王 瓊周錦勇曲丁好周正璇楊柏霖陳玉根

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210029）

黃蜀葵花烏梅復(fù)方提取物對(duì)TNBS誘導(dǎo)克羅恩病小鼠的治療作用及其機(jī)制研究

王 瓊1周錦勇1曲丁好2周正璇2楊柏霖1陳玉根1

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210029）

目的：探討黃蜀葵花烏梅復(fù)方提取物對(duì)三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的克羅恩?。–D）實(shí)驗(yàn)小鼠的治療作用及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ）等炎癥因子的影響。方法：BABL/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、柳氮磺吡啶組和黃葵烏梅復(fù)方組，后3組應(yīng)用TNBS誘導(dǎo)建立小鼠CD模型。造模開(kāi)始時(shí)，柳氮磺吡啶組和黃葵烏梅復(fù)方組分別給予0.5g/kg柳氮磺吡啶和6g/kg黃蜀葵花烏梅復(fù)方提取物灌胃，每日1次，連續(xù)28d。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)分析實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活率、結(jié)腸長(zhǎng)度/重量比值、結(jié)腸組織病理，以及結(jié)腸組織中炎癥因子TNF-α和IFN-γ含量。結(jié)果：與模型組相比，黃蜀葵花復(fù)方組小鼠存活率明顯增高，結(jié)腸重量/長(zhǎng)度比值明顯降低，結(jié)腸組織炎癥和隱窩損害明顯減輕，結(jié)腸病理評(píng)分和結(jié)腸組織TNF-α、IFN-γ含量明顯降低。結(jié)論：黃蜀葵花和烏梅復(fù)方提取物可用于CD的治療，其作用機(jī)制可能與顯著降低炎癥因子TNF-α和IFN-γ含量有關(guān)。

克羅恩病 黃蜀葵花烏梅復(fù)方提取物 結(jié)腸 病理學(xué) 炎癥因子 存活率 小鼠

克羅恩病是消化道慢性炎癥性疾病，大多數(shù)患者反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，預(yù)后不良。目前認(rèn)為CD病因與遺傳、免疫、感染等因素相關(guān)，主要治療目標(biāo)是誘導(dǎo)與維持緩解，或最終達(dá)到病變黏膜愈合[1]。根據(jù)國(guó)內(nèi)外治療指南，活動(dòng)期的CD治療提倡漸進(jìn)方案

[2]，即輕度活動(dòng)期采用5-氨基水楊酸（5-ASA）制劑，

中重度患者使用糖皮質(zhì)激素，而激素?zé)o效者采用抗腫瘤壞死因子-α（TNF-α）治療，最后選擇手術(shù)治療。誘導(dǎo)緩解后的治療包括戒煙、氨基水楊酸鹽、激素及免疫抑制劑或生物制劑來(lái)維持治療控制癥狀性復(fù)發(fā)。然而5-ASA或柳氮磺吡啶在病情緩解后維持治療效果差，長(zhǎng)期應(yīng)用激素或采用免疫抑制劑或生物制劑有潛在不良反應(yīng)，開(kāi)發(fā)低毒有效治療CD的藥物具有重要意義。我們?cè)谂R床中發(fā)現(xiàn)，CD作為“內(nèi)瘍”，運(yùn)用治療慢性腎病和瘡瘍療效確切的黃蜀葵花以及運(yùn)用烏梅丸煎劑治療均有明顯療效[3-5]。因此，本研究以黃蜀葵花和烏梅中藥飲片為原料制成黃蜀葵花烏梅復(fù)方提取物，采用三硝基苯磺酸（TNBS）制作CD模型小鼠，觀(guān)察藥物對(duì)CD小鼠的治療作用以及對(duì)炎癥因子的干預(yù)效果。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物與試劑 黃蜀葵花烏梅復(fù)方提取物（黃蜀葵花∶烏梅=5∶3）由江蘇省中醫(yī)院制劑部提供，黃蜀葵花和烏梅藥材經(jīng)江蘇省中醫(yī)院朱育鳳主任鑒定合格。Picylsulfonic acid solution（TNBS），sigma，批號(hào):SLBD6811V；無(wú)水乙醇，上海實(shí)意化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):2010030102；小鼠TNF-α Elisa試劑盒，美國(guó)R&D公司，批號(hào):20140321XE；小鼠IFN-γ Elisa試劑盒，美國(guó)R&D公司，批號(hào):20140320SD；BCA蛋白測(cè)定試劑盒，Thermo，23227。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BABL/c小鼠80只，18～22g，雌雄各半，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK（蘇）2012-0004。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、柳氮磺吡啶組和黃蜀葵花烏梅復(fù)方提取物組（簡(jiǎn)稱(chēng)復(fù)方提取物組），每組20只。正常對(duì)照組不造模，正常飼養(yǎng)。模型組、柳氮磺吡啶組和復(fù)方提取物組小鼠剃毛，于皮膚外涂TNBS 3.75mg（用48%乙醇溶解），分別于外涂TNBS后的第7、14、21天直腸給予TNBS 0.75mg、1.5mg、2.25mg（用40%乙醇溶解），誘導(dǎo)CD小鼠模型[6]。

