神經(jīng)干細胞移植治療大鼠腦梗死的研究

腦梗死疾病是目前導致人類死亡和致殘的主要疾病之一，梗死后神經(jīng)功能的恢復始終是人們積極探索的目標［1］。干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的原始細胞，以干細胞移植治療腦梗死成為當今探討的熱點［2］。因此，本實驗將選取具有形成完整個體分化潛能的胚胎干細胞移植到腦梗死大鼠模型內(nèi)，探討其增殖、分化及療效。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM/F12堿性成纖維生長因子bFGF、表皮生長因子EGF、2％B27、無鈣鎂PBS、Hank＇s液、4％多聚甲醛、兔抗大鼠nestin抗體、FITC標記的羊抗兔IgG、封閉用山羊血清、胎牛血清、抗5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）單克隆抗體。

1.2 實驗動物及分組 孕齡15dSD大鼠供培養(yǎng)用；雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250g，清潔級［由河南省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（豫）2010—0002］，在標準飼養(yǎng)環(huán)境下自由食水，將大鼠隨機分成2組，實驗組25只，對照組25只，在造模成功后1d、3d、7d、14d、28d時間點進行神經(jīng)功能學評分，28d評分結(jié)束后取5只行免疫組化熒光染色。

1.3 實驗方法

1.3.1 腦梗死模型制作：腦梗死模型制作術前禁食12h，禁水4h，將大鼠麻醉，仰臥固定于無菌手術臺上，頸部備皮消毒，于頸部正中行一約3cm切口，鈍性分離頸前肌群，充分暴露頸動脈鞘后分離出右側(cè)頸動脈分叉，將迷走神經(jīng)完全從右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)、頸外動脈上游離，結(jié)扎頸外動脈，活結(jié)固定頸內(nèi)、頸總動脈，在頸總動脈分叉處2mm頸外動脈處，使用眼科剪剪一小口，將標記后的線栓插入至大腦中動脈起始處，固定結(jié)扎線栓、消毒、縫合。2h后拔出線栓，實現(xiàn)再灌注，待大鼠蘇醒后根據(jù)Zea-Longa 5分制評分標準篩選出成功腦梗死模型，評分2～3分的為動物模型成功，MCAO再灌24h行TTC染色，可見正常腦組織層深紅色，梗死區(qū)呈白色，從病理上驗證腦梗死模型成功。

1.3.2 神經(jīng)干細胞的提取、培養(yǎng)及移植：（1）取孕齡15d的SD大鼠1只，麻醉后在無菌條件下取出胎鼠，分離胎鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)腦組織，收集濾液1 000r/min離心5min，去上清收集沉淀細胞，加DMFM/F12（含青鏈霉素，2％B27，20 μg/mL bFGF，20μg/mL EGF成分）無血清培養(yǎng)液，制成單細胞懸液，取5μL細胞懸液，加入5μL臺盼藍，于血球計數(shù)板上，倒置顯微鏡下計數(shù)，以5×106個/mL的密度接種于50 mL細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，飽和濕度5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2～3d半量換液1次，每天進行倒置顯微鏡觀察并拍照［3］。（2）神經(jīng)干細胞的傳代培養(yǎng)及誘導分化6～8d后對細胞進行傳代，將細胞懸液計數(shù)并調(diào)整細胞密度為1×106個/mL，置于37℃，飽和濕度5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。收集傳代培養(yǎng)形成的神經(jīng)細胞球，離心后加入含5％胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)液，接種于用多聚賴氨酸（PLL）包被的蓋玻片置于的6孔板中，置于37℃，飽和濕度5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。對培養(yǎng)的NSCs進行nestin免疫熒光染色。將經(jīng)Nestin染色陽性鑒定的細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為106個/μL，轉(zhuǎn)移至EP管中作移植備用。（3）NSCs移植分別在大鼠腦梗死后1d、3d、7d、14d、28d經(jīng)大鼠尾靜脈進行神經(jīng)干細胞移植，取1μL的細胞懸液進行缺血移植組移植，生理鹽水對照組注射等量0.9％生理鹽水。

1.3.3 神經(jīng)干細胞移植后大鼠神經(jīng)功能評分：移植后1d、3 d、7d、14d、28d5個時間點對各組大鼠進行Garcia 18分評分法，Garcia評分與腦梗死體積具有更好的相關性，更適合作為腦缺血治療藥物療效評價的指標。評估各組大鼠的神經(jīng)功能損傷程度，觀察大鼠感覺、運動、反射及平衡能力進行評分。損傷最高為18分，無損害為0分。

