陳德經(jīng)，徐偉良，蘇 文，季曉暉

1陜西理工學(xué)院陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院;3 陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，漢中 723001

多糖(Polysaccharides)又稱多聚糖，是自然界中含量最豐富的一種生物聚合物［1］，而從動物中提取的天然多糖因具有良好的抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，使得對動物多糖的研究日益增多和深入［2，3］。

大鯢(Andrias davidianusBlanchard)屬大型兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，是國家二級保護(hù)動物，有活化石之稱［4］。大鯢皮膚腺體主要有粘液腺(mucus gland)和顆粒腺(granular gland)兩種，粘液腺體細(xì)胞可釋放粘糖蛋白，與水結(jié)合后成為黏液，覆蓋在上皮游離面，形成了一道天然的防護(hù)屏障［5，6］。有學(xué)者從大鯢體表黏液獲得了大鯢低聚糖肽，并證明了該糖肽具有抗氧化、抗疲勞及對小鼠急性肝損傷有一定的保護(hù)作用［7-9］。大鯢皮膚顆粒腺能夠分泌具有特殊性氣味的白色粘稠狀粘液，其成分是含有豐富的功能復(fù)雜多樣的生物活性分子，具有廣普抗菌、抗腫瘤等作用［10，11］。

本論文采用水提法、酶解法、堿提法及酸提法對大鯢皮膚粘液中的多糖進(jìn)行提取，并采用柱前衍生高效液相色譜法對大鯢皮膚粘液多糖的單糖組分進(jìn)行分析，為大鯢皮膚粘液多糖開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

成熟大鯢，陜西漢源生物科技有限公司提供;衍生化試劑:1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)購自上海濤宇國際貿(mào)易有限公司;葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcN)均為中檢所產(chǎn)品;D-氨基半乳糖(GalN)，購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;堿性蛋白酶、酸性蛋白酶，購自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司;三氟乙酸(≥99%)，乙腈(色譜純)，其它試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1200 高效液相色譜(包括G1311A 四元泵，G1315B DAD 檢測器，G1316A 柱溫箱);XDBC18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，美國Agilent 公司);722G 可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司);LC-800 低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司);KQ-100DA 型數(shù)控超聲清洗器(蘇州江東精密儀器有限公司);601 超級水浴(江蘇-瑞華儀有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鯢皮膚粘液的采集

采用機(jī)械刺激法。用軟毛刷輕輕拍打或按摩大鯢背部、尾部等皮膚分泌腺較多部位，對其進(jìn)行溫和刺激，使大鯢分泌產(chǎn)生白色粘液，并刮取粘液裝入收集瓶中。將采集的大鯢粘液真空冷凍干燥成凍干粉，于-20 ℃下保存待用。

1.2.2 大鯢皮膚粘液多糖的提取及分離

1.2.2.1 堿提法

多糖在堿性溶液中穩(wěn)定，而蛋白聚糖中的糖肽鍵對堿具有不穩(wěn)定性，因此可通過該法使多糖與結(jié)合態(tài)蛋白的糖肽鍵斷裂，從而提高多糖得率。準(zhǔn)確稱量5 g 大鯢皮膚粘液凍干粉，以0.4 mol/L 氫氧化鈉溶液在料液比為1∶25 g/mL，溫度為45 ℃下，提取2 h［12］;將提取液以4000 rpm，離心15 min，上清液加入無水乙醇醇沉至終濃度為76%，調(diào)pH 至7.0 左右，于4 ℃冰箱中靜置8 h;離心去除上清液，沉淀用無水乙醇洗滌三次后進(jìn)行真空干燥。

1.2.2.2 酸提法

基于醛酸性多糖對酸具有不穩(wěn)定性，酸提取有助于多糖與結(jié)合態(tài)蛋白的醛酸鍵斷裂，從而提高多糖得率及純度。準(zhǔn)確稱量5 g 大鯢皮膚粘液凍干粉，以料液比1∶25 g/mL，濃度為0.3 mol/L 鹽酸，在45 ℃，提取2 h［13，14］。將提取液以堿提法同樣步驟進(jìn)行離心、醇沉、干燥。

1.2.2.3 水提法

多糖是極性大分子化合物，大多數(shù)多糖易溶于熱水，用水提取較溫和，適用于透明質(zhì)酸等不含硫酸基多糖的提取。準(zhǔn)確稱量5 g 大鯢皮膚粘液凍干粉，在料液比1∶25 g/mL，提取溫度45 ℃條件下，提取2 h［15］。將提取液以堿提法同樣步驟進(jìn)行離心、醇沉。

