駱 言， 黃學(xué)寬， 熊維建， 張超男， 蔣 娟， 萬 磊， 王 玲

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶401331；2.重慶市中醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶401331）

復(fù)腎功方對慢性腎功能衰竭大鼠腎功能的影響

駱 言1，2， 黃學(xué)寬1*， 熊維建2， 張超男1， 蔣 娟1， 萬 磊1， 王 玲1

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶401331；2.重慶市中醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶401331）

目的通過客觀的指標(biāo)和電鏡下腎組織病理變化情況，探討國醫(yī)大師郭子光的復(fù)腎功方對慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）大鼠腎組織的影響。方法SD雌性大鼠50只，隨機分為正常組、模型組、復(fù)腎功方高劑量組、復(fù)腎功方中劑量組、復(fù)腎功方低劑量組。正常組常規(guī)喂養(yǎng)，其余4組給予5%腺嘌呤飼料喂養(yǎng)制作CRF大鼠模型，持續(xù)喂養(yǎng)21 d。造模成功后，正常組和模型組予以生理鹽水按每天20 mL/kg體質(zhì)量的劑量灌胃，復(fù)腎功方組予以復(fù)腎功方高中低組分別按每天30、20、10 mL/kg的劑量進行治療，連續(xù)喂養(yǎng)30 d。檢測各組大鼠血肌酐 （Scr）、血尿素氮 （BUN）水平，在電鏡下觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)形態(tài)變化。結(jié)果與正常組相比，模型組血尿素氮，肌酐均增高 （P＜0.05），與模型組相比，復(fù)腎功方組血尿素氮，肌酐表達均降低 （P＜0.05）；在電鏡下，模型組均有不同程度腎損傷，復(fù)腎功方高中低組損傷相對模型組較輕。結(jié)論復(fù)腎功方可明顯改善CRF大鼠模型腎臟功能，減輕腎損傷，抑制慢性腎衰竭的發(fā)生。

慢性腎功能衰竭；復(fù)腎功方；血尿素氮；肌酐；電鏡

復(fù)腎功方是首屆國醫(yī)大師郭子光教授經(jīng)過60年來臨床實踐總結(jié)出來的經(jīng)驗方，具有調(diào)理氣血、活血化濕、利尿通絡(luò)之功，治療早中期慢性腎功能衰竭確有療效。慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是以慢性進行性腎實質(zhì)損害而導(dǎo)致的嚴(yán)重代謝紊亂，可導(dǎo)致腎臟萎縮，腎臟功能減退。臨床以代謝產(chǎn)物潴留，酸堿失衡，水電解質(zhì)紊亂及全身各系統(tǒng)受損為主要表現(xiàn)的臨床綜合征［1］。西醫(yī)對于終末期慢性腎衰竭采用透析腎移植等治療方法，但是透析腎移植均不能用于治療早中期慢性腎衰竭。郭老的復(fù)腎功方在臨床上療效顯著，他很多學(xué)生對其進行了總結(jié)和歸納［2-3］，本實驗主要通過造腎功能衰竭大鼠模型，通過客觀的指標(biāo)和電鏡下［4-5］腎組織病理變化情況探討復(fù)腎功方的作用，希望為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SD雌性大鼠50只 （生產(chǎn)許可證號SCXK渝2007-0001），由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，體重為（200±10）g。

1.2 主要藥品與試劑 復(fù)腎功方由黃芪、水蛭、車前子、牛膝、丹皮、澤瀉、茯苓、山茱萸、山藥、生地、杜仲、黃柏、蒼術(shù)等中藥組成，原藥購自重慶西部醫(yī)藥商城，經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院黃學(xué)寬教授鑒定，按常規(guī)方法自制煎劑 （即冷水浸30 min，煮沸后煎30 min，共煎3次，合并藥液，濃縮為含生藥1.0 g/mL）。腺嘌呤 （北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號0183-50），SCr、BUN試劑盒 （南京建成科技有限公司，批號20121101）。

2 方法

2.1 分組、造模與治療 雌性SD大鼠50只適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為正常組、模型組、復(fù)腎功方高劑量組、復(fù)腎功方中劑量組、復(fù)腎功方低劑量組，每組各10只。正常組給予普通飼料，其余兩組給予5%腺嘌呤飼料［6-7］（5%腺嘌呤，95%普通飼料），自由進食，造模21 d。造模成功后，將5%腺嘌呤飼料換成普通飼料，正常組與模型組予以生理鹽水按20 mL/kg的劑量進行灌胃，按照 《實驗藥理學(xué)》換算大鼠用藥量［8］，復(fù)腎功方組予以復(fù)腎功方按高劑量組30 mL/kg，中劑量組20 mL/kg，低劑量組10 m L/kg體質(zhì)量進行灌胃，持續(xù)治療30 d。

