黃財(cái)順，李寶才，向 誠(chéng)，2*

1昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500;2 北京大學(xué)天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191

口服藥物吸收的主要場(chǎng)所是胃腸道，胃腸液的消化作用可能使藥物降解失活，所以進(jìn)行胃腸道的穩(wěn)定性研究具有一定的價(jià)值。人工胃腸液模型主要包括人工胃液和人工腸液孵育，制作簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，有助于了解藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性情況，探討影響藥物穩(wěn)定性的因素，有助于指導(dǎo)藥物結(jié)構(gòu)優(yōu)化和制劑的開(kāi)發(fā)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用［1-7］。然而各家的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、考慮因素差異較大，例如人工胃液的作用時(shí)間少則5 min，多則可達(dá)24 h［10］;人工腸液的作用時(shí)間少則10 min，多則可達(dá)24 h;是否需要邊孵化邊攪拌以模擬腸胃蠕動(dòng)，也沒(méi)有統(tǒng)一;其他因素的設(shè)定也沒(méi)有統(tǒng)一規(guī)范，故本文對(duì)影響藥物在人工胃腸液中穩(wěn)定性的主要因素、因素范圍及其分析方法進(jìn)行了綜述，并提出包括時(shí)間、pH 值、酶濃度和攪拌速度在內(nèi)的四因素析因設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方法，為更好地采用該模型進(jìn)行研究提供參考依據(jù)。

1 人工胃腸液模型用于藥物穩(wěn)定性研究的基本操作

《中國(guó)藥典》(2010 版)記載的人工胃腸液的配制方法為:稀鹽酸16.4 mL，加水約800 mL 與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋成1000 mL;人工腸液的配制方法為:取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL 使溶解，用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至6.8，取胰酶10 g，加水量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1000 mL 即得。

利用人工胃、腸液模型研究藥物的消化穩(wěn)定性主要包括以下步驟:1、配制人工胃液和腸液;2、將待測(cè)藥物稀釋成一定濃度加入到配好的人工胃液和腸液中，并設(shè)計(jì)孵化溫度和時(shí)間，定時(shí)取出孵化液樣品;3、樣品經(jīng)過(guò)處理后進(jìn)行含量檢測(cè)，綜合分析后可知該藥物在胃腸道中的穩(wěn)定性情況。

2 人工胃腸液模型的主要考察因素和實(shí)驗(yàn)方法

影響藥物在人工胃、腸液中的穩(wěn)定性的因素除了藥物本身性質(zhì)以外主要還有五個(gè)，分別是1.胃、腸液的pH;2.胃、腸蛋白酶;3.胃腸道作用時(shí)間;4.胃腸道溫度;5.胃腸蠕動(dòng)速度。

若想詳細(xì)認(rèn)識(shí)藥物在胃、腸液中的穩(wěn)定性情況，有必要規(guī)范操作對(duì)各因素做系統(tǒng)的分析。目前，大部分學(xué)者采用以下四種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法:簡(jiǎn)單分析、單因子分析、雙因子分析、胃液-腸液整體分析的方法。

2.1 簡(jiǎn)單分析

簡(jiǎn)單分析是指直接用《中國(guó)藥典》規(guī)定的人工胃、腸液處理藥物，時(shí)間等因素不做考慮。例如尚曉婭等［6］用此類(lèi)方法對(duì)抗性淀粉進(jìn)行了體外穩(wěn)定性研究;伍妍俊等［8］對(duì)甲基化EGCG 的合成及其在人工模擬胃、腸液中的穩(wěn)定做了研究。以上研究均直觀地表明了藥物穩(wěn)定性是否受人工胃、腸液的影響。該分析方法較簡(jiǎn)單，以含量的變化為指標(biāo)就能判斷藥物在消化模型中是否穩(wěn)定，但不能分析原因。

2.2 單因子分析

單因子分析方法是目前采用較多的方法，多以胃腸道作用時(shí)間作為單因子，以一定的時(shí)間間隔點(diǎn)抽取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析。例如金暉等［9］探討南瓜多糖在人工胃液中的穩(wěn)定性情況，經(jīng)30、90、150、720 min 作用后，還原糖及分子量的變化表明南瓜多糖在人工胃液中隨時(shí)間的延長(zhǎng)降解程度越大。周園等［10］對(duì)煙酰水楊酸在人工胃、腸液中10 min、30 min、1、2、3、4、5、6、10、18、24 h 分別取樣，結(jié)果顯示煙酰水楊酸在人工腸液中的降解程度較人工胃液的大，且隨作用時(shí)間延長(zhǎng)降解率更高。冼小敏等［11］制備燕窩水提物，分別與等體積的人工胃、腸液混合，37 ℃消化，按時(shí)間梯度0、1、5、10、15、30、60 min 準(zhǔn)確計(jì)時(shí)并終止反應(yīng)，SDS-PAGE 凝膠電泳方法檢測(cè)燕窩蛋白質(zhì)的降解情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)燕窩蛋白降解物沒(méi)有隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增多。這類(lèi)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以得到消化時(shí)間對(duì)藥物穩(wěn)定性的影響。

