李卉　王艷　王海宏　梁珂珂　李建龍

摘 要：通過構建高羊茅高溫脅迫下的消減文庫，并使用斑點印跡技術從中篩選出差異表達基因，以期深入研究高羊茅適應高溫的分子機制。以冷季型草坪草高羊茅為研究對象，在兩年生理指標測定的基礎上通過構建高羊茅在高溫脅迫下的SSH文庫，分別以正、反向SSH探針與尼龍膜上的消減cDNA質粒進行雜交，并經(jīng)相應的顯色反應得到雜交信號，比較了38/30 °C（晝/夜）的培養(yǎng)箱中高溫脅迫6 h的高羊茅葉片和對照組高羊茅葉片的RNA差異。結果表明：試驗得到的差減文庫中大量組成型表達基因已經(jīng)被有效去除，使某些特有的差異基因得到了富集；利用斑點雜交共得到252個差異片段，庫中陽性克隆約占50%以上；陽性克隆中91個為上調基因，161個為下調基因，這些與高羊茅的耐熱性密切相關的基因即為試驗所尋的差異表達基因。本試驗為找出高羊茅耐熱相關基因奠定了基礎，為草坪草的轉基因育種工作提供了相關依據(jù)，結合恰當?shù)乃收{控措施可有效提高草坪草的抗逆性。

關鍵詞：高溫脅迫；逆境生理；差異表達基因；抑制差減雜交；斑點印跡技術；陽性克隆

中圖分類號：S688.4 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.01.001

隨著經(jīng)濟的高速發(fā)展和城市化水平的不斷提高，人們的健康意識和審美意識不斷提高，使得城市綠化越來越受到重視。草坪作為一種優(yōu)良的綠化材料，種植面積迅速擴大。草坪草可分為暖季型草坪草和冷季型草坪草。其中，在寒冷條件下能正常生長發(fā)育的草坪草就是冷季型草坪草，常見于溫帶和副極帶地區(qū)，如早熟禾（Poa Prateusis）、黑麥草（Lolium perenne）、剪股穎（Agrostis tenui）和羊茅（Festuca avina）等。其生長的最適溫度為15～24 ℃，高于30 ℃一般會出現(xiàn)夏季枯黃和死亡現(xiàn)象。冷季型草坪草的綠期相對較長，但隨著全球氣溫的升高以及城市熱島效應的日益凸顯，越夏就成了冷季型優(yōu)良草坪草品種亟需解決的問題。如何提高冷季型草坪草的抗熱性顯得尤為重要，因此，研究草坪草的高溫脅迫機理特別是其生理機制和分子機制對于鑒定和選育耐熱的冷季型草坪草具有重要的理論和實踐意義。當植物受到低溫或者高溫脅迫時，正常的生理過程受到干擾，細胞代謝紊亂，生長被抑制。但是植物也可以通過應激反應延緩或者阻止傷害的發(fā)生，這就為人們通過各種管理和調控措施改善草坪草的抗熱性和抗寒性提供了可能性。對于逆境生理和抗性調控機理的研究可以更詳細地了解草坪草的生理特性，為草坪草的建植、養(yǎng)護和管理，以及新品種的選育提供堅實的理論基礎。

冷季型草坪草抗熱性有相關研究主要從生理生態(tài)學角度對比熱敏感和耐熱植株在高溫脅迫下的形態(tài)和生理指標，以及植株在熱脅迫前后的生理生態(tài)變化，通過一些物理、化學等手段，改善草坪草的耐熱性，例如管理措施（覆蓋、澆水、修剪等）、抗性鍛煉、施肥、施用生長調節(jié)劑和育種等。然而基因才是真正調控植物對環(huán)境響應方式的物質，因此，草坪草耐熱性相關基因必然成為深入研究草坪草耐熱性的關鍵和熱點。目前，分離并克隆草坪草抗逆基因的研究已有部分報道。李廣存等[1]對草坪草狗牙根中抗逆基因BeDREB進行了克隆及功能鑒定；Li等[2]利用抑制差減雜交的方法研究了耐高溫剪股穎的高溫脅迫響應基因；George 等[3]和Velculescu等[4]在熱脅迫下對比了剪股穎耐熱與不耐熱品種根、莖中的基因差異表達，鑒定和描述了蘋果菌素基因AsEXP1與剪股穎耐熱性的關系。

