吳愛(ài)明，婁利霞，張冬梅，柴立民，聶 波，趙明鏡

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

益氣活血藥對(duì)心肌梗死大鼠心室縫隙連接蛋白43表達(dá)及室顫發(fā)生的影響

吳愛(ài)明，婁利霞，張冬梅，柴立民，聶 波，趙明鏡

目的 探討益氣活血藥(生脈注射液聯(lián)合血塞通注射液)對(duì)心肌梗死大鼠心室縫隙連接蛋白43(Cx43)表達(dá)及室顫發(fā)生的影響。方法 采用結(jié)扎心臟左冠狀動(dòng)脈前降支的方法建立心肌梗死大鼠模型，另設(shè)假手術(shù)(只穿線(xiàn)，不結(jié)扎)作對(duì)照。術(shù)后隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組、卡托普利組和益氣活血組。卡托普利組給予卡托普利片4.39 mg/(kg·d)溶解灌胃；益氣活血組給予生脈注射液3.51 mL/(kg·d)，血塞通注射液17.54 mg/(kg·d)腹腔注射；模型組和假手術(shù)組給予生理鹽水，療程4周。治療結(jié)束后取材，采用real time PCR法檢測(cè)左心室梗死邊緣區(qū)Cx43 mRNA的表達(dá)；Western blot法檢測(cè)Cx43蛋白表達(dá)；在體電刺激記錄室顫誘發(fā)率。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組Cx43的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，卡托普利組和益氣活血組Cx43的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。在體電刺激室顫誘發(fā)率模型組最高，卡托普利組和益氣活血組的室顫誘發(fā)率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 生脈注射液聯(lián)合血塞通注射液可以減少心肌梗死后室顫的發(fā)生，其機(jī)制與改善心室Cx43表達(dá)有關(guān)。

心肌梗死；心室顫動(dòng)；縫隙連接蛋白43；益氣活血

縫隙連接蛋白43(Cx43)是心室表達(dá)最豐富的縫隙連接蛋白。Cx43所構(gòu)成的縫隙連接為心肌細(xì)胞間電信號(hào)的傳導(dǎo)提供了直接通道，對(duì)維持心律協(xié)調(diào)同步具有非常重要的意義。心肌梗死后Cx43遭受破壞，導(dǎo)致心電傳導(dǎo)異常，為室性心律失常的形成提供了基本條件[1]。益氣活血法是中醫(yī)治療心律失常的基本治法。本研究在其指導(dǎo)下，采用生脈注射液聯(lián)合血塞通注射液對(duì)心肌梗死大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性干預(yù)，觀察其對(duì)心室Cx43基因和蛋白表達(dá)以及室顫發(fā)生的影響，為闡明益氣活血藥治療心肌梗死后心律失常的療效和機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠，體重200 g～240 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器 ALC-V8動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)、BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)、Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)安捷倫 Stratagene公司)、Bio-Rad穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、垂直電泳槽和轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 主要試劑 Oligo(dT)15Primer，dNTP Mix，M-MLV Reverse Transcriptase均為Promega公司產(chǎn)品。SYBR Green PCR Master Mix為ABI公司產(chǎn)品。Cx43多克隆抗體(貨號(hào)：sc-6560-R)為Santa cruz公司產(chǎn)品。

1.4 模型制備方法 大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，經(jīng)喉氣管插管，機(jī)械通氣，左胸前區(qū)備皮消毒，于第三、四肋間隙逐層開(kāi)胸，暴露心臟，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(假手術(shù)只穿線(xiàn)，不結(jié)扎)，然后將心臟復(fù)位，逐層縫合。心電圖ST段顯著抬高為結(jié)扎成功。術(shù)后給予青霉素抗感染。

1.5 分組給藥方法 大鼠術(shù)后隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組、卡托普利組和益氣活血組。參照徐淑云《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中的等效劑量換算公式計(jì)算大鼠藥量，具體藥量如下：卡托普利組給予卡托普利片(中美上海施貴寶制藥有限公司)4.39 mg/(kg·d)充分溶解灌胃；益氣活血組給予生脈注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司)3.51 mL/(kg·d)、血塞通注射液(昆明制藥集團(tuán)股份有限公司)17.54 mg/(kg·d)腹腔注射；模型組和假手術(shù)組給予生理鹽水。療程為4周。

1.6 在體電刺激誘發(fā)室顫方法 治療結(jié)束后，大鼠用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，經(jīng)喉氣管插管，機(jī)械通氣，開(kāi)胸暴露心臟，連接BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，同時(shí)將刺激電極正極置于心尖部，負(fù)極置于正極右側(cè)約3 mm處的左室前壁非梗死區(qū)，以程控電刺激參數(shù)：每串10個(gè)刺激波，脈寬5 ms，刺激電壓1 V遞增，記錄各組大鼠在9 V刺激電壓時(shí)的室顫發(fā)生率。