2.2 指標(biāo)檢測 觀察一般情況：大鼠攝食和飲水量，觀察大鼠毛發(fā)及活動等。

BUN、SCr檢測：治療30 d后禁食禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，心臟取血，常溫靜置1 h，3 500 r/m in離心5 min，取上清液以備用，根據(jù)試劑盒說明書操作檢測SCr、BUN水平。

腎組織電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)：取新鮮的腎組織腎皮質(zhì)部分切成2 mm3小塊，經(jīng)2.5%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂618包埋，超薄切片后醋酸鈾-檸檬酸鉛染色KYKY AMRAY-100B型透射電鏡下觀察［9］腎組織的超微結(jié)構(gòu)。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行，所得數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差 （）表示，組間比較采用單因素方差分析方法分析，組間兩兩比較采用LSD方法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 與正常組比較，模型組大鼠出現(xiàn)萎靡、少動、脫毛、卷曲弓背、食欲減弱、體重下降等現(xiàn)象；與模型組相比，復(fù)腎功方高中低3組大鼠活動量相對增多，脫毛、飲食等有所改善 （表1）。

表1 實驗結(jié)束時各組大鼠攝食和飲水 （）

表1 實驗結(jié)束時各組大鼠攝食和飲水 （）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與高劑量組比較，★P＜0.05；與中劑量組比較，○P＜0.05

組別 動物數(shù) 攝食/g造模前15 d 30 d正常組15 d 30 d飲水/m L造模前10 25.6±0.8 29.4±0.9 34.5±0.4 36.5±4.5 39.5±4.9 43.3±5.1模型組 10 18.6±0.4 20.4±0.5* 21.3±1.1* 35.4±3.2* 49.8±5.4* 64.3±7.6*復(fù)腎功方高劑量組 10 18.4±0.5 28.6±0.6*△ 32.3±1.2*△ 37.8±4.6*△ 46.1±3.2*△ 49.4±6.5*△復(fù)腎功方中劑量組 10 18.0±0.3 27.4±1.2*△★ 30.4±0.7*△★ 36.1±5.6*△★ 48.9±4.3*△★ 53.7±5.5*△★復(fù)腎功方低劑量組 10 19.0±0.3 25.5±0.7*△★○ 28.1±0.8*△★○ 37.2±6.3*△★○ 49.0±5.0*△★○ 40.7±6.6*△★○

3.2 大鼠血肌肝 （SCr）、血尿素氮 （BUN）的檢測 與正常組比較，模型組大鼠SCr、BUN含量顯著增高 （P＜0.05）；與模型組比較，復(fù)腎功方高中低3組大鼠SCr、BUN含量顯著降低（P＜0.05），復(fù)腎方高、中劑量組SCr、BUN含量顯著低于低劑量組 （P＜0.05），與復(fù)腎功方中劑量比較，高劑量組SCr、BUN明顯降低 （P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠SCr及BUN含量變化（）

表2 各組大鼠SCr及BUN含量變化（）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與高劑量組比較，★P＜0.05；與中劑量組比較，○P＜0.05

組別 動物數(shù) SCr/（μmol·L-1）BUN/（mmol·L-1）造模前 造模后正常組造模前 造模后10 58.30±8.56 64.75±8.44 7.47±0.93 7.55±1.30模型組 10 58.08±8.19 120.49±21.77* 6.95±1.18 22.90±3.31*復(fù)腎功方高劑量組 10 60.26±9.62 80.23±9.36*△ 7.23±1.28 10.71±1.81*△復(fù)腎功方中劑量組 10 61.75±10.06 92.57±7.4*△★ 7.23±1.28 13.38±2.97*△★復(fù)腎功方低劑量組 10 59.88±12.17 103.84±6.77*△★○ 7.23±1.50 16.82±3.04*△★○

3.3 組織形態(tài) 正常組大鼠腎小球基底膜內(nèi)、中、外三層結(jié)構(gòu)清晰完整，內(nèi)皮細胞，足突形態(tài)，系膜細胞排列整齊，未見異常。模型組多數(shù)腎小球系膜基底明顯增多，系膜增生肥大，系膜區(qū)增寬，足細胞凸起增大，部分融合，尿間隙見紅細胞，溶酶體部分變性，血管內(nèi)皮細胞未見明顯腫脹變性。復(fù)方高中低各組系膜稍增生，并不明顯，足突極少增大融合。見圖1。

4 討論

CRF屬中醫(yī) “關(guān)格”、“虛損”、“水腫”等范疇，郭教授認(rèn)為CRF系由多種慢性疾病遷延發(fā)展而致，濕熱瘀血互結(jié)是造成病情惡化的根本病理特點，病機可歸納為 “虛、痰、瘀、毒”四個方面，“虛”是根本，“痰”、“瘀”是病理基礎(chǔ)，而 “毒”是加重因素［10］。即氣血失調(diào)、痰瘀阻絡(luò)是其發(fā)病的基本病理。而在疾病的早中期，以肺腎虛損（兼濕濁瘀阻）為主要病機，以致于臟腑平衡功能失調(diào)，成為五臟漸次受損的重要環(huán)節(jié)［11］。基于以上理論，郭教授創(chuàng)制出復(fù)腎功方，主要用于慢性腎功能不全一、二期 （代償期、失代償期）的非替代療法，經(jīng)多年臨床驗證，療效確切，許多病例表明，抓緊治療可逆轉(zhuǎn)腎功能 （尤以高血壓腎損害和糖尿病腎病等為優(yōu)），而免予替代療法 （透析、換腎）［11］。