抑制消減雜交（Suppression subtractive hybridization，SSH）技術己成功地從植物中克隆了很多重要基因[5]。SSH的主要缺點就是產(chǎn)生假陽性，因為在消減過程中，只有一個過程可富集目的基因，因此不可避免地會增加背景序列。而將斑點印跡技術應用于抑制消減雜交差別表達基因克隆的初篩，一方面可以鑒定文庫質量，另一方面它可以進一步剔除文庫中的假陽性克隆，真正獲得目的優(yōu)勢表達的基因。高羊茅（Festuca arundinacea）作為耐熱性相對較好的冷季型草坪草，近年來在亞熱帶地區(qū)得到廣泛應用。本試驗以冷季型草坪草高羊茅為研究對象，在兩年生理生態(tài)指標測定的基礎上進一步做了分子水平的研究，進行了高溫脅迫下草坪草高羊茅抑制差減雜交文庫的構建和差異表達基因的斑點雜交，通過信號掃描獲得陽性克隆，為后續(xù)的序列特征和功能預測試驗提供依據(jù)，同時為草坪草引入編碼代謝途徑的大片段DNA的轉基因育種工作提供相關依據(jù)，結合恰當?shù)乃收{控措施有效提高草坪草的抗熱性等逆境承受能力。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗品種 試驗所選品種為凌志高羊茅（Festuca arundinacea cv. Barlexas），種子購自北京克勞沃種子公司。選擇健康的草坪草種子播種在裝有混合培養(yǎng)基質（沙子/蛭石/有機營養(yǎng)土 = 3/1/1）的聚乙烯花盆中。聚乙烯花盆直徑為13 cm，深14 cm，每盆播種175～180粒種子。所有盆缽在室外自然光照下進行培養(yǎng)，氣溫為15～26 °C。盆缽內的草坪草每天用自來水澆灌至盆缽底有水從小孔滲出，每周用Hoagland營養(yǎng)液[6]澆灌一次。20 d后將所有盆缽再轉移到人工氣候箱（型號：LRH-300-CS，廣東省醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）培養(yǎng)14 d，管理方式同上，人工氣候箱被設置為14 h的光周期，光照強度為400 μmol·m-2·s-1， 相對濕度為（65 ±10）%， 溫度為26 °C /15 °C （晝/夜，對照溫度）。盆缽在人工氣候箱內隨機擺放并定期交換以保證每盆所受內部環(huán)境影響一致。

一半草坪草轉入38/30 °C（晝/夜）的培養(yǎng)箱中進行高溫脅迫（處理植株），光照、相對濕度以及管理方式均與對照溫度下光照培養(yǎng)箱中的一致。另一半仍舊在原條件下培養(yǎng)作為對照植株。在脅迫第6 h時取處理和對照的高羊茅葉片分別提取總RNA進行試驗。

1.1.2 試劑 RNAiso-mate for Plant Tissue，D325S，TaKaRa；RNAisoTM Plus，D9108B，TaKaRa； PCR-Select cDNA Subtraction Kit，637401，Clontech；Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit，635000，Clontech；QIAquick PCR Purification Kit，28104，Qiagen；Advantage 2 Polymerase Mix，639201，Clontech；DL2000，條帶依次為2 000，1 000， 750，500，250，100（Marker），D501A，TaKaRa。

1.2 試驗儀器

PCR儀，ABI 9700型PCR擴增儀；離心機，5418型，eppendorf；凝膠成像系統(tǒng)，Tanon 2500，天能公司；紫外分光光度計，GeneQuant II，Pharmacia Biotech。