1.2.2.4 酶解法

選用來源廣泛且專一性低的堿性蛋白酶和酸性蛋白酶為試驗(yàn)用酶，蛋白酶易使糖蛋白和蛋白聚糖中游離的蛋白質(zhì)水解，降低它們對原料的結(jié)合力，有利于多糖的浸出。準(zhǔn)確稱量5 g 大鯢皮膚粘液凍干粉2 份，在料液比1∶25 g/mL，酶解溫度45 ℃，酶添加量均為2.5%的條件下，分別加入pH 值為9.0 的堿性蛋白酶和pH 值3.0 的酸性蛋白酶，對樣品進(jìn)行酶解2h［16］。將提取液以堿提法同樣步驟進(jìn)行離心、醇沉。

1.2.3 Sevage 法脫蛋白

將氯仿與正丁醇按體積比4∶1 混合制成Sevage除蛋白液，按不同提取方法所得大鯢粘液多糖溶液按體積的1/4 加入除蛋白液，混合后，劇烈振蕩10 min，靜置;離心去除變性蛋白，重復(fù)數(shù)次，至無變性蛋白質(zhì)析出為止。再經(jīng)MW 3500 Da 透析袋透析去除小分子雜質(zhì)，濃縮，真空冷凍干燥，得大鯢粘液粗多糖，并利用公式(1)計(jì)算得率。

1.2.4 大鯢皮膚粘液多糖含量的測定——硫酸蒽酮法［17］

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取0.1 g 葡萄糖，用雙蒸水定容至100 mL，分別取出0.5、1、2、3、4、5 mL 分別加入到50 的容量瓶中，并用雙蒸水定容至50 mL，配成濃度分別為10、20、40、60、80、100 μg/mL，以雙蒸水做對照空白，各取1 mL 于試管中，再加入4 mL 蒽酮試劑(2 g/L)，迅速浸入冰水中冷卻，待幾只試管均勻加完后，一起浸入100 ℃沸水中。自溫度重新升至100℃起計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確保溫10 min 后取出，用流動水冷卻。在分光光度計(jì)上，進(jìn)行光譜掃描，檢測在波長620 nm 有最大吸收峰，并選擇620 nm 檢測波長，進(jìn)行比色，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 樣品的測定

稱取0.1 g 大鯢脫蛋白多糖干燥粉，用去離子水定容至10 mL 容量瓶中，超聲震蕩30 min，以4000 rpm，離心10 min，取1 mL 上清液定容至10 mL容量瓶中待用。如上述條件一致，取1 mL 粗多糖樣品進(jìn)行比色，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算粗多糖濃度，并以公式(2)計(jì)算多糖含量。

1.2.5 HPLC 測定大鯢皮膚粘液多糖的單糖組成成分［18，19］

1.2.5.1 大鯢皮膚粘液多糖的水解及樣品制備

吸取100 μL 質(zhì)量濃度為4～5 g/L 的精制多糖樣品溶液于5 mL 的具塞刻度試管中，加入100 μL的4 mol/L TFA，充N2封管，110 ℃烘箱中水解2 h;冷卻后打開蓋，加100 μL 甲醇后用N2吹干，如此重復(fù)加甲醇并用N2吹3 次，去除TFA。

加入50 μL 0.3 mol/L NaOH 溶液充分溶解殘?jiān)?，再?0 μL 0.5mol/L 的PMP(0.4355 g/5mL)甲醇溶液，漩渦混勻，同樣在70 ℃的烘箱中反應(yīng)100 min，取出放置10 min 冷卻至室溫;加50 μL 0.3 mol/L 的HCL 中和;加水至1 mL，再加等體積的氯仿，振搖，靜置，棄去氯仿相，如此萃取3 次。將水相用0.45 μm 微孔膜過濾后供HPLC 進(jìn)樣分析。

1.2.5.2 混合單糖標(biāo)樣的衍生

分別取100 μL 的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液(各單糖質(zhì)量濃度均為0.36 g/L)與100 μL 的0.6 mol/L NaOH溶液，置于1 mL 的具塞試管中混合均勻;再取50 μL 的混合液于5 mL 的具塞試管中，加50 μL 0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液，漩渦混勻;在70 ℃烘箱中反應(yīng)100 min;冷卻后按“1.2.5.1”同法中和、萃取，并用微孔膜過濾。

1.2.5.3 色譜條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18(250mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:0.05 mol/L 磷酸鹽(pH 6.9)緩沖液-乙腈(83∶17，V/V);柱溫:30 ℃;檢測波長:250 nm;流速:1 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 大鯢皮膚粘液多糖得率及含量

不同提取方法所得多糖得率與脫蛋白后所測多糖含量結(jié)果如表1 所示。

表1 大鯢皮膚粘液多糖的得率及總糖含量Table 1 The polysaccharides yield and total sugar content in skin mucus of A.davidianus

由1 表可知，堿提取多糖的得率最高，為3.85%;堿酶提取多糖得率次之，為3.09%;水提取和酸提取多糖的得率較低，分別為1.76%、1.40%。堿提取、酸提取、水提取、堿酶提取和酸酶提取多糖中總糖含量分別為4.23%、1.54%、1.81%、3.71%、2.19%。

