陳宏志+杜曉華++穆金艷++賈文慶++劉會超

摘要：為研究高溫脅迫下大花三色堇和角堇的生理響應(yīng)，分別對大花三色堇DFM-16、DFM-17和角堇08H、E01幼苗進行不同溫度脅迫處理，記錄熱害情況并測定不同脅迫條件下細胞膜透性、光化學效率（Fv/Fm）、脯氨酸含量、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性等生理指標。結(jié)果表明，角堇的熱害指數(shù)高于大花三色堇；角堇細胞膜在高溫脅迫下受損程度比大花三色堇細胞膜受損程度重；供試4種材料的光合作用在晝溫42 ℃下均受到了抑制，且角堇比大花三色堇受抑制程度大；大花三色堇的脯氨酸含量基本上隨溫度的升高而升高；供試4種材料POD活性隨著溫度的升高出現(xiàn)不同程度的下降，大花三色堇SOD活性在晝溫25、35 ℃下相對穩(wěn)定，42 ℃時下降，大花三色堇的CAT活性在42 ℃下較對照均明顯升高，而角堇明顯下降。綜合熱害指數(shù)和生理指標分析得出，大花三色堇的耐熱性高于角堇。

關(guān)鍵詞：高溫脅迫；大花三色堇；角堇；生理響應(yīng)

中圖分類號： S681.901文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0124-03

大花三色堇（Viola tricolor L.）和角堇（Viola cornuta）均為堇菜科堇菜屬的2年生草本花卉，具有花色豐富、花期長等特點，是世界著名的早春草本花卉[1-2]。自20世紀80年代開始，三色堇和角堇分別引入我國，在許多城市作為冬春季花壇用花，市場需求量巨大。在我國長江以南地區(qū)育苗主要在夏秋季進行，高溫造成成苗率低及移栽死亡率高[3]。在我國華北地區(qū)，觀賞期主要在春季，進入6月由于氣溫急速增高，導(dǎo)致植株逐漸枯萎死亡，縮短了觀賞期。因此研究三色堇或角堇耐熱機制，培育耐熱品種成為當前三色堇園林應(yīng)用及育種研究的重要課題。

植物往往采取一些策略應(yīng)對高溫脅迫，引起形態(tài)及生理指標的改變，一旦傷害已經(jīng)造成，則難以恢復(fù)[4]。目前，僅見彭華婷等對大花三色堇幼苗在35 ℃脅迫下的生理變化進行了研究[3]。尚未見有關(guān)不同高溫梯度下生理響應(yīng)的探討。本研究以2種大花三色堇和2種角堇為試驗材料，對其幼苗進行不同溫度的脅迫處理，記錄在高溫脅迫下幼苗的熱害情況，測定不同溫度下表征高溫對植物傷害程度的細胞膜透性、光化學效率（Fv/Fm）和表征植物自我保護機制的脯氨酸含量、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）及超氧化物歧化酶（SOD）活性等指標，探究在高溫脅迫下三色堇和角堇的生理響應(yīng)，以期有助于采取相應(yīng)措施減輕高溫危害，為篩選抗高溫基因型植株提供有效的途徑，也為堇菜屬觀賞植物的耐熱性研究尋找理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試大花三色堇和角堇分別引自德國和荷蘭，由河南科技學院草花育種實驗室提供，名稱及來源見表1。在苗圃種植期間發(fā)現(xiàn)角堇08H、E01不耐高溫，6月高溫條件下植株開始枯萎死亡，而大花三色堇DFM-16、DFM-17在高溫環(huán)境中能夠維持較好的生長狀態(tài)，因而推測后2種材料較前2種耐熱。

1.2方法

1.2.1材料處理選取培育60 d、長勢均勻的4種材料各100株，做好標記，在20 ℃—15 ℃（晝溫—夜溫），相對濕度90%～95%，光周期14 h的培養(yǎng)箱中馴化7 d，然后對馴化的4種材料分別進行不同溫度脅迫，晝溫—夜溫分別為25 ℃—20 ℃（CK）、35 ℃—30 ℃、40 ℃—35 ℃、42 ℃—37 ℃，脅迫時間為 4 d，其間灑水2次/d，保持基質(zhì)濕潤。每種材料每個處理至少10株，重復(fù)3次。文中各處理用晝溫簡略表示。

