形成， 其機(jī)制可能與IGF-1 誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞動(dòng)員至外周血有關(guān)。

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