2.2 大鯢皮膚粘液多糖的單糖組成測定

2.2.1 色譜分離條件的優(yōu)化

選擇磷酸鹽緩沖液-乙腈為流動相對PMP-單糖衍生物進(jìn)行色譜分離，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道有梯度洗脫和等度洗脫兩種方式［20-22］。先采用梯度洗脫模式:以溶劑A-15%(V/V)乙腈+50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)，溶劑B-40 %(V/V)乙腈+50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)作為流動相;時(shí)間梯度為0 min →9 min →25 min，相應(yīng)濃度體梯度為0% →10% →55%B，進(jìn)行色譜分離。再采用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.7)-乙腈為流動相，進(jìn)行等度洗脫分離。結(jié)果顯示:梯度洗脫分離的7 種單糖峰形效果并不理想，2 種糖醛酸和2 種氨基單糖不能很好的分離。而利用等度洗脫，通過對分離條件選擇的系列試驗(yàn)(包括緩沖液pH 值，乙腈體積分?jǐn)?shù)及緩沖液濃度的選擇)，能夠?qū)? 種單糖得到較好的分離，且重現(xiàn)性好，如圖1。并最終確定最佳色譜條件為:流動相:A-0.05mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 6.9)+B-乙腈，體積比為A∶B=83∶17(V/V)。

圖1 混合單糖的PMP 衍生化產(chǎn)物的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograph of PMP-labeled standard monosaccharides

2.2.2 衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性的考察

為了考察7 種單糖標(biāo)樣衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)中從反應(yīng)結(jié)束后開始計(jì)時(shí)，分別于6、8、10、12、16、20、24、32 h 進(jìn)行色譜分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在反應(yīng)結(jié)束后12 h 內(nèi)各種單糖衍生物的峰面積基本保持不變，20 h 以后，各峰面積有不同程度的減少，32 h 后單糖峰面積減少近30%左右。因此，檢測需要在反應(yīng)結(jié)束后20 h 內(nèi)完成，以得到準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

將7 種單糖配制成一系列不同濃度的混合標(biāo)樣，分別進(jìn)行衍生化，并在相同條件下進(jìn)樣檢測，以單糖濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明各單糖在0.1～2.0 μmol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表2。

表2 7 種單糖的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Table 2 Regression equations，correlation coefficients and linear ranges of seven monosaccharides

表3 不同提取方法所得多糖的單糖組分及摩爾比Table 3 monosaccharide composition and molar ratio under different extraction methods

2.2.4 不同提取方法所得多糖的單糖組成分析結(jié)果

經(jīng)PMP 柱前衍生測得不同提取方法所得多糖的單糖組成及摩爾比如下，堿提取，Man∶GlcUA∶GalUA∶GlcN∶Glc∶Gal=1.71∶4.12∶1.09∶1.55∶1.01∶2.09，如圖2-a;酸提取，Man∶GlcUA=0.101∶2.31，如圖2-b;水提取，Man∶GlcUA∶Glc=0.01∶1.68∶0.11，如圖2-c;堿酶提取，Man∶GlcUA∶GlcN=0.102∶8.79∶6.02，如圖2-d;酸酶提取，Man∶GlcUA∶Glc=0.11∶2.64∶1.23，如圖2-e。通過上述測定結(jié)果顯示，堿提取多糖中含有6 種單糖組分，而酸提取多糖中僅含有2 種單糖組分，這是由于在堿性條件下，多糖穩(wěn)定，易使多糖與結(jié)合態(tài)蛋白的糖肽鍵斷裂，利于多糖的浸出，而在酸性條件下容易引起多糖中糖苷鍵的斷裂，使多糖結(jié)構(gòu)破壞。水提法和酶解法條件較溫和，適用于酸性粘多糖的提取，所得多糖主要由Man、GlcUA 和Glc 3 種單糖組成［23，24］。

圖2 不同提取方法所得多糖的-PMP 衍生化產(chǎn)物的色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of PMP derivative products from different polysaccharide extracts

3 結(jié)論

本文研究了不同提取方法提取大鯢粘液多糖，其中堿提取大鯢粘液多糖的得率和含量均較高，適用于大鯢多糖的提取分離。建立的PMP 柱前衍生化高效液相色譜分析單糖的方法準(zhǔn)確可靠，靈敏度較高，能夠較好地測定大鯢皮膚粘液多糖的單糖組分。PMP 柱前衍生測得結(jié)果表明，不同提取方法所得大鯢粘液多糖的單糖組成成分及含量盡管各不相同，但主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖3 種單糖成分組成。該方法對動物多糖樣品的組成分析具有一定指導(dǎo)意義，亦為大鯢皮膚粘液多糖的開發(fā)利用提供了依據(jù)。

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