毛東霞 ，阮芹芹，趙 敏，郭丹丹，王 苗，田曉雪，劉 陶*

1陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710100;2 長慶油田分公司油氣工藝研究院，西安 710021

黃酮類化合物(Flavonoids)是以C6-C3-C6 結(jié)構(gòu)為基本母核的色原烷或色原酮的衍生物［1］。黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、降血脂、抗腫瘤等藥理作用［2］，在葛根、黃芩、桑白皮、銀杏葉等中藥及大型藥用真菌桑黃的藥理作用中扮演著重要角色。

各類樣品中黃酮類物質(zhì)含量的檢測方法主要包括分光光度計(jì)比色法、氣相色譜法(Gas Chromatography，GC)、高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、毛細(xì)管電泳等［3］。其中分光光度計(jì)比色法是被中國藥典所采用的最常見的總黃酮測定方法，而其中又以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法最為常用［4］。NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法測定原理主要是基于黃酮類化合物的紫外吸收光譜中的環(huán)肉桂酰系統(tǒng)引起的吸收帶I(300～550 nm)和環(huán)苯酰系統(tǒng)引起的吸收帶Ⅱ(220～280 nm)。鋁離子可以與黃酮類化合物形成穩(wěn)定的配合物，從而使帶Ⅱ發(fā)生紅移［5］;在NaNO2的強(qiáng)堿性溶液中，其在510 nm 處具有最大吸收值，從而為NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法測定黃酮類化合物提供了依據(jù)［6］。王勇等［7］使用硝酸鋁顯色法、直接測定法、三氯化鋁顯色法對(duì)4 種甘草中黃酮含量測定的比較結(jié)果表明，亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測定結(jié)果準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好。國外文獻(xiàn)資料中，黃酮含量的測定也主要集中于使用此法［8-10］。

然而在實(shí)際測定中，使用該法測定樣品需要量大，反應(yīng)試劑消耗多，操作步驟繁瑣，因此對(duì)微量和大量樣品的測定難以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行。在建立高通量微孔板法測試桑黃多糖含量方法的基礎(chǔ)上［11］，本次實(shí)驗(yàn)以桑黃液體發(fā)酵液中的黃酮含量為測試對(duì)象，使用96 微孔板，以正交設(shè)計(jì)法對(duì)在高通量條件下對(duì)測定黃酮含量的主要影響因素亞硝酸鈉添加量、硝酸鋁添加量、氫氧化鈉添加量及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)所建立體系的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性進(jìn)行了考察和驗(yàn)證，同時(shí)通過和標(biāo)準(zhǔn)黃酮含量檢測方法比較，為此類大樣本中總黃酮含量的檢測提供了一個(gè)更簡便和經(jīng)濟(jì)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

桑黃菌(Phellinussp.P0988)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)為CCTCC NO:M 2012080。

1.1.2 主要試劑與儀器

Epoch 超微量微孔板分光光度計(jì)(美國BioTek);SB5200DT 型數(shù)控超聲波清洗器(寧波新芝生物科技有限公司);FA2004N 分析天平(上海精科儀器有限公司);DGG-9053A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);MH-2 微量振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

蘆丁(三水蕓香葉苷)標(biāo)準(zhǔn)品購自國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)F20 090115;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檢測波長確定

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［12-15］，選定蘆丁作為測定的標(biāo)準(zhǔn)品，量取桑黃發(fā)酵液的黃酮提取物及蘆丁溶液，按照傳統(tǒng)亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色方法［4］反應(yīng)之后，于200～600 nm 進(jìn)行全波長掃描，確定測定該類樣品檢測的最佳檢測吸收波長。

1.2.2 顯色條件優(yōu)化

以桑黃發(fā)酵液提取物為測試對(duì)象，選擇亞硝酸鈉添加量(A)、硝酸鋁添加量(B)、氫氧化鈉添加量(C)以及反應(yīng)時(shí)間(D)為主要考察因素，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。每個(gè)因素選擇3 個(gè)水平，因素水平如表1 所示(n=3)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及線性范圍的確定