復(fù)腎功方是國醫(yī)大師郭子光教授經(jīng)過60余年臨床驗證總結(jié)出來的療效確切的經(jīng)驗方。本方根據(jù)氣血失調(diào)、臟腑虛衰、痰瘀阻絡(luò)這一病機創(chuàng)立，由黃芪、水蛭、車前子、牛膝、丹皮、澤瀉、茯苓、山茱萸、山藥、生地、杜仲、黃柏、蒼術(shù)等組成?，F(xiàn)代藥理研究證實，方中黃芪具有利尿、降低尿蛋白、提高免疫力、調(diào)節(jié)血壓等作用；水蛭有抗凝、抗血小板聚集、抗血栓等作用，能改善血液流變性，且有降脂作用，對慢性腎炎循環(huán)免疫復(fù)合物還有清除作用；車前子有利尿作用，可抑制腎臟草酸鈣結(jié)晶的沉積和抑制腎臟Na+、K+-ATP酶的活性；牛膝所含甾體類激素有增強腎臟蛋白質(zhì)合成等作用；丹皮有抗凝、抗血栓、抗炎等作用；澤瀉有利尿作用，澤瀉流浸膏能減輕硝酸甘油所致慢性腎炎模型兔中尿素和膽固醇的滯留，澤瀉乙醇提取物還具有劑量依賴性的抑制腎臟Na+、K+-ATP酶的活性；茯苓有利尿作用；山茱萸、山藥、生地均有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血壓、提高免疫力等作用；杜仲有抗炎、利尿、調(diào)節(jié)免疫等作用；黃柏有抗炎、降壓、降低血尿酸等作用；蒼術(shù)有抗菌、降糖等功效［12］。從全方不同藥味藥理作用來看，這些藥物都具有保護腎功能、改善腎血流量、抗炎等作用。

腺嘌呤是一種含氮雜環(huán)的嘌呤類化合物，其在體內(nèi)可生成2，8-二羥基腺嘌呤，其最終產(chǎn)物結(jié)晶沉淀于腎間質(zhì)及腎小管，可引起腎間質(zhì)纖維化、腎小管腔囊狀擴張、腎小管堵塞等，進而造成SCr、BUN等含量異常，最終導(dǎo)致CRF［13-14］。

圖1 各組大鼠腎組織電鏡觀察結(jié)果 （×10000）

血肌酐 （SCr）和尿 （BUN）［15］者分別為含氮有機物和蛋白質(zhì)代謝的中末產(chǎn)物，因此血中肌酐、尿素氮在一定程度上可以反映腎小球濾過功能的損害程度，是反映慢性腎衰竭的進展重要標(biāo)志之一［16-17］。

隨著電鏡診斷應(yīng)用到腎活檢病理檢查中，腎活檢診斷逐漸完善。近年來隨著醫(yī)學(xué)發(fā)展及腎臟病診斷及治療的需要，電鏡下腎皮質(zhì)組織的微小病變更加明顯［18］。本實驗在透射電子顯微鏡觀察下，模型組有細胞膜基質(zhì)增厚，足突扁平，融合等情況。模型組腎小球系膜增生肥大提示蛋白尿，系膜區(qū)增寬，間隙見紅細胞，提示血尿，足細胞節(jié)段性融合。復(fù)方高中低各組系膜稍增生，并不明顯，足突極少增大融合。結(jié)果顯示經(jīng)過復(fù)腎功方的治療后，慢性腎衰竭模型大鼠，微結(jié)構(gòu)形態(tài)變化得以改善。綜上所述，復(fù)腎功方對腎功能起到保護作用。

關(guān)于實驗的不足之處：對于腎功衰大鼠治療的不同劑量受試物的藥效及其強度比較和評判，顯微鏡檢查可能更有效，兩者能結(jié)合更佳評判，在下一步相關(guān)實驗中我們會做進一步改進。另外，可以設(shè)陽性藥物對照組，更客觀地反應(yīng)復(fù)腎功方的作用效果。

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R285.5

B

1001-1528（2015）04-0870-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.040

2014-02-12

重慶市衛(wèi)生局科技項目 （2010-2-25）

駱 言（1986—），女，碩士生，主要從事中醫(yī)藥學(xué)基礎(chǔ)研究及臨床。Tel：15123898560，E-mail：summerwaiwai@163.com

*通信作者：黃學(xué)寬 （1972—），男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論研究及臨床。Tel：13452382058，E-mail：xkhuang2002@163.com