范世光，顧鵬毅，趙蔓嘉，汪佳慧，張瀟木，劉國棟，梁再賦，孫晉民（中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心一部暨國家中醫(yī)藥管理局中藥生物工程實(shí)驗(yàn)室Ⅲ級，沈陽 110001）

微量法在蚯蚓粗提物蛋白質(zhì)量濃度和蚓激酶活性測定中的應(yīng)用

范世光，顧鵬毅，趙蔓嘉，汪佳慧，張瀟木，劉國棟，梁再賦，孫晉民＊（中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心一部暨國家中醫(yī)藥管理局中藥生物工程實(shí)驗(yàn)室Ⅲ級，沈陽 110001）

目的 探討微孔板酶聯(lián)比色測定法在蚯蚓粗提物蛋白質(zhì)量濃度、蚓激酶活性測定中的應(yīng)用。方法 蛋白質(zhì)量濃度采用改良Lowry法，蚓激酶活性采用TAME法，分別使用常量體積和微量體積，用紫外－可見分光光度計(jì)和酶標(biāo)檢測儀進(jìn)行測量，用SPSS軟件進(jìn)行直線擬合，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，比較測量結(jié)果。結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)曲線截距RSD＜5%，用標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測BSA的結(jié)果顯示，2種質(zhì)量濃度、2種方法的回收率分別為99.6%，94.6%，101.2%和96.5%，RSD分別為3.30%，5.05%，3.36%和2.59%，經(jīng)t檢驗(yàn)3種檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以認(rèn)為2種檢測方法測得的數(shù)據(jù)一致。結(jié)論 可以采用微量法進(jìn)行蚯蚓粗提物蛋白質(zhì)量濃度、蚓激酶活性的測定。

蛋白質(zhì)量濃度；蚓激酶活性；微量法；常量法

地龍又稱蚯蚓，是我國傳統(tǒng)的中藥材之一。因其廣泛的藥理作用，可用于治療多種疾病。目前，已從地龍?bào)w內(nèi)提取了多種具有生物活性的物質(zhì)，如蚓激酶、纖維蛋白溶解酶、地龍免疫活性肽、過氧化物歧化酶、金屬硫蛋白及抗腫瘤成分、糖脂蛋白G－90等［14］。在對蚯蚓活性物質(zhì)的提取工藝研究中，往往采用正交設(shè)計(jì)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)，樣品相對較多，用常規(guī)方法操作時間較長，且試劑消耗較多，尤其在一些微量樣品的操作中尤為不便，因此，我們采用微量法代替常量法，以期在較短時間內(nèi)獲得大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高速勻漿機(jī)（WARING 24CB9EC）；高速冷凍離心機(jī)（HITACHI himac CR21GⅡ）；紫外－可見分光光度計(jì)（SHIMADZU UV－1601）；酶標(biāo)檢測儀（TECAN infinite200PRO）等。

1.2 試藥 鮮蚯蚓（遼中）；Lowry蛋白試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號：20141017）；BSA（Solarbio）；對甲基苯磺酰－L－精氨酸甲酯（TAME，上海生物制品研究所）；堿性羥胺、氯化鐵（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法

2.1 樣品制備 將所購買的新鮮蚯蚓洗凈，每個樣品稱取20g，加磷酸鹽緩沖液20mL，勻漿，中速18 300r·min－1×30s；2次，高速20 000r·min－1×30s；2次，每個樣品取2mL，以10 000r·min－1離心30min，收集上清。

2.2 蛋白含量測定 樣品用磷酸鹽緩沖液200～400倍稀釋，紫外－可見分光光度計(jì)及酶標(biāo)儀選用波長620nm。常量法測定按試劑盒說明書操作，反應(yīng)體系1.3mL。微量法按表1在96孔板中進(jìn)行操作，反應(yīng)體系260μL。

2.3 蚓激酶酶活性測定 樣品用磷酸鹽緩沖液10～100倍稀釋，紫外－可見分光光度計(jì)及酶標(biāo)儀選用波長492nm。常量法測定按表2進(jìn)行，反應(yīng)體系6 mL，樣品取0.5mL＋Tris－HCl 0.5mL＋TAME 1 mL。微量法按表3在96孔板中進(jìn)行操作，反應(yīng)體系300μL，樣品取25μL＋Tris－HCl 25μL＋TAME 50μL。