1.2.2熱害指數(shù)的測定記錄4種材料在不同溫度脅迫下4 d后的熱害級數(shù)。

熱害癥狀分級標準參照文獻[5-6]：0級，幼苗生長正常，無明顯熱害癥狀；1級，葉片綠色，輕度反卷萎蔫；2級，葉片微黃，中度萎蔫；3級，葉片發(fā)黃，重度萎蔫；4級，植株莖萎縮，葉大部分枯黃萎蔫；5級，植株死亡干枯。熱害指數(shù)=∑（每個級別植株數(shù)×級別數(shù)）/（最高級數(shù)×總植株數(shù)）×100%。

1.2.3生理指標的測定測定相對電導(dǎo)率：參照鄒琦的方法[7]進行測定，每個處理重復(fù)3次，取平均值。

Fv/Fm：采用Yaxin-1161型葉綠素熒光儀測定可變熒光和最大熒光的比值來表征。選取完全伸展的葉片，暗適應(yīng) 20 min 后進行測量，每個處理重復(fù)3次，取平均值。

脯氨酸含量測定：3%磺基水楊酸提取脯氨酸，進行茚三酮反應(yīng)，用分光光度計比色[4]，每個處理重復(fù)3次，取平均值。

抗氧化酶活性測定：先制備粗酶液，準確稱取樣品0.5 g，放到4 ℃預(yù)冷的研缽中，往研缽中加入4 ℃預(yù)冷的50 mmol/L pH 值為7.8的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液1 mL，低溫研至勻漿后轉(zhuǎn)移到離心管中，再用3 mL磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液沖洗研缽并轉(zhuǎn)入離心管中，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液，4 ℃保存。用于測定CAT、SOD和POD活性。CAT、SOD和POD活性的測定均參照鄒琦的方法[7]進行，每個處理重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4統(tǒng)計分析采用Excel與DPS軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和差異顯著性檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1高溫脅迫下大花三色堇和角堇熱害指數(shù)

在42 ℃高溫脅迫下，4種材料葉片均出現(xiàn)發(fā)黃現(xiàn)象，隨著脅迫時間的增加，角堇08H和E01部分植株先出現(xiàn)葉片枯萎，最后整株死亡。由表2可知，08H、E01的熱害指數(shù)分別為0.75、0.68，二者差異不顯著；DFM-16、DFM-17熱害指數(shù)分別為0.45、0.38，二者差異不顯著；08H與DFM-16、DFM-17之間，E01與DFM-16、DFM-17之間差異極顯著，表明DFM-16、DFM-17的耐熱性比08H、E01高，這與田間觀察到的耐熱性結(jié)果一致。

2.2高溫脅迫對大花三色堇和角堇細胞膜透性的影響

由圖1可知，不同溫度脅迫下4種材料的細胞膜透性呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律；08H在40、42 ℃脅迫下，細胞膜透性比對照（25℃）高；E01隨脅迫溫度的升高，細胞膜透性呈上升趨

勢，且40、42 ℃與對照差異顯著（P<0.05）；DFM-16在35、42 ℃脅迫下細胞膜透性比對照高，在40 ℃脅迫下無明顯變化；DFM-17在35 ℃脅迫下較對照細胞膜透性下降，40、42 ℃ 條件下均小幅度升高，與對照差異均不顯著?？傮w而言，08H和E01隨溫度的升高細胞膜透性變化比DFM-16和DFM-17大，說明大花三色堇DFM-16、DFM-17在高溫脅迫下細胞膜受損程度小，而角堇08H、E01細胞膜受傷害程度大。

2.3高溫脅迫對大花三色堇和角堇PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）的影響

圖2顯示，在35、40 ℃脅迫下，除DFM-17外，其余3種材料較對照差異均不明顯，說明在該溫度下4種材料的PSⅡ最大光化學效率均表現(xiàn)出對該高溫脅迫不敏感；與25 ℃脅迫相比，在 42 ℃ 時4種材料光化學效率均下降，說明42 ℃條件下4種材料的光合作用均受到了抑制，角堇08H和E01較大花三色堇DFM-16和DFM-17下降幅度大，說明后兩者較前兩者在高溫條件下光合作用受到的抑制作用小，耐熱性更強。

2.4高溫脅迫對大花三色堇和角堇脯氨酸含量的影響

由圖3可知，高溫脅迫下08H脯氨酸含量較對照均下降；其余3種材料在40、42 ℃脅迫下脯氨酸含量較對照均明顯上升；E01和DFM-16在35 ℃脅迫下較對照（25 ℃）有小幅度下降；隨著脅迫溫度的升高，DFM-16和DFM-17的脯氨酸含量升高，在42 ℃時最高，說明這2種材料對高溫脅迫表現(xiàn)出了更強的適應(yīng)性。