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.2.2 中優(yōu)化后的顯色條件反應(yīng)之后，使用超微量微孔板分光光度計(jì)于最佳檢測吸收波長處測定其吸收值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸收值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程，確定其線性范圍。

1.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取一定濃度的桑黃發(fā)酵液提取物，按照1.2.2 中確定的測定條件檢測。每隔1 h 測定同一樣品的吸收值，比較多次的測定結(jié)果。

1.2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取一定濃度的桑黃發(fā)酵液提取物，按照1.2.2 中確定的測定條件連續(xù)獨(dú)立測定6 次，對(duì)實(shí)驗(yàn)精密度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviations，RSD)進(jìn)行評(píng)估。

1.2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別向3 種不同濃度的桑黃發(fā)酵液提取物中定量加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.2.2 中確定的測定條件測定總黃酮含量并計(jì)算加樣回收率。

1.2.7 和傳統(tǒng)測定方法檢測的比較分析

為了驗(yàn)證所建立的高通量微孔板測定法的準(zhǔn)確性，以5 個(gè)黃酮桑黃發(fā)酵液的黃酮樣品為測試對(duì)象，分別使用本實(shí)驗(yàn)所確定的微孔板高通量測定方法、保健食品中總黃酮的測定方法［16］和中國藥典(2010)中總黃酮含量的測定方法［4］進(jìn)行比較分析測定。每個(gè)樣品重復(fù)三次，計(jì)算其測定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.8 大樣本檢測驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所建立的微孔板高通量測定方法的可行性和準(zhǔn)確性，以24 個(gè)桑黃發(fā)酵液的黃酮樣品為測試對(duì)象，使用本實(shí)驗(yàn)建立的微孔板法檢測此大樣本中的總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳檢測波長確定

對(duì)桑黃發(fā)酵液提取物和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的波譜掃描比較結(jié)果表明二者在可見光區(qū)510 nm 左右處均有最大光吸收峰，與有關(guān)黃酮最大光吸收值的文獻(xiàn)報(bào)道一致［17-21］。本實(shí)驗(yàn)確定選擇蘆丁為檢測標(biāo)準(zhǔn)品，選擇510 nm 為檢測反應(yīng)的最佳檢測波長。

2.2 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)及方差分析

準(zhǔn)確吸取桑黃發(fā)酵液提取物于微孔板中，按表2 中的各因素的添加量進(jìn)行試驗(yàn)，使用超微量微孔板分光光度計(jì)在510 nm 處測定其吸光值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。極差分析(Rj)顯示(表2)，硝酸鋁添加量是影響顯色反應(yīng)后樣品吸收值最重要的影響因素，亞硝酸鈉加入量和反應(yīng)時(shí)間的影響相對(duì)較小，且這些因素對(duì)顯色反應(yīng)的吸收值影響作用顯著(表3，α=0.05)。結(jié)果還顯示，影響因素包括亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉的最佳用量分別為30 μL、30 μL 和50 μL，反應(yīng)時(shí)間為10 min。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The orthogonal experimental design and results

表3 方差分析表Table 3 ANOVA table

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及線性范圍確定

如表4 所示，在不同測定范圍內(nèi)，使用該方法測定的r2均接近于1，標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿足要求。其中，當(dāng)線性范圍為0～50 μg/mL 時(shí)，r2值最大達(dá)到0.9994，因此，實(shí)驗(yàn)選定0～50 μg/mL 為測定的線性范圍。

表4 線性范圍考察表Table 4 Table of linear range examination

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在4 h 內(nèi)供試液吸收值由0.1016 變 為0.1005，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.607%。表明使用此法檢測黃酮含量穩(wěn)定性良好，在4 h 內(nèi)顯色較穩(wěn)定。

2.5 精密度與加樣回收率實(shí)驗(yàn)