1.3.4 NSCs移植后大鼠灌注取腦：分別于NSCs移植后1 d、3d、7d、14d、28d，每組分別取5只大鼠多聚甲醛灌注取腦，4℃的多聚甲醛溶液固定24h后依次放入15％、20％、30％的蔗糖中梯度脫水，每次24h。用OTC包埋腦組織后放入-24℃的冰凍切片機中，預冷20min后，冠狀位冰凍切片，貼在載玻片上，每張厚度約為10μm，記錄好序號及組號，放入防凍液中-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 免疫組織化學染色：取制備好的切片放入4％多聚甲醛固定2h。山羊血清封閉液封閉30min，加1∶200兔抗人NSE多克隆抗體，1∶100兔抗鼠GFAP多克隆抗體和Brdu抗體盒，4℃過夜。PBS沖洗后，加入FITC標記的二抗（1∶100），37℃避光孵育40min，貼片后避光晾干，熒光猝滅劑封片，暗室熒光顯微鏡下觀察梗死區(qū)邊緣并計數(shù)陽性細胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCs體外培養(yǎng) 孕齡15d胎鼠腦皮質(zhì)海馬組織，傳代培養(yǎng)7d的細胞球，經(jīng)免疫熒光染色以后Nestin表達陽性（圖1），說明培養(yǎng)的細胞是神經(jīng)干細胞。

2.2 移植后大鼠神經(jīng)功能評分 缺血移植組大鼠的神經(jīng)功能評分與對照組比較顯著升高（P＜0.05），缺血移植組大鼠的神經(jīng)功能評分在28d較14d時顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 2組神經(jīng)功能評分比較（±s）

表1 2組神經(jīng)功能評分比較（±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.05；與1d、3d、7d、14d時比較，△P＜0.05

組別 n 1d 3d 7d 14d 28d對照組 5 5.0±1.321 6.5±1.112 6.8±1.430 10.5±1.540 11.8±0.848移植組 5 5.5±1.210＊6.8±1.330＊7.5±1.810＊12.8±1.352＊14.4±0.902＊△

2.3 Brdu染色 缺血移植組能夠檢測到BrdU陽性細胞，多為成簇分布（圖2）。

2.4 GFAP染色 缺血移植組大鼠腦梗死邊緣能夠檢測到GFAP陽性細胞，染色深，其突起多而細長（圖3）。

3 討論

腦梗死后中樞神經(jīng)系統(tǒng)中腦神經(jīng)組織損傷后是不可再生的，這對于治療腦梗死后神經(jīng)功能的恢復帶來了一定的難度。研究表明，當活體神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷或刺激時，腦內(nèi)神經(jīng)干細胞能夠自我增殖并參與神經(jīng)再生和組織修復［4］。

本實驗從孕15d胎鼠的大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)腦組織中獲取神經(jīng)干細胞，在無血清培技術條件下分離、培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，經(jīng)Nestin免疫熒光染色鑒定表達陽性，即神經(jīng)干細胞，用培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細胞經(jīng)大鼠尾靜脈進行移植，結(jié)果表明體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞移植后能遷徙到缺血區(qū)域，分化為神經(jīng)元細胞，并對移植組大鼠的肢體神經(jīng)運動功能起到改善作用，這與Sakata等［5］的研究結(jié)果一致。同時，本實驗也說明了移植的神經(jīng)干細胞能夠有效的穿透室管膜進入腦組織，具有進行細胞替代治療的可能性。

在神經(jīng)干細胞移植后14d、28d時缺血移植組大鼠神經(jīng)功能評分與缺血對照組比較明顯增高，并在移植后28d時神經(jīng)功能評分明顯高于14d，這說明移植的神經(jīng)干細胞對腦梗死大鼠的神經(jīng)功能恢復起到了持續(xù)、穩(wěn)定的積極作用。在神經(jīng)干細胞移植28d時可檢測到BrdU陽性細胞聚集在缺血區(qū)周圍，說明隨著時間的推移，移植的神經(jīng)干細胞逐漸向周圍遷移、分化。GFAP染色顯示大多數(shù)細胞陽性，證明其分化成了星形膠質(zhì)細胞。星形膠質(zhì)細胞的形成對損傷周圍的神經(jīng)細胞具有保護作用，有研究表明新生的星形膠質(zhì)細胞不會抑制軸突的生長，會產(chǎn)生許多因子促進軸突的再生［6］。

綜上所述，神經(jīng)干細胞可以在移植后較長時間內(nèi)持續(xù)存活下來，并在腦梗死灶周圍遷移、分化，可能對腦梗死大鼠的神經(jīng)功能修復起到積極的作用，且在實驗中未發(fā)現(xiàn)腫瘤形成的證據(jù)。但大鼠畢竟只是實驗動物，與人類差異很大，仍存在著大量的未知領域，需要對其進行更加深入的研究。

圖1 神經(jīng)干細胞

圖2 神經(jīng)干細胞的遷移、分化

圖3 星形膠質(zhì)細胞

［1］Sakata H，Narasimhan P，Niizuma K，et al.Interleukin 6-preconditioned neural stem cells reduce ischaemic injury in stroke mice［J］.Brain，2012，135（pt11）：3 298-3 310.

