焦成張敏娟嚴(yán)降雨李靜殷敏程雷

·實驗研究·

慢性間歇性低氧狀態(tài)mTOR信號通路變化對大鼠胰島β細(xì)胞數(shù)量的影響*

焦成1張敏娟1嚴(yán)降雨1李靜1殷敏1程雷1

目的通過慢性間歇性低氧 (chronic intermittent hypoxia,CIH)大鼠模型，來探討哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）信號通路變化對大鼠胰島β細(xì)胞數(shù)量的影響。方法18只成年雄性SD大鼠隨機均分為常氧組（A組）、CIH組（B組）、藥物CIH組（C組），BC組予CIH處理，C組給予腹腔注射雷帕霉素0.2mg/kg/day。5周后檢測胰島mTOR及通路相關(guān)蛋白指標(biāo)eIF4E、p-S6的表達(dá)、每個胰島胰島素陽性區(qū)域的面積及胰島β細(xì)胞數(shù)量，以及血清胰島素含量。結(jié)果與A組相比，B組除eIF4E外各指標(biāo)均升高，C組p-S6、每個胰島內(nèi)β細(xì)胞的個數(shù)及胰島素陽性區(qū)域的面積減少。相對于B組，C組各指標(biāo)均降低。結(jié)論CIH狀態(tài)下，mTOR信號通路激活誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞數(shù)量增多，雷帕霉素能抑制CIH引起的mTOR信號通路激活效應(yīng)，降低mTOR通路相關(guān)蛋白指標(biāo)表達(dá)水平和胰島β細(xì)胞數(shù)量。

阻塞性睡眠呼吸暫停；胰島素分泌細(xì)胞；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome,OSAS）可以引發(fā)神經(jīng)調(diào)節(jié)異常、內(nèi)分泌功能紊亂等一系列并發(fā)癥，尤其是越來越多的研究關(guān)注OSAS導(dǎo)致的糖尿病。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，與普通成年人群相比，成年OSAS患者伴發(fā)糖尿病的比率更高[1]。也有研究提示，OSAS伴發(fā)代謝綜合征[2]，和胰島素抵抗之間存在著相互影響、相互促進(jìn)的惡性關(guān)系[3]。但OSAS繼發(fā)糖尿病的具體病理生理機制目前尚不清楚。

研究表明，慢性間歇性低氧（chronic intermittent hypoxia,CIH）能通過影響胰島素的分泌及其敏感性引起代謝功能異常[4，5]，還能激發(fā)機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起炎癥反應(yīng)、線粒體損傷和β細(xì)胞凋亡[6-8]。此外，CIH能夠誘發(fā)小鼠胰島β細(xì)胞的凋亡和增殖[9，10]，提示CIH環(huán)境下小鼠胰島內(nèi)同時存在著損傷和保護性機制。然而有關(guān)CIH影響胰島β細(xì)胞的具體機制尚未研究清楚[5,11,12]。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶，以mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合體形式存在。mTOR參與多種信號通路的調(diào)節(jié)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、調(diào)控細(xì)胞周期方面起到重要作用[13]，HIF-1就是mTOR通路下游的一個重要指標(biāo)。雷帕霉素是特異性的mTOR抑制劑，通過抑制mTORC1的活性來控制下游的真核翻譯起始因子結(jié)合蛋白1（eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1,eIF4EBP1）和核糖體蛋白S6激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase 1,P70S6K1），從而影響mRNA的翻譯和體細(xì)胞的分裂。目前，雷帕霉素在免疫抑制和抗腫瘤方面已經(jīng)得到運用。近年來有研究顯示mTOR信號通路參與調(diào)控了胰島β細(xì)胞的功能、生長和增殖，對缺氧下胰島β細(xì)胞的生長和增殖也有重要影響[14-16]。Mori等在TSC1（mTOR上游的抑制劑）缺乏的小鼠中發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路激活，而胰島面積和β細(xì)胞大小也同時增加[17]。而Briaud等發(fā)現(xiàn)，mTOR的抑制劑雷帕霉素能夠減少實驗動物的胰島素分泌和糖耐量[18]。