2.2 藥物干預(yù) 黃蜀葵花烏梅復(fù)方提取物臨床人用劑量為0.4g/kg，換算成小鼠用量為6g/kg。柳氮磺吡啶臨床人用劑量為0.033g/kg，換算成小鼠用量為0.5g/kg。藥物干預(yù)與造模同時(shí)進(jìn)行。復(fù)方提取物組給予6g/kg黃蜀葵花烏梅復(fù)方提取物，柳氮磺吡啶組給予0.5g/kg柳氮磺吡啶，正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)灌胃給藥28d。

2.3 觀(guān)察項(xiàng)目 每日記錄小鼠體重和死亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死小鼠，取血。取結(jié)直腸稱(chēng)重，測(cè)量長(zhǎng)度和厚度。在距肛門(mén)5cm、10cm和15cm處分別取結(jié)直腸組織進(jìn)行結(jié)腸炎癥病理評(píng)分和組織炎癥細(xì)胞因子含量檢測(cè)。10%福爾馬林固定，常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，切片經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡觀(guān)察，并根據(jù)文獻(xiàn)[7]進(jìn)行結(jié)腸炎癥病理評(píng)分。將小鼠結(jié)腸組織制成10%組織勻漿，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α和干擾素-γ（IFN-γ）含量；采用BCA試劑盒測(cè)定組織勻漿中蛋白含量，結(jié)果以pg/mg表示。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用（±s）表示，樣本統(tǒng)計(jì)分析采用組間t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠存活率比較 見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠終點(diǎn)生存率明顯降低（P＜0.001）。與模型組比較，復(fù)方提取物組小鼠終點(diǎn)生存率明顯升高（P＜0.05）。復(fù)方提取物組與柳氮磺吡啶組、柳氮磺吡啶組與模型組小鼠終點(diǎn)生存率比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示黃蜀葵花烏梅復(fù)方提取物能提高TNBS誘導(dǎo)的CD模型小鼠的存活率。

表1 各組小鼠存活率比較

3.2 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度/重量比值比較 見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸重量/長(zhǎng)度比值明顯升高（P＜0.001）。與模型組比較，柳氮磺吡啶組和復(fù)方提取物組小鼠結(jié)腸重量/長(zhǎng)度比值明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；復(fù)方提取物組與柳氮磺吡啶組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示黃蜀葵花烏梅復(fù)方提取物能改善TNBS誘導(dǎo)的CD模型小鼠結(jié)直腸炎癥水腫。

表2 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度/重量比值比較（±s）

表2 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度/重量比值比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，###P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量（g/kg） 動(dòng)物數(shù)（只）正常對(duì)照組結(jié)腸重量/長(zhǎng)度（mg/cm）-8 31.63±0.82模型組 41.26±4.10###-8柳氮磺吡啶組 0.5 8 36.07±3.49*復(fù)方提取物組 6 8 31.39±2.92**

3.3 各組小鼠結(jié)腸病變情況及病理評(píng)分比較 見(jiàn)圖1、表3。如圖1所示，正常對(duì)照組（圖1-A）小鼠結(jié)腸未見(jiàn)明顯病變；模型組（圖1-B）小鼠結(jié)腸炎癥嚴(yán)重程度為輕度或中度，多數(shù)累及黏膜層和黏膜下層，個(gè)別累及肌層，多數(shù)見(jiàn)隱窩損害；柳氮磺吡啶組（圖1-C）結(jié)腸炎癥嚴(yán)重程度較模型組明顯減輕，病變均局限于黏膜層，無(wú)隱窩損害；復(fù)方提取物組（圖1-D）結(jié)腸炎癥較模型組明顯減輕，炎細(xì)胞類(lèi)型同前，病變均局限于黏膜層，均無(wú)隱窩損害。病理評(píng)分結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠病理評(píng)分明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，柳氮磺吡啶與復(fù)方提取物組小鼠病理評(píng)分明顯降低（P＜0.05）；復(fù)方提取物組與柳氮磺吡啶組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示黃葵烏梅復(fù)方提取物能顯著改善TNBS對(duì)結(jié)腸的組織損害，其改善作用與柳氮磺吡啶相當(dāng)。