［2］Chang DJ，Oh SH，Lee N，et al.Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells（ENStem-A）migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats［J］.Exp Mol Med，2013，45：e53.

［3］劉磊，劉恒方，張敏，等 .胎鼠腦神經(jīng)干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定［J］.江蘇醫(yī)藥，2015，41（7）：753-755.

［4］Cheng Y，Zhang，Deng L，et al.Intravenously delivered neural stem cells migrate into ischemic brain，differentiate and improve functional recovery after transient ischemic stroke in adult rats［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8（3）：2 928-2 936.

［5］Sakata H，Niizuma K，Yoshioka H，et al.Minocycline-Preconditioned Neural Stem Cells Enhance Neuroprotection after Ischemic Stroke in Rats［J］.J Neurosci，2012，32（10）：3 462-3 473.

［6］Hosseini SM，F(xiàn)arahmandnia M，Razi Z，et al.Combination Cell Therapy with Mesenchymal Stem Cells and Neural Stem Cells for Brain Stroke in Rats［J］.Intl J Cells，2015，8（1）：99-105.

（收稿2015-01-25）

張 敏1）劉 磊2）吳世陶1）趙源征1）石 磊1）郭亞培1）崔 明1）劉恒方1）△

鄭州大學第五附屬醫(yī)院 1）神經(jīng)內(nèi)科 2）兒童康復醫(yī)學科 鄭州 450052

目的 探討神經(jīng)干細胞移植治療大鼠腦梗死的可行性及療效。方法 用線栓法將成年雄性大鼠制成大腦中動脈腦梗死模型，隨機分為實驗組和對照組各25只，實驗組經(jīng)尾靜脈注射1μL神經(jīng)干細胞懸液，對照組經(jīng)尾靜脈注射1μL生理鹽水，在移植后1d、3d、7d、14d、28d依據(jù)Garcia的18分評分法對各組大鼠的神經(jīng)功能進行評分。腦灌注固定取材，免疫組織化學染色法觀察移植后神經(jīng)干細胞的分化、遷移和整合情況。結(jié)果 移植后大鼠神經(jīng)功能評分，實驗組與對照組比較顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；實驗組應用免疫組織化學染色法能夠檢測到存活的Brdu陽性細胞，可見干細胞參與梗死區(qū)邊緣血管的增生。結(jié)論 移植體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞能在腦梗死大鼠腦內(nèi)存活、遷移和分化，且對腦梗死大鼠的神經(jīng)功能修復可能起到積極作用。

神經(jīng)干細胞；移植；大鼠；腦梗死

The research of neural stem cells transplantation in the treatment of cerebral infarction in rats

Zhang Min＊，LiuLei，Wu S，hitao，Zhao Yuanzheng，ShiLei，Guo Yapei，Cui Ming，L，iu Hengfang，
＊Department of Neurologythe Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou UniversityZhengzhou450052China

Objective To investigate the feasibility and effects of neural stem cells transplantation in the treatment of cerebral infarction in rats.Methods The model of middle cerebral artery infarction was made of adult male rats with suture method，the successful models were randomly divided into experimental group and control group，25rats in each group.1μL neural stem cell suspension was injected via the tail vein in experimental group，rats in the control group received the injection of 1μL physiological saline via the tail vein.Nerve function of rats in each group was assessed after 1-，3-，14-，and 28-day transplantation according to the Garcia scores with 18points.Brain materials were fixed by cerebral perfusion，and the differentiation，migration and integration of neural stem cells were observed by immunohistochemical staining.Results After transplantation，nerve function scores of the experimental group were significantly higher than that of the control group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The alive Brdu cells were detected by immunohistochemistry staining in the experimental group，which revealed that the nerve stem cells could be involved in the proliferation of marginal vessels in the infarct area.Conclusion Transplantation of vitro-cultured neural stem cells can survive，migrate and differentiate in rats with cerebral infarction，which may play apositive role in the rehabilitation of neurological function in cerebral infarction rats.

Nerve stem cells；Transplantation；Rats；Cerebral infarction

R-332

A

1673-5110（2015）21-0011-03

河南省教育廳科學技術研究重點項目（12A320064）

△通訊作者：劉恒方，E-mail：liuhf1965＠163.com