表1 微量法蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品測定方法Tab.1 Standard curve and sample measuring of trace method for protein determination μL

表2 常量法蚓激酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品測定方法Tab.2 Standard curve and sample measuring for lumbrokinase activity by constant method mL

表3 微量法蚓激酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品測定方法Tab.3 Standard curve and sample measuring of lumbrokinase of trace method μL

每分鐘水解1μmol的蚓激酶量為1個TAME活力單位。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理采用SPSS19.0軟件，進(jìn)行相關(guān)分析、直線擬合和t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 常量法蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y＝1.021 X＋0.006 9（r＝0.998 6），微量法蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y＝0.951 8 X＋0.004 4（r＝0.998 5）。常量法TAME標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y＝0.103 9 X＋0.025 1（r＝0.996 4），常量法TAME標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y＝2.221 X＋0.010 8（r＝0.999 4）。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗(yàn)證

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線截距的分析 常量法蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線截距為0.006 8±0.002，RSD為0.17%，微量法蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線截距為0.004 4±0.011，RSD為0.96%；常量法TAME標(biāo)準(zhǔn)曲線截距為0.025 1± 0.051，RSD為2.11%，微量法TAME標(biāo)準(zhǔn)曲線截距為0.010 8±0.043，RSD為1.99%。

3.2.2 準(zhǔn)確度與回收率 配制0.05和0.20 mg·mL－1的BSA溶液，用常量法和微量法測得結(jié)果，見表4，結(jié)果顯示2種方法具有較高的回收率，該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

3.2.3 精密度 2種方法的變異系數(shù)均較小，說明2種方法測定結(jié)果有較好的重復(fù)性，見表4。

表4 2種方法檢測不同質(zhì)量濃度BSA的結(jié)果Tab.4 The results of the different concentrations BSA determination by the two methods （n＝5）

3.3 蚯蚓粗提物的蛋白質(zhì)量濃度和蚓激酶酶活性測定 蚯蚓粗提物蛋白質(zhì)量濃度、蚓激酶活性測量結(jié)果的分析，隨機(jī)取2份樣品，重復(fù)測量3次，用2種方法分別進(jìn)行蛋白質(zhì)量濃度和蚓激酶活性檢測，見表5，經(jīng)t檢驗(yàn)，尚不能認(rèn)為2種檢測方法結(jié)果不同（P＞0.05）［5］。

表5 測定結(jié)果的相關(guān)性分析Tab.5 Correlation analysis of the measured results

4 討論

比色測定法又稱分光光度法，是測定生化物質(zhì)含量的常用方法，也是傳統(tǒng)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中非常重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作在比色測定法中具有非常重要的作用［6］。蛋白質(zhì)含量的測定是生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的實(shí)驗(yàn)方法之一。目前常用的技術(shù)有改良Lowry法、Bradford法和紫外－可見分光光度法，操作雖然簡單易行，但各有其不足之處，缺乏可比性［79］。因此，本課題組在對蚯蚓粗提物研究的工作中進(jìn)行了一些改進(jìn)，建立了微孔板酶聯(lián)儀比色測定法。蚓激酶含有多種氨基酸，不僅能直接作用于纖維蛋白，還能使殘留在纖維蛋白原中的纖維蛋白溶酶原激活成纖維蛋白溶酶。由于其為蛋白水解酶類，對精氨酸羧端肽有較強(qiáng)的切割作用，故選用底物對甲基苯磺酰－L－精氨酸甲酯（TAME）測定法［10］。

蚯蚓提取物有效成分常是蛋白質(zhì)和大量多肽的混合物，所以在進(jìn)行蚯蚓提取物中蛋白質(zhì)含量測定時，為了能夠更加精確、真實(shí)地反映出其蛋白質(zhì)的量，應(yīng)該使用改良Lowry法。同時，對于其他的生物供試品在蛋白質(zhì)含量測定方法選擇時具有一定的參考價值［11－12］。

微孔板法有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）樣本、試劑用量少；（2）檢測大批量樣本時，大大地減少了操作時間；（3）利用自動酶標(biāo)儀一次性讀取各孔光密度，縮短了檢測時間。我們認(rèn)為該方法重復(fù)性好、測量結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡便快速，是值得推廣應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法。

［1］Hwan Cho，Eui Sung Choi，Hun Gil Lim，et al.Purification and characterization of six fibrinolytic serine－proteases from Earthworm Lumbricus rubellus［J］.2004，37（2）：199－205.