本研究擬進(jìn)一步探討CIH條件下大鼠胰島β細(xì)胞數(shù)量和mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，以及CHI下雷帕霉素對大鼠胰島β細(xì)胞數(shù)量和mTOR通路的影響。

材料與方法

1 材料

胰島素抗體、eIF4E抗體、山羊抗豚鼠IgG抗體（Abcam公司，英國），mTOR抗體、P-S6抗體（CST公司，美國），濃縮型SABC-Cy3(兔IgG)試劑盒（武漢博士德），大鼠胰島素ELISA試劑盒（ALPCO公司，美國）。XF-YCO6-T型低氧艙(南京新飛儀器制造有限公司)，酶標(biāo)儀（Bio-Rad，美國），熒光倒置顯微鏡（CarlZeiss公司，德國）

2 方法

2.1 動物模型

由江蘇省實驗動物中心購買18只8周齡清潔級雄性SD大鼠，體重200~230g。按隨機數(shù)字法將大鼠平均分成3組，分別是常氧組（A組）、CIH組(B組)、藥物CIH組（C組）。A組在常壓、空氣環(huán)境培養(yǎng)艙中飼養(yǎng)；B組和C組在低氧艙中飼養(yǎng)，低氧條件（60s/N2，60s/空氣，交替充入，保證艙內(nèi)氧氣濃度在5%-21%之間波動，每天8:30~16:30，共35天），各組均能自由進(jìn)水、食。C組分別給予雷帕霉素0.2mg/ kg/day，雷帕霉素事先按50mg/ml溶于二甲基亞砜（DMSO）中，再以1:200的比例稀釋到磷酸鹽緩沖液（PBS）中進(jìn)行腹腔注射。A組給予同等體積和稀釋比例的DMSO和PBS混合液。實驗過程中保證飼養(yǎng)房恒溫恒濕。本實驗方案已經(jīng)過南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

2.2 實驗取材和標(biāo)本保存

造模結(jié)束后取材前夜大鼠禁食12h，用2%戊巴比妥鈉按4mg/100g的劑量進(jìn)行腹腔麻醉。固定，負(fù)壓管腹主動脈采血，室溫放置2h以后用4℃離心機3000r/min離心15min，取血清放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。用生理鹽水進(jìn)行持續(xù)心臟灌流，當(dāng)流出液澄清時快速打開腹腔取2塊同等大小的胰腺尾部組織，放入4%多聚甲醛固定液中浸泡48h后進(jìn)行石蠟包埋。

2.3 血清胰島素水平檢測

血清胰島素水平采用酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）檢測。取實驗前保存的大鼠血清，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，最后在酶標(biāo)儀上450波長處檢測，計算出血清胰島素水平。

2.4 各組大鼠胰島mTOR、eIF4E、p-S6的表達(dá)情況以及胰島β細(xì)胞數(shù)量的檢測

取已經(jīng)包埋好的胰尾組織石蠟塊進(jìn)行切片，厚度為4μm，放入65℃烘箱2h后進(jìn)行HE染色，直至看到形態(tài)完整的胰島開始留片做免疫熒光實驗。將切片放入65℃烘箱孵育過夜，然后經(jīng)二甲苯、梯度酒精一步步脫蠟至水化，放在檸檬酸鹽緩沖液中浸泡著進(jìn)行微波抗原修復(fù)，待其自然冷卻至室溫后采用與二抗同源的山羊血清進(jìn)行封閉30min，PBS漂洗，加入胰島素抗體和mTOR/eIF4E/p-S6抗體適當(dāng)比例混合的一抗在4℃冰箱里孵育過夜。次日復(fù)溫20min后，PBS漂洗3次，加入山羊抗豚鼠二抗室溫孵育1h，PBS漂洗3次，加入生物素化抗兔二抗室溫孵育30min，PBS漂洗3次，加入SABC-Cy3室溫孵育30min，漂洗5次（所有操作均在濕盒中進(jìn)行，實驗中保持樣本濕潤，避免光照。加入DAPI孵育10min，漂洗2次，采用水溶性抗熒光淬滅封片劑封片。在熒光倒置顯微鏡下觀察，胰島素染色陽性的為胰島β細(xì)胞，其細(xì)胞漿為綠色，mTOR/eIF4E/p-S6染色陽性的細(xì)胞胞漿為紅色。