2.5高溫脅迫對大花三色堇和角堇抗氧化酶活性的影響

由表3可知，42 ℃處理下，角堇08H與E01中POD、SOD、CAT活性相對對照（25 ℃）均有下降；在35、40 ℃處理下，E01中POD活性較對照下降，與25 ℃對照差異顯著（P<0.05），而08H較25 ℃對照上升。

由表3還可見，大花三色堇DFM-16在35 ℃處理下POD活性低于對照（25 ℃），且兩者差異極顯著（P<0.01）；DFM-17在40、42 ℃下POD活性與對照（25 ℃）差異極顯著（P<0.01），均明顯下降，這說明高溫會抑制POD的活性；DFM-16和DFM-17在35、40 ℃處理下SOD活性保持相對穩(wěn)定狀態(tài)，在42 ℃處理下DFM-17中SOD活性比對照（25 ℃）下降；在42 ℃時，DFM-16和DFM-17中CAT活性均明顯升高，說明高溫誘導(dǎo)了DFM-16和DFM-17中CAT活性升高，提高了植物對抗高溫脅迫的能力。

3結(jié)論與討論

高溫脅迫對植物的傷害會引起光化學效率降低，這可能是光合內(nèi)囊體膜受損、蛋白變性等引起的。PSⅡ最大光化學

效率的降低是光合作用受到抑制時的顯著特征[8]。一般耐熱性強的植物在高溫下光合系統(tǒng)損傷較少，能夠維持較高的光合速率[9]，這在條斑紫菜[10]、棉花[11]、莧菜[12]上均有研究證實。本試驗也證明了這一點，4種材料PSⅡ最大光化學效率在42 ℃時均明顯下降，光合作用均受到抑制。高溫對植物傷害的另一方面是引起電解質(zhì)外滲造成細胞膜受損，細胞膜是熱損傷和抗熱的中心，細胞膜的熱穩(wěn)定性反映了植物耐熱能力的大小[13]。試驗結(jié)果顯示，隨著溫度的升高，角堇08H和E01細胞膜透性變化幅度大，細胞膜受損程度大，熱害指數(shù)高，而大花三色堇DFM-16、DFM-17變化幅度小，熱害指數(shù)低，可見大花三色堇DFM-16、DFM-17細胞膜更加穩(wěn)定。

高溫脅迫下植物會進行自我保護，一方面是防止水分過分損失，即滲透調(diào)節(jié)，滲透調(diào)節(jié)是植物耐熱和抵御高溫的重要生理機制[14]。脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可以防止植物水分散失，提高原生質(zhì)膠體穩(wěn)定性，高溫脅迫時，許多耐熱的植物品種比不耐熱的品種脯氨酸積累量多[15]。研究結(jié)果顯示，隨溫度的升高，大花三色堇DFM-16和DFM-17脯氨酸含量呈上升趨勢，且增長幅度較08H與E01高，這表明大花三色堇較角堇對高溫脅迫具有更好的適應(yīng)性，耐熱性更強。植物自我保護機制的另一方面是活性氧清除系統(tǒng)，活性氧清除系統(tǒng)在整個系統(tǒng)協(xié)調(diào)反應(yīng)中能有效地控制活性氧含量，增加脅迫抗性[16]。高溫對POD活性有顯著的抑制作用，其活性的降低加速了高溫對細胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷[17]。CAT和SOD是植物抗氧化防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，可以提高植物組織的抗氧化能力。研究結(jié)果表明，隨著溫度的升高，08H、E01、DFM-17的POD活性相對對照均在一定范圍內(nèi)出現(xiàn)不同程度的下降，這與吳國勝等在白菜上的研究結(jié)果[18-19]一致。4種材料的SOD活性在25、35 ℃下相對穩(wěn)定，42 ℃時下降，這可能是由于42 ℃高溫破壞了植物體內(nèi)SOD酶的活性。DFM-16與DFM-17 CAT活性較對照均明顯升高，而E01與08H的CAT活性則明顯下降，這可能是因為在42 ℃時大花三色堇中的CAT沒有遭到破壞，而角堇中CAT遭到了破壞。本試驗中CAT和SOD活性的變化與彭華婷等對大花三色堇的研究[3]不完全符合，這可能是由于材料的差異引起的。

綜合熱害指數(shù)、細胞膜透性、光合效率、脯氨酸含量以及抗氧化酶活性等指標分析表明，大花三色堇2個品種的耐熱性均高于角堇的2個品種。至于是否是所有的大花三色堇品種抗熱性均高于角堇還有待于進一步研究。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.032