［2］Yung－Ming Chang，Wei－Yi Chi，Tung－Yuan Lai，et al.Dilong：role in peripheral nerve regeneration［J］.2011，2011：380809.

［3］Edwin L Cooper，Mariappan Balamurugan，Chih－Yang

Huang，et al.Earthworms Dilong：ancient，inexpen－sive，noncontroversial models may help clarify approaches to integrated medicine emphasizing neuroimmune systems［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012：164152.

［4］滕文嬌，孫晉民.蚓激酶的藥學(xué)與臨床研究進(jìn)展［J］.西北藥學(xué)雜志，2011，26（1）：69－72.

［5］楊范莉，宋立強(qiáng).HPLC法同時測定黃芪中4種成分的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2012，27（6）：526－527.

［6］楊澤民，羅少洪，李明.關(guān)于比色測定法中標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的思考［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，18（5）：78－80.

［7］薛輝，顏光濤，林季.微孔板比色測定法在微量蛋白測定中的意義［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，28（5）：399－401.

［8］李海玲，彭書明，李凜，等.4種常用蛋白濃度測定方法的比較［J］.中國生化藥物雜志，2008，29（4）：277－278，282.

［9］閆萍，牛勃，張悅紅，等.蚯蚓提取物中蛋白質(zhì)含量測定方法的研究［J］.中國生化藥物雜志，2007，28（1）：27－29.

［10］郝蘇麗，張林可，徐康森.以TAME為底物測定蚓激酶效價［J］.藥物分析雜志，1995，15（3）：39－41.

［11］賀葵邦，王英姿，張春泥，等.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選地龍水提取工藝［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（6）：33－35.

［12］陳國梅.總磷測定中標(biāo)準(zhǔn)曲線與工作曲線的比較［J］.福建分析測試，2009，19（1）：76－77，82.

Application of trace method in the determination of earthworm crude protein concentration and earthworm kinase activity

FAN Shiguang，GU Pengyi，ZHAO Manjia，WANG Jiahui，ZHANG Xiaomu，LIU Guodong，LIANG Zaifu，SUN Jinmin＊
（The Center of Laboratory Technology and Experimental Medicine，China Medical University，State Administration of Traditional Chinese Medicine Biological Engineering Research Laboratory GradeⅢ，Shenyang 110001，China）

Objective To investigate and compare the application of microplate enzyme－linked colorimetric assay in protein concentration determination，and the kinase activity in earthworm crude extracts.Methods The protein concentration was determined by using the improved Lowry method，and the kinase activity was determined by using the TAME method.The constant volume and micro volume were tested respectively，in UV－VIS spectrophotometer or enzyme measurement standard detector.SPSS softwarewas used to make the standard curve.Results The standard curve intercept RSD was less than 5%.Two concentration curves was used for BSA detection.The recovery of the two methods were 99.6%，94.6%，101.2%and 96.5%，respectivly，and RSD were 3.30%，5.05%，3.36%and 2.59%，respectivly.No statistical significance was observed.Conclusion The microplate assay method could be used for the protein concentration and the kinase activity determination.

protein concentration；lumbrokinase activity；trace method；constant method

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.002

R284

A

1004－2407（2015）04－0334－04

2015－03－02）

遼寧省科技廳課題項(xiàng)目（編號：2013225021）；遼寧省科技廳課題項(xiàng)目（編號：2008225021－1）

范世光，男，助理實(shí)驗(yàn)師

＊通信作者：孫晉民，女，教授，碩士生導(dǎo)師