3 圖像處理

使用Image-Pro Plus軟件分別計算胰島素陽性區(qū)域的面積及每個胰島內(nèi)胰島β細(xì)胞的個數(shù)。為了結(jié)果的準(zhǔn)確性，實驗中每只大鼠相隔50μm做2張切片，分別計算相應(yīng)數(shù)值，圖像原始放大倍數(shù)為200倍。同樣通過Image-Pro Plus軟件計算胰島β細(xì)胞mTOR/eIF4E/p-S6的平均積分光密度（the mean integrated optical density,mIOD）來比較這幾個指標(biāo)的表達(dá)水平。

4 統(tǒng)計學(xué)分析

本實驗中各組數(shù)據(jù)雖然正太分布，但方差不齊，不滿足方差分析的條件，故通過SPSS18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行秩變換，采用非參數(shù)檢驗中K個獨立樣本的Kruskal-Wallis檢驗，并根據(jù)結(jié)果進(jìn)行兩個樣本間的Mann-WhitneyU檢驗。

結(jié)果

各組所測指標(biāo)結(jié)果見表1。在每個指標(biāo)上各組間均不滿足方差齊性，且Kruskal-Wallis檢驗提示在每個指標(biāo)上各組間均不全相等（P＜0.05），因此行Mann-Whitney U檢驗進(jìn)行兩兩比較（表2）。

與A組相比，B組mTOR、p-S6的表達(dá)、每個胰島內(nèi)胰島素陽性區(qū)域的面積以及胰島β細(xì)胞的個數(shù)增多（圖1，2；P＜0.01），血清胰島素含量也增多（P＜0.05）。而C組p-S6的表達(dá)和每個胰島內(nèi)β細(xì)胞的個數(shù)減少（P＜0.01），每個胰島內(nèi)胰島素陽性區(qū)域的面積也減少（P＜0.05）。

與B組相比，C組血清胰島素含量減少（P＜0.05），其余各指標(biāo)均減少（P＜0.01）。

B和C組 eIF4E與A組比較，P值臨界（= 0.055），進(jìn)一步通過SNK法進(jìn)行組間比較發(fā)現(xiàn)各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組大鼠所測指標(biāo)結(jié)果

表2 利用Mann-Whitney U檢驗進(jìn)行組間比較

圖1 各組大鼠血清胰島素含量比較

圖2 各組大鼠胰島β細(xì)胞數(shù)量比較

討論

通過Mann-Whitney U檢驗進(jìn)行A、B兩組比較時，發(fā)現(xiàn)除eIF4E（P=0.055）外，其余各指標(biāo)均增高?？紤]到秩變換有可能對檢驗效果有影響，故又通過Snk法對eIF4E的表達(dá)進(jìn)行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)三組數(shù)值分列三列，兩兩組間差異都有統(tǒng)計學(xué)意義，兩種統(tǒng)計學(xué)方法結(jié)果的差異有可能與秩變換后檢驗效能降低有關(guān)。在A組和C組的比較中，CIH和雷帕霉素共同作用下只有p-S6的表達(dá)、每個胰島內(nèi)胰島素陽性區(qū)域的面積以及胰島β細(xì)胞的個數(shù)三個指標(biāo)有統(tǒng)計學(xué)差異，我們認(rèn)為這可能與雷帕霉素的負(fù)反饋作用[19]和胰島素的脈沖式分泌[20]有關(guān)。