1.3 試驗方法

1.3.1 高羊茅總RNA提取與mRNA的分離、純化 取50～100 mg組織于液氮中研磨，加入1 mL緩沖液提取組織總RNA。將總RNA溶于DEPC-H2O，用Dnase I 37 ℃處理30 min，抽提純化RNA。用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳對總RNA的濃度及純度進行檢測。

1.3.2 高羊茅SSH文庫的構建 將提取出的RNA反轉錄合成cDNA，然后對cDNA進行純化以及cDNA RsaI酶切，將雙鏈cDNA消化成短的平端cDNA片段，便于下一步的差減和接頭連接，具體可參考PCR-Select cDNA Subtraction Kit說明書。接頭連接和差減雜交，進行兩輪差減雜交，并且對兩輪差減雜交結果進行差減PCR。純化PCR產(chǎn)物，提取4 mL，并用TaKaRa公司的PMDl9-T Vector連接消減雜交片段。用氯化鈣二次重懸法制備感受態(tài)大腸桿菌。取出儲存于-80 ℃的大腸桿菌菌株的保存菌液，37 ℃下，轉速為225 r·min-1，擴大培養(yǎng)約至2.5～3.0 h，OD600=0.4時結束。將0.1 mol·L-1CaCl2溶液冰水浴冷卻，提取2 mL并輕輕震蕩菌體至均勻，冰水浴30 min后，得到感受態(tài)細胞懸液；加入5 mL連接產(chǎn)物，在恒溫振蕩器上復蘇培養(yǎng)80 min，讓受體菌恢復正常生長； 37 ℃在LB固體培養(yǎng)基平板上均勻涂布Amp（50 μg·mL-1）、x-gal（80 μg·mL-1）和IPTG（0.5 mmol·L-1），倒置培養(yǎng)于恒溫培養(yǎng)箱中14～16 h，直至長出大小合適的藍、白菌落。取白色飽滿菌落置于96細胞培養(yǎng)板，于37 ℃下靜置培養(yǎng)16～20 h，加入13 μL甘油（甘油經(jīng)過高壓蒸汽滅菌）混勻，-70 ℃保存，即可建成SSH文庫。

1.3.3 斑點雜交 根據(jù)下列方陣點膜，每個點各取0.6 μLPCR產(chǎn)物（插入片斷鑒定PCR產(chǎn)物）。

2 結果與分析

SSH和基因芯片技術的相結合是從陽性克隆中篩選差異基因比較理想的方法，它在一次雜交中就可對成千上萬的基因進行檢測，但是首先要有預先制備好的基因表達譜芯片。制備一張較完備的基因芯片經(jīng)費要求較高，需要對研究對象的遺傳背景有較好的了解。另外，運用基因芯片研究基因表達時，低豐度的基因往往難以檢測出來。因此，對于一些遺傳背景不清晰的物種來說，利用傳統(tǒng)意義上的基因芯片技術研究其在不同代謝或生理狀態(tài)的基因表達譜的變化是困難而且不經(jīng)濟的。因此，將斑點印跡技術應用于抑制消減雜交差別表達基因克隆的初篩，一方面可以鑒定文庫質量，更重要的是可以進一步剔除文庫中的假陽性克隆，真正獲得目的優(yōu)勢表達的基因。本試驗即在應用SSH技術建立高羊茅耐熱基因抑制消減文庫，然后使用斑點印跡技術對差別表達基因克隆進行初步篩選，獲得陽性克隆。

根據(jù)陽性克隆信號強弱的數(shù)據(jù)，變化倍數(shù)取log2，然后進行升序排列的結果，得到上調和下調結果。上調的基因為91個；下調基因為22個，這兩部分數(shù)據(jù)與草坪草抗熱性的獲得顯著相關，是研究所關注的基因組，將進一步對其進行測序和分析。其余還有下調基因145個，這部分基因與抗熱性的獲得相關，但不是關鍵基因，這部分數(shù)據(jù)可以作為選測數(shù)據(jù)，以便對抗熱相關基因進行測序和生物信息學分析。