1.7 心肌組織Cx43 mRNA檢測(cè)方法 采用real time PCR法，用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。Cx43，120bp forward：5′-TTCATGCTGGTGGTGTCC-3′；reverse：5′-AGTGGTGGCGTGGTAAGG-3′。GAPDH，95bp forward：5′-GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTAGA-3′；reverse：5′-CCGTTCACACCGACCTTCACCAT-3′。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40次循環(huán)。Cx43 mRNA的相對(duì)表達(dá)量按照2(-ΔΔct) 法計(jì)算。

1.8 心肌組織Cx43蛋白檢測(cè)方法 采用Western blot法，心肌組織加入適量液氮研磨破碎，在冰浴下裂解，離心提取總蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后依次與相應(yīng)特異性一抗和二抗孵育，用化學(xué)發(fā)光法獲取條帶，掃描膠片后用IPP6.0軟件進(jìn)行條帶灰度分析，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 Cx43 mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組左心室梗死邊緣區(qū)Cx43 mRNA的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，卡托普利組和益氣活血組的表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。與模型組比較，卡托普利組和益氣活血組的Cx43 mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。詳見(jiàn)圖1。

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；n= 5。

圖1 各組大鼠左心室梗死邊緣區(qū)Cx43 mRNA表達(dá)的比較

2.2 Cx43 蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組左心室梗死邊緣區(qū)Cx43蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。與模型組比較，卡托普利組和益氣活血組的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)圖2。

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，

##P<0.01；n= 3。

圖2 各組大鼠左心室梗死邊緣區(qū)Cx43 蛋白表達(dá)的比較

2.3 電刺激室顫誘發(fā)率結(jié)果 在體電刺激實(shí)驗(yàn)，在9 V刺激電壓下，不同組間的室顫誘發(fā)率不同，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中模型組室顫誘發(fā)率最高，卡托普利組有所降低，益氣活血組的室顫誘發(fā)率明顯降低，與假手術(shù)組相近。詳見(jiàn)圖3。

注：經(jīng)卡方檢驗(yàn)，χ2=8.504，P=0.037。圖中數(shù)字為動(dòng)物數(shù)。

圖3 各組大鼠在體電刺激室顫誘發(fā)率的比較

3 討 論

據(jù)世界衛(wèi)生組織2013年7月公布的調(diào)查結(jié)果，冠心病是全球范圍的頭號(hào)殺手，每年約有700萬(wàn)人死于冠心病，其中冠心病心肌梗死患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)居高不下，患者多因并發(fā)惡性心律失常而猝死。因此，對(duì)心肌梗死后心律失常的干預(yù)研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

心肌細(xì)胞間的電偶聯(lián)障礙是導(dǎo)致心律失常的重要誘因，其致心律失常作用不亞于興奮性異常和膜離子通道功能的紊亂?？p隙連接是維持心臟正常電偶聯(lián)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。Cx43在心室中表達(dá)最豐富，Cx43的損傷和重構(gòu)與室性心律失常的發(fā)生關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，Cx43基因敲除小鼠在成長(zhǎng)到2月齡時(shí)，會(huì)全部死于自發(fā)性室性心律失常[2]。Cx43基因部分敲除小鼠的心肌Cx43表達(dá)較正常水平下降了50%，通過(guò)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支誘導(dǎo)急性心肌缺血時(shí)，與野生型小鼠相比較，Cx43基因部分敲除小鼠的自發(fā)性室性心動(dòng)過(guò)速發(fā)生率增加了2倍，并且在運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中首次自發(fā)性室性心動(dòng)過(guò)速出現(xiàn)的更早，發(fā)生頻率更高，同時(shí)室性心律失常的持續(xù)時(shí)間也更長(zhǎng)，證明了Cx43表達(dá)的降低是心肌梗死后室性心律失常發(fā)生的直接誘因[3]。由此提示，保護(hù)Cx43是抑制心律失常從而降低心肌梗死患者猝死風(fēng)險(xiǎn)的潛在干預(yù)靶點(diǎn)。