以桑黃發(fā)酵液提取物為樣品平行測定6 次，吸收值測定結(jié)果分別為0.0528、0.0489、0.0505、0.0511、0.0497 和0.0503，RSD為2.63%。表明該方法精確度高。加樣回收率在98%～104%之間，平均為100.7%，變異系數(shù)在0.67%～1.50%之間。結(jié)果顯示，該方法準(zhǔn)確、可靠。

2.6 檢測方法比較分析

比較結(jié)果顯示(表5):和傳統(tǒng)方法相比，本實(shí)驗(yàn)建立的高通量檢測方法靈敏度更高，測定誤差小，測定結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。

表5 測定方法比較分析Table 5 Results comparison between different methods

2.7 大樣本檢測驗(yàn)證

使用該法一次性測定24 個(gè)桑黃發(fā)酵液中總黃酮含量(表6)。結(jié)果顯示，對(duì)于一次性測定大樣本樣品，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分析均符合相關(guān)要求，證實(shí)該法可用于大樣本檢測。

表6 高通量測定結(jié)果Table 6 High-throughput determination results

3 討論與結(jié)論

魏永生等［22］曾經(jīng)對(duì)絡(luò)合分光光度法測定黃酮含量的實(shí)驗(yàn)條件做過優(yōu)化;于村等［23］也對(duì)保健食品中檢測總黃酮方法做過優(yōu)化，但這些研究主要集中于對(duì)不同樣品的前處理方法的優(yōu)化。雖然在具體操作過程中稍有不同，但改進(jìn)后的測定方法都依然存在樣品消耗大，耗時(shí)，化學(xué)藥品損失大，且不適用于微量或痕量黃酮樣品以及大樣本的檢測等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)充分考慮了影響NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法的相關(guān)因素，并最終選擇了四個(gè)關(guān)鍵因素作為考察對(duì)象，通過L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了顯色條件，建立了基于使用96 微孔板，利用超微量微孔板分光光度計(jì)的總黃酮含量的高通量測定方法。該方法對(duì)大樣本黃酮含量測定的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、線性關(guān)系、樣品回收率均能達(dá)到科研和生產(chǎn)分析的要求。

實(shí)驗(yàn)以桑黃發(fā)酵液的黃酮提取物為研究對(duì)象，通過L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化，建立了檢測大樣本的黃酮樣品中總黃酮含量的高通量測定方法。優(yōu)化后總黃酮含量測定的最佳顯色條件為5%亞硝酸鈉30 μL，10%硝酸鋁30 μL，10%氫氧化鈉50 μL，室溫反應(yīng)10 min，最佳檢測波長為510 nm。

1 Ma TT (馬陶陶)，Zhang QL (張群林)，Li J (李俊)，et al.AlCl3colorimetry for determination of total flavonoids.Lishizhen Med Mater Med Res(時(shí)珍國醫(yī)國藥)，2008，19:54-56.

2 Ma R (馬銳)，Wu SB (吳勝本).Research progress about pharmacological effect and mechanism of flavonoids in traditional Chinese medicine.Chin J Pharmacovigil(中國藥物警戒)，2013，10:286-290.

3 Zhang Y (張巖)，Cao GJ (曹國杰)，Zhang Y (張燕)，et al.Research on the extraction and identification of flavonoids.Food Res Dev(食品研究與開發(fā))，2008，29:154-158.

4 Chinese Pharmacopoeia Commission (國家藥典委員會(huì)).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.

5 Ha B (哈本).Flavonoids (黃酮類化合物).Beijing:Science Press，1983.53-70.

6 Han WJ (韓衛(wèi)娟)，Liang YQ (梁玉琴)，Zhang JJ (張嘉嘉)，et al.Review on the quantitative analysis methods of polyphenols and flavonoids in the leaf of persimmon.Chin Agric Sci Bull(中國農(nóng)學(xué)通報(bào))，2014，30(31):52-56.