2.3 雙因子分析

雙因子分析方法是另外一種應(yīng)用較廣泛的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法:即以胃腸道消化酶和pH 作為雙因子，考察pH、消化酶和作用時(shí)間對(duì)藥物穩(wěn)定性的影響。主要出現(xiàn)以下四種情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

情況一:藥物在人工胃、腸液(酸堿環(huán)境+消化酶)和不含消化酶的人工胃、腸液NE(僅含酸堿環(huán)境)中均穩(wěn)定，即可推斷該藥物可能耐受胃、腸液的酸堿環(huán)境和消化酶。陳國(guó)慶等［12］以此方法對(duì)四乙酰葛根素的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)四乙酰葛根素在人工腸液和不含胰蛋白酶的人工腸液NE 中穩(wěn)定性均很好，推斷四乙酰葛根素在人工腸液中穩(wěn)定性較好，可開(kāi)發(fā)腸溶制劑。

情況二:藥物在人工胃、腸液中不穩(wěn)定，但在人工胃、腸液NE 中穩(wěn)定性良好，即可推斷影響穩(wěn)定性的最主要因素是胃、腸蛋白酶。榮娜娜等［13］以人工胃、腸液和不含蛋白酶的人工胃、腸液NE 處理燈盞花乙素，并間隔0.5 h 取樣，發(fā)現(xiàn)燈盞花乙素在人工胃液中不穩(wěn)定，從0.5 h 到2.5 h 之間出現(xiàn)降解產(chǎn)物，在空白人工胃液NE 中沒(méi)有任何變化。據(jù)此推斷，胃蛋白酶是影響燈盞花乙素穩(wěn)定性的主要因素。

情況三:藥物在人工胃、腸液和人工胃、腸液NE中均不穩(wěn)定，且二者對(duì)藥物穩(wěn)定性的影響基本相同，即可推斷影響穩(wěn)定性的最主要因素是胃液pH。馬劍敏等［14］以此方法處理過(guò)辣根氧化物酶，并于不同時(shí)間點(diǎn)取樣，結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)人工胃液與人工胃液NE 對(duì)HRP 穩(wěn)定性的影響基本相同，反映出胃液pH 是影響HRP 穩(wěn)定性的主要因素;汪景長(zhǎng)等［15］研究超氧化物歧化酶在模擬胃腸道中穩(wěn)定性時(shí)以同樣的方法反映出天然超氧化物歧化酶對(duì)胃蛋白酶具有較強(qiáng)的耐受力，對(duì)其穩(wěn)定性最直接的影響可能是由胃酸造成的。

情況四:人工胃、腸液對(duì)藥物穩(wěn)定性的影響比人工胃、腸液NE 的大，即可推斷胃、腸pH 及消化酶均對(duì)藥物穩(wěn)定性有影響。葉盛英等［16］以此方法研究重組人表皮生長(zhǎng)因子在人工胃液和腸液中的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)人工胃、腸液和人工胃、腸液NE 對(duì)重組人表皮生長(zhǎng)因子的穩(wěn)定性均有影響，且酶存在時(shí)重組人表皮生長(zhǎng)因子的降解更明顯，反映了胃、腸液pH和蛋白酶對(duì)重組人表皮生長(zhǎng)因子的穩(wěn)定性均有影響。米坤等［17］對(duì)芽孢桿菌纖溶酶進(jìn)行穩(wěn)定性的研究，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌纖溶酶在人工胃液和人工胃液NE中活性均下降，且在人工胃液中失活率更高，所以人工胃液的強(qiáng)酸性及胃蛋白酶的存在對(duì)芽孢桿菌纖溶酶的穩(wěn)定性均有影響。

2.4 胃液-腸液整體分析

若需要更詳細(xì)了解藥物在整個(gè)胃腸道消化吸收中的穩(wěn)定性，可使用人工胃液和人工腸液串聯(lián)式的研究方法，即將人工胃液處理后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至人工腸液中繼續(xù)反應(yīng)。例如王玉蓉等［18］在腸安康膠囊的體外釋藥考察研究中，將人工胃液處理后的腸安康膠囊轉(zhuǎn)移至人工腸液中，更準(zhǔn)確得知藥物在人工胃液中1 h 后約釋放藥物17%左右，在人工腸液中5 h 后基本釋藥完全;Lee BJ 等［19］以同樣的方法，發(fā)現(xiàn)藥物在二者中的釋藥情況完全不一樣，藥物在胃液中釋放平穩(wěn)，卻在腸液中線形釋放。McDougal GJ［20］、Kerstin F［21］等也有類(lèi)似研究，較為完整系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了藥物在消化過(guò)程中的穩(wěn)定性，更有效地指導(dǎo)藥物制劑開(kāi)發(fā)。