中醫(yī)藥治療心律失常有著悠久的歷史和獨(dú)到的見(jiàn)解。早在《內(nèi)經(jīng)》中就有“心澹澹大動(dòng)、心怵惕”的描述。心律失常屬中醫(yī)學(xué)“心悸、怔忡”等范疇，為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之證，其證型常復(fù)雜多變，但引起心律失常的必要環(huán)節(jié)均是“心脈瘀阻”，形成“心脈瘀阻”的基本因素是“心臟虧虛”，即“心臟虧虛”和“心脈瘀阻”是各類(lèi)心律失常的共同病機(jī)[4]。因此，益氣活血法是本病的基本治法。一些具有益氣和活血作用的中藥可以抑制心律失常的發(fā)生，生脈注射液由紅參、麥冬、五味子組成，功效益氣養(yǎng)陰，復(fù)脈固脫，可用于心肌梗死后心悸癥狀的改善。研究證實(shí)，生脈注射液對(duì)缺血性心律失常[5]和再灌注損傷所致的心律失常[6]具有較好的治療作用，可以降低心內(nèi)膜單項(xiàng)動(dòng)作電位復(fù)極時(shí)間，增強(qiáng)心臟的電穩(wěn)定性[7]。血塞通注射液的主要成分是三七總皂苷，功效活血祛瘀，通脈活絡(luò)，具有良好的抗心肌缺血作用。研究表明血塞通注射液可有效對(duì)抗家兔心肌缺血再灌注性心律失常[8]。

本研究在益氣活血法指導(dǎo)下，采用生脈注射液聯(lián)合血塞通注射液對(duì)心肌梗死大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性干預(yù)，觀察其對(duì)心室Cx43基因和蛋白表達(dá)以及室顫發(fā)生的影響。結(jié)果顯示，心肌梗死大鼠左心室梗死邊緣區(qū)Cx43 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，導(dǎo)致心肌細(xì)胞間不能形成有效的縫隙連接通道，使心電沖動(dòng)傳導(dǎo)異常，易于誘發(fā)心律失常。此時(shí)模型組大鼠在電刺激誘發(fā)室顫的實(shí)驗(yàn)中，室顫的誘發(fā)率最高。生脈注射液聯(lián)合血塞通注射液治療組、卡托普利治療組大鼠的Cx43 mRNA和蛋白表達(dá)較模型組明顯上調(diào)，改善了縫隙連接通道介導(dǎo)的心電傳導(dǎo)，使室顫的誘發(fā)率明顯降低。提示生脈注射液和血塞通注射液聯(lián)合應(yīng)用具有抑制心肌梗死后室顫發(fā)生的作用，其機(jī)制與改善左心室Cx43的表達(dá)有關(guān)。

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(本文編輯 郭懷印)

The Influence of Yiqi Huoxue Drugs on the Expression of Connexin 43 and Ventricular Fibrillation in Rats with Myocardial Infarction

Wu Aiming，Lou Lixia，Zhang Dongmei，Chai Limin，Nie Bo，Zhao Mingjing

Zhao Mingjing

Objective To study the effects of Yiqi Huoxue drugs(YQHX，combine Shengmai injection with Xuesaitong injection) on the expression of connexin 43(Cx43)and ventricular fibrillation in rats with myocardial infarction.Methods Model rats of myocardial infarction were established by occlusion of the left anterior descending coronary artery，the sham operation group was without occlusion.After operation rats were randomly divided into sham operation group，model group，YQHX group and captopril group.YQHX[Shengmai injection 3.51 mL/(kg·d)and Xuesaitong injection 17.54 mg/(kg·d)] were administered intraperitoneally.Captopril[4.39 mg/(kg·d)] and distilled water (for the sham operation and model groups) were administered orally.The course of treatment was 4 weeks.The expressions of Cx43 mRNA of myocardium in left ventricular infarct border zone were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction after treatment.The expression of Cx43 protein was observed by western blot.The incidence of ventricular fibrillation was recorded by electric stimulation in vivo.Results Compared with sham operation group，the expressions of Cx43 mRNA and protein decreased remarkably in the model group (P<0.05 orP<0.01).Compared with model group，the expressions of Cx43 mRNA and protein increased significantly in YQHX group and captopril group (P<0.05 orP<0.01).The incidence of ventricular fibrillation was the highest in model group.The incidence of ventricular fibrillation reduced significantly in captopril group and YQHX group(P<0.05).Conclusion Shengmai injection and Xuesaitong injection can reduce the occurrence of ventricular fibrillation after myocardial infarction.It is related to improving the expressions of Cx43.

myocardial infarction；ventricular fibrillation；connexin 43；Yiqi Huoxue drugs

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81202685)；北京市教委科研基地項(xiàng)目(No.2012)

北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

趙明鏡，E-mail：mjgx2004@163.com

R541.7 R285.5

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2015．16．008

1672-1349(2015)16-1837-03

2015-04-11)