圖1 各組小鼠結(jié)腸病理圖片（HE染色，×200）

表3 各組小鼠結(jié)腸病理評(píng)分比較（±s） 分

表3 各組小鼠結(jié)腸病理評(píng)分比較（±s） 分

注：與正常對(duì)照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 劑量（g/kg） 動(dòng)物數(shù)（只）正常對(duì)照組病理評(píng)分-80.67±0.36模型組 9.88±2.63#-8柳氮磺吡啶組 0.5 8 3.63±0.42*復(fù)方提取物組 6 8 2.00±0.41*

3.4 各組小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ含量比較 見(jiàn)表4。與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α和IFN-γ含量明顯升高 （P＜0.001）；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和復(fù)方提取物組TNF-α和IFN-γ含量明顯降低（P＜0.01、P＜0.001）；復(fù)方提取物組與柳氮磺吡啶組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示黃蜀葵花烏梅復(fù)方提取物能降低TNBS誘導(dǎo)的CD模型小鼠結(jié)腸組織炎癥。

表4 各組小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ含量比較（±s，n=8）

表4 各組小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ含量比較（±s，n=8）

注：與正常對(duì)照組比較，###P＜0.001；與模型組比較，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別 劑量（g/kg） 動(dòng)物數(shù)（只）TNF-α（pg/mg） IFN-γ（pg/mg）正常對(duì)照組-8190.2±29.4 263.7±80.4模型組 - 8 328.2±69.2###549.6±149.0###柳氮磺吡啶組 0.5 8 210.8±38.3**325.7±97.8**復(fù)方提取物組 6 8 151.1±22.0***150.2±25.8***

4 討論

江蘇省中醫(yī)院劉沈林教授認(rèn)為，克羅恩病屬于虛實(shí)互見(jiàn)、寒熱錯(cuò)雜證候，治療常采用寒熱并用的代表方劑烏梅丸。CD患者出現(xiàn)免疫功能紊亂，表現(xiàn)出以炎性浸潤(rùn)為特征的黏膜損傷及顯著的纖維化，黃蜀葵花能調(diào)節(jié)免疫功能、抗腎間質(zhì)纖維化，本院黃蜀葵花制劑瘡靈液對(duì)克羅恩病肛瘺等低位單純性肛瘺療效確切[8]。為此，我們?cè)谥嗅t(yī)理論和臨床實(shí)踐指導(dǎo)下，開(kāi)展黃蜀葵花和烏梅復(fù)方治療炎癥性腸病的研究。

TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎動(dòng)物模型為免疫介導(dǎo)的腸道炎癥模型，引起以Th1為主的免疫應(yīng)答，病變特點(diǎn)類(lèi)似于克羅恩病[9]。本研究結(jié)果表明，TNBS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎模型較好地體現(xiàn)了CD從急性炎癥向慢性炎癥轉(zhuǎn)化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，適用于CD中藥復(fù)方物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)，而黃蜀葵花和烏梅組成的復(fù)方提取物能顯著提高模型小鼠的存活率，降低結(jié)腸重量/長(zhǎng)度比值，改善結(jié)腸病變程度，降低結(jié)腸病理評(píng)分，表明其對(duì)CD有較好的治療作用。

細(xì)胞因子與炎癥性腸?。↖BD）發(fā)病密切相關(guān)，其中TNF-α和IFN-γ為重要的促炎癥因子和免疫調(diào)節(jié)因子，阻斷TNF-α和IFN-γ的產(chǎn)生、調(diào)控以及作用途徑可以控制炎癥和緩解病情。本研究結(jié)果表明，TNBS誘導(dǎo)的模型小鼠結(jié)腸組織中TNF-α和IFN-γ含量升高，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），這與相關(guān)臨床研究報(bào)道結(jié)果一致[10-11]。黃蜀葵花烏梅復(fù)方提取物能顯著降低模型組小鼠升高的TNF-α和IFN-γ含量，考慮這是其治療CD可能的機(jī)制之一。而CD的發(fā)病涉及細(xì)菌的識(shí)別與自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、上皮功能障礙、T細(xì)胞分化、氧化應(yīng)激和黏膜免疫防御等多個(gè)方面，考慮到中藥的多靶點(diǎn)作用，進(jìn)一步將從其他致病因素角度深入研究黃蜀葵花烏梅復(fù)方提取物治療CD的作用機(jī)制。

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R570.5

A

1672-397X（2015）03-0080-03

王瓊（1982-），女，藥學(xué)博士，主管藥師，研究方向：腸道炎癥及炎癌轉(zhuǎn)化藥物調(diào)控研究。

陳玉根，教授，博士生導(dǎo)師。chenyg666@126.com

2014-10-09

編輯：吳 寧

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；南京市科技發(fā)展指導(dǎo)性計(jì)劃南京藥學(xué)會(huì)—常州四藥項(xiàng)目（2013YX008）