表1 常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法Table 1 Commonly used experimental designs

3 人工胃腸液模型的應(yīng)用

口服藥物在胃腸道中的穩(wěn)定性將直接影響藥物的吸收。人工胃腸液模型在新藥開(kāi)發(fā)中可針對(duì)上述影響因素，指導(dǎo)新藥或新劑型的開(kāi)發(fā)，以提高藥物的穩(wěn)定性，方法主要包括制備該藥物的前藥和改良劑型。除此以外，還可以對(duì)胃腸道內(nèi)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物做簡(jiǎn)單分析。

3.1 指導(dǎo)前藥的制備

通過(guò)藥物的穩(wěn)定性研究，可以指導(dǎo)前藥的設(shè)計(jì)。胃液的強(qiáng)酸性環(huán)境是引起抗生素類(lèi)藥物失效的主要因素，把它們制備成前藥是增強(qiáng)其穩(wěn)定性的主要方法。例如紅霉素在酸性溶液中也容易分解失效，因此將紅霉素制成難溶性的酯［22］。除抗生素類(lèi)藥物外，某些藥物也可以進(jìn)行衍生化而提高其穩(wěn)定性。伍妍俊等［8］研究甲基化的EGCG 在人工胃腸液中的穩(wěn)定性，結(jié)果EGCG4dMe 由于甲基化，穩(wěn)定性提高。

3.2 指導(dǎo)劑型的改良

通過(guò)藥物的穩(wěn)定性研究，可針對(duì)性地對(duì)現(xiàn)有劑型進(jìn)行改良，提高藥物的吸收率。若腸道環(huán)境是影響其穩(wěn)定性的主要因素，那么可將其設(shè)計(jì)成胃滯留片，例如Wei ZP 等［23］設(shè)計(jì)了一種胃滯留片以提高藥物的穩(wěn)定性。若胃腸道的作用時(shí)間是影響其穩(wěn)定性的主要因素，那么可根據(jù)其起效的時(shí)間規(guī)律進(jìn)行設(shè)計(jì)，例如茶堿在胃液中隨作用時(shí)間延長(zhǎng)降解率升高，但茶堿需在夜間有一定的吸收才能有效治療疾病，因此Danckwerts MP 等［24］設(shè)計(jì)了一種三階段釋藥的緩釋片劑，該片劑能在腸液中穩(wěn)定存在并持續(xù)釋放茶堿。若胃腸液pH 和消化酶是影響穩(wěn)定性的主因，那么可將其進(jìn)行包衣以抵御酸堿環(huán)境和消化酶，例如蛋白質(zhì)類(lèi)藥物易受胃腸道pH 和消化酶的影響，為解決這一問(wèn)題，Nadia Rasool 等［25］用胰島素作為模式藥物，成功制備了能有效抵御胃液和消化酶的水凝膠包衣材料;Anal AK 等［26］以殼聚糖和藻酸鹽作為包衣材料，設(shè)計(jì)了一種能有效抵御胃酸和胃腸道消化酶的丸劑。

類(lèi)似的針對(duì)影響因素，提高藥物的胃腸道穩(wěn)定性的新劑型主要有環(huán)糊精包合物［27］、微球［28］、微乳［29］、腸溶劑［30］等。

3.3 代謝產(chǎn)物的檢測(cè)

胃腸道是藥物代謝轉(zhuǎn)化的重要場(chǎng)所，人工胃腸液作為模擬體內(nèi)的體外模型，雖不能完全代表體內(nèi)消化情況，卻也可能發(fā)生代謝反應(yīng)，尤其是人工腸液。例如迷迭香酸在人工腸液中反應(yīng)生成兩個(gè)代謝產(chǎn)物，應(yīng)用液相LC-MS 技術(shù)鑒定為丹參素和咖啡酸［31］。但也有體內(nèi)在腸道發(fā)生代謝反應(yīng)，而在人工腸液中不發(fā)生代謝的情況［32］，因?yàn)榇蟛糠炙幬锏拇x是由于腸內(nèi)菌引起的［33，34］，因此可考慮在人工腸液中加入腸內(nèi)菌以更真實(shí)地模擬腸內(nèi)代謝反應(yīng)。