3 討 論

在本研究中，為了從已構建好的消減文庫中篩選差異表達基因，分別以正向和反向SSH探針與尼龍膜上的消減cDNA質粒進行雜交，消減cDNA質粒與具有同源序列的探針結合，經(jīng)洗滌去除未結合的質粒，經(jīng)相應的顯色反應顯出雜交信號。通過雜交信號的強度差異篩選出陽性克隆。

當植物受到高溫脅迫時，正常的生理過程受到干擾，細胞代謝紊亂。同時，植物也可以通過應激反應延緩或者阻止傷害的發(fā)生。有關逆境生理和抗性調控機理已經(jīng)進行了大量的研究[7-10]，試驗表明：在植物受到脅迫時，體內的各種生化指標都會發(fā)生變化，甚至產(chǎn)生一些新的蛋白，如熱激蛋白，保護植物免受或延緩傷害[11]。現(xiàn)有研究已經(jīng)知道植物對環(huán)境產(chǎn)生的大多數(shù)生理響應都得通過改變基因表達來實現(xiàn)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)在中等脅迫或者外源物質的刺激下，各種保護機制也會快速反應[12]，從而減輕了進一步的脅迫對植物體造成的傷害?？梢?，抗逆基因的響應遠遠早于生理指標的變化。

植株對逆境的響應是一個復雜的系統(tǒng)過程，所表達的差異基因涉及到生理代謝的各個方面[13]。傳統(tǒng)的研究受到研究手段和方法的限制，往往只能從一個方面去認識逆境下的生理或者基因的變化規(guī)律，而不能全面地揭示逆境引起的基因組變化[14]?，F(xiàn)代基因組學為系統(tǒng)研究逆境差異基因提供了條件，避免了研究的盲目性。在本試驗中共獲得252個差異基因，通過進一步的生物信息學分析可以知道他們的功能、涉及的代謝系統(tǒng)，以及與抗熱性的相關性，從而為后續(xù)的基因克隆、調控提供試驗支持。

4 結 論

（1）本試驗從正向和反向文庫中分別隨機挑選了384個克隆，利用斑點雜交共得到252個差異片段，庫中陽性克隆約占50%以上。

（2）陽性克隆中，91個為上調基因，161個為下調基因。這些基因即為試驗所要尋找的差異表達基因，他們與高羊茅的耐熱性比密切相關。

（3）本試驗為草坪草耐熱基因的研究提供了基礎，可進行后續(xù)的測序和功能鑒定工作，同時也為草坪草轉基因育種提供了相關依據(jù)，結合恰當?shù)乃收{控，可有效提高草坪草的逆境耐受力，從而延長青綠期，提高生態(tài)價值。

參考文獻：

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4 結 論

（1）本試驗從正向和反向文庫中分別隨機挑選了384個克隆，利用斑點雜交共得到252個差異片段，庫中陽性克隆約占50%以上。

（2）陽性克隆中，91個為上調基因，161個為下調基因。這些基因即為試驗所要尋找的差異表達基因，他們與高羊茅的耐熱性比密切相關。

（3）本試驗為草坪草耐熱基因的研究提供了基礎，可進行后續(xù)的測序和功能鑒定工作，同時也為草坪草轉基因育種提供了相關依據(jù)，結合恰當?shù)乃收{控，可有效提高草坪草的逆境耐受力，從而延長青綠期，提高生態(tài)價值。

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4 結 論

（1）本試驗從正向和反向文庫中分別隨機挑選了384個克隆，利用斑點雜交共得到252個差異片段，庫中陽性克隆約占50%以上。

（2）陽性克隆中，91個為上調基因，161個為下調基因。這些基因即為試驗所要尋找的差異表達基因，他們與高羊茅的耐熱性比密切相關。

（3）本試驗為草坪草耐熱基因的研究提供了基礎，可進行后續(xù)的測序和功能鑒定工作，同時也為草坪草轉基因育種提供了相關依據(jù)，結合恰當?shù)乃收{控，可有效提高草坪草的逆境耐受力，從而延長青綠期，提高生態(tài)價值。

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