7 Wang Y (王勇)，Zhao HY (趙海燕)，F(xiàn)eng L (封琳)，etal.Comparison and evaluation of methods for licorice flavonoids content determination.J Anhui Agric Sci(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2009，37:13593-13595.

8 Moniruzzaman M，Yung AC，Rao PV，et al.Identification of phenolic acids and flavonoids in monofloral honey from bangladesh by high performance liquid chromatography:determination of antioxidant capacity.Bio Med Res Int，2014，2014.

9 Suhartono E，Viani E，Rahmadhan MA，et al.Total flavonoid and antioxidant activity of some selected medicinal plants in South Kalimantan of Indonesian.APCBEE Procedia，2012，4:235-239.

10 Silva SD，F(xiàn)eliciano RP，Boas LV，et al.Application of FTIRATR to Moscatel dessert wines for prediction of total phenolic and flavonoid contents and antioxidant capacity.Food Chem，2014，150:489-493.

11 Ma XK，Ruan QQ，Zhang H，et al.Developing a highthroughput microassay for large samples of fungal polysaccharides.Anal Methods，2013，17:4310-4316.

12 Chinese Veterinary Pharmacopoeia Commission (中國獸藥典委員會(huì)).Veterinary Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中華人民共和國獸藥典).Beijing:China Agriculture Press，2011.

13 Wu LL (吳亮亮)，Shi XP (石雪萍)，Zhang WM (張衛(wèi)明).Study on the determination method of total flavonoids content inZanthoxylumby spectrophotometry.Sci Technol Food Ind(食品工業(yè)科技)，2010，31:372-374.

14 Li N (李娜)，Jiang HF (姜洪芳)，Jin JH (金敬宏)，et al.Total flavones content analysis ofChaenomeles speciosaby different harvest times.Food Res Dev(食品研究與開發(fā))，2011，32(2):112-114.

15 Li HL (李海龍)，Liu MS (劉明生)，Zhang JQ (張俊清)，et al.Determination of total flavonoids inDaphniphylium calycinum.Hainan Med J(海南醫(yī)學(xué))，2012，23:106-108.

16 Ministry of Health of the People's Republic of China (中華人民共和國衛(wèi)生部).Technical standards for testing ＆ assessment of health food(2003)(保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范2003年 版).Beijing:Chinese Ministry of Health，2003.

17 Zhang XH (張夏輝).Studies on extraction of flavonoids inSpatholobus suberectusdunn and antioxidation activity of the different extract from it.Liuzhou:Guangxi University of Science and Technology (廣西科技大學(xué))，MSc.2013.

18 Liu HM (劉洪梅)，Chen YT (陳玉婷)，He LM (何立美)，et al.Determination of total flavonoids inFengliaodecoction by UV-visible spectrophotometry.Chin Animal Husbandry Veterin Med(中國畜牧獸醫(yī))，2014，41:140-144.

19 Wu C (吳燦)，Xia YB (夏延斌)，Tang X (唐鑫).Spectrophotometric determination of flavonoid from lotus wine.Acade Period Farm Prod Proc(農(nóng)產(chǎn)品加工)，2013，4:48-50.

20 Guo YD (郭育東)，Shan B (單斌)，Liang RY (梁瑞儀).Study on the determination method of total flavonoids content inBitter Gourd.Jiangsu Agric Sci(江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué))，2009，3:317-319.

21 Liu YF (劉艷芳)，Yang Y (楊焱)，Jia W (賈薇)，et al.Study on the determination method of total flavonoids content in medical fungiPhellinus.Acta Edulis Fungi(食 用 菌 學(xué)報(bào))，2006，13(2):45-48.

22 Wei YS (魏永生)，Wang YN (王永寧)，Shi YP (石玉平)，et al.A study on experimental conditions in determining total flavonoids by spectrophotometry.J Qinghai Univ，Nat Sci(青海大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)，2003，21(3):61-63.

23 Yu C (于村)，Yu S (俞莎).Study on determination method of general flavone in Health Foods.Chin J Health Labor Technol(中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志)，2002，12:401-402.