4 現(xiàn)行方法存在的不足

仔細(xì)分析藥物的胃腸道情況，方能正確指導(dǎo)制劑的開(kāi)發(fā)，提高藥物的穩(wěn)定性，但目前藥物在胃、腸液中穩(wěn)定性因素的分析方法普遍存在以下四方面的不足:1.采用的單因子和雙因子分析方法不夠全面，沒(méi)有考慮因子間可能產(chǎn)生的先后交互作用，各因素可能以先后順序?qū)λ幬锓€(wěn)定性產(chǎn)生影響。例如汪景長(zhǎng)等［35］發(fā)現(xiàn)天然結(jié)構(gòu)的超氧化物歧化酶先經(jīng)過(guò)胃液的酸化才能被消化酶降解，而傳統(tǒng)的分析方法只能得出影響因素是pH 和消化酶;2.胃腸道作用時(shí)間設(shè)計(jì)較隨意，沒(méi)有根據(jù)胃、腸的生理情況進(jìn)行設(shè)計(jì)。綜述的文獻(xiàn)顯示:人工胃液的作用時(shí)間少則5 min，多則可達(dá)24 h;人工腸液的作用時(shí)間少則10 min，多則也可達(dá)24 h，而且部分時(shí)間的設(shè)計(jì)跨度較大，取樣點(diǎn)多，大大增加了工作量而無(wú)實(shí)際意義;3.大部分實(shí)驗(yàn)沒(méi)有對(duì)胃、腸液pH 進(jìn)行設(shè)計(jì)。正常情況下，人體胃液的pH 值范圍是1～4，空腹時(shí)胃液pH 值可為0.9～1.5，飲水或進(jìn)食后可上升到3.0～5.0，這些范圍內(nèi)的pH 值對(duì)某些藥物的穩(wěn)定性產(chǎn)生的影響是不一樣的。例如張明等［36］用不同pH 的人工胃液處理非厭氧下HJ9211 凍干雙歧桿菌，結(jié)果表明雙歧桿菌在pH 為2～3 時(shí)失活率較接近，pH為1 時(shí)失活很明顯。4.傳統(tǒng)的分析方法沒(méi)能考慮胃腸道蠕動(dòng)的情況。腸胃蠕動(dòng)有助于磨碎食物并將其逐步向后推移，體外試驗(yàn)雖難以實(shí)現(xiàn)，但簡(jiǎn)單的震蕩攪拌也有很好的模擬效果，不同的攪拌速度可模擬腸胃的蠕動(dòng)情況。因此，胃腸道蠕動(dòng)也應(yīng)作為考察因素，目前已有少數(shù)實(shí)驗(yàn)將人工胃腸液結(jié)合攪拌更真實(shí)地模擬體內(nèi)消化［37-39］，只是設(shè)計(jì)有待改善。

5 展望

綜述各文獻(xiàn)后，本文認(rèn)為可以采用析因設(shè)計(jì)［40］的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)影響藥物穩(wěn)定性的四個(gè)主要因素進(jìn)行分析。其優(yōu)點(diǎn)是效率更高、可評(píng)估因子間的交互作用。除此以外，根據(jù)胃腸道的生理?xiàng)l件，小腸對(duì)藥物的吸收程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于大腸，因此主要以小腸的生理?xiàng)l件為依據(jù)對(duì)消化液pH 值和消化時(shí)間［41，42］進(jìn)行設(shè)計(jì)，調(diào)整攪拌器速度以模擬腸胃蠕動(dòng)［37］，方案見(jiàn)表2、3。若最后發(fā)現(xiàn)所研究藥物在腸液中不穩(wěn)定，需要在胃液中提高吸收，可對(duì)人工胃液的作用時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，根據(jù)的是胃滯留片［43］的一般作用時(shí)間，可設(shè)為8、12、16、20、24 h。

本試驗(yàn)涉及四個(gè)試驗(yàn)因素:消化酶、時(shí)間、pH 和攪拌速度，觀察指標(biāo)為降解率，可采用SPSS 軟件進(jìn)行多因素方差分析，將四個(gè)因素對(duì)降解率影響的主次關(guān)系進(jìn)行分析，可得到多個(gè)因素單獨(dú)作用和交互作用的信息。

表2 人工胃液中影響藥物降解的因素分析Table 2 The influence factors of gastric fluid in the drug degradation

表3 人工腸液中影響藥物降解的因素分析Table 3 The influence factors of intestinal fluid in the drug degradation

長(zhǎng)期以來(lái)，人工胃腸液模型主要用于藥物的穩(wěn)定性研究，但本文認(rèn)為其也可應(yīng)用于中藥和天然產(chǎn)物活性成分的篩選。中藥和天然藥物多口服且成分復(fù)雜，一般而言，其在胃腸道穩(wěn)定存在的成分才可能吸收入血、發(fā)揮藥效。篩選中藥和天然藥物中消化穩(wěn)定的成分，將縮小研究范圍，再進(jìn)行針對(duì)性分離、鑒定和活性篩選，將提高篩選的成功率。

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