CIH下，mTOR信號通路激活誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞數(shù)量增多。國內(nèi)外研究顯示OSA是糖尿病的獨立危險因素[21]，而糖尿病的進(jìn)展過程根據(jù)胰島β細(xì)胞的功能和一些代謝指標(biāo)可以分為5個階段[22]。在最初的代償階段發(fā)生胰島素抵抗，為了保持正常的血糖水平，胰島素分泌增加，而胰島素分泌增加的很大一部分原因是因為胰島β細(xì)胞數(shù)量增加。在接下來的適應(yīng)期和失代償期，由于胰島β細(xì)胞數(shù)量減少、功能受損、糖耐量減低，血糖超過了臨界值。本次試驗中，CIH暴露后大鼠胰島β細(xì)胞數(shù)量增多，血清胰島素含量水平上升，與糖尿病代償期相似。這說明經(jīng)歷5周間歇性缺氧，此時大鼠胰島β細(xì)胞數(shù)量增多，大鼠胰島的功能仍處于代償期。此外，有文獻(xiàn)報道短期（4天）或中長期（4周）間歇性缺氧都能夠同時刺激胰島β細(xì)胞增殖和凋亡[9,10,16]，可以據(jù)此推測本次實驗中CIH下胰島β細(xì)胞增殖和凋亡也共同增加，而B組胰島β細(xì)胞數(shù)量增加應(yīng)該是增殖凋亡失衡的結(jié)果，由此可見CIH下機體同時存在著損傷和保護性機制。然而更長時間的間歇性低氧下，胰島β細(xì)胞的增殖凋亡情況以及數(shù)量的變化還需要進(jìn)一步研究。

mTOR通路下游兩個最重要的效應(yīng)器是eIF4EBP1和P70S6K1。mTOR通過磷酸化4EBP1釋放eIF4E并活化，同時mTOR能磷酸化P70S6K1使細(xì)胞內(nèi)40S核糖體蛋白S6磷酸化，eIF4E和p-S6共同調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯、蛋白質(zhì)的合成以及細(xì)胞增殖[23]。目前有很多證據(jù)表明低氧能夠使mTOR通路活化，低氧下低氧誘導(dǎo)因子1表達(dá)增多也很可能與mTOR通路的活化有關(guān)[15]。最近研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路是mTOR上游的一條重要通路，低氧下胰島素/胰島素樣生長因子信號通路表達(dá)增加，激活PI3K/AKT通路，抑制結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物（tuberous sclerosis complex,TSC）表達(dá)，TSC負(fù)向調(diào)控的Rheb活性增加并與GTP結(jié)合，增強mTORC1、mTORC2信號通路[24]。也有報道指出，那些缺少TSC1的小鼠胰島β細(xì)胞mTOR通路激活，胰島面積和β細(xì)胞大小都增大，胰島素的產(chǎn)量和分泌量也增加[17,25]。本次試驗中CIH下，mTOR、eIF4E、p-S6的表達(dá)增加符合試驗預(yù)期，mTOR通路激活與胰島素陽性面積增大和胰島β細(xì)胞數(shù)量增多有密切關(guān)系。

雷帕霉素能抑制CIH引起的mTOR信號通路激活效應(yīng)，降低mTOR通路相關(guān)蛋白指標(biāo)表達(dá)水平和胰島β細(xì)胞數(shù)量。雷帕霉素是最早發(fā)現(xiàn)的mTOR抑制劑，能與他克莫司結(jié)合蛋白-12（FK506-binding protein 12,FKBP12）形成復(fù)合物抑制mTORC1的活性從而抑制整個通路[19]。由于過度激活的PI3K/ AKT/mTOR通路與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，雷帕霉素常用于腫瘤治療和免疫抑制等方面[26]。本實驗中使用雷帕霉素是為了進(jìn)一步驗證CIH下胰島β細(xì)胞mTOR信號通路的激活效應(yīng)以及其在胰島β細(xì)胞數(shù)量變化中所起的作用。在雷帕霉素作用下，C組大鼠mTOR、eIF4E、p-S6的表達(dá)均明顯降低，mTOR信號通路受到抑制，說明雷帕霉素作用已經(jīng)達(dá)到預(yù)期。胰島素陽性區(qū)域和每個胰島內(nèi)β細(xì)胞的個數(shù)減少，血清胰島素含量也有所降低，這些結(jié)果說明mTOR信號通路的抑制或者去激活效應(yīng)能夠影響胰島β細(xì)胞的增殖凋亡平衡，引起胰島β細(xì)胞數(shù)量減少。

總的來說，本研究中mTOR信號通路的活性與胰島β細(xì)胞的數(shù)量的平行變化關(guān)系表明，CIH下mTOR信號通路激活很大程度上了誘導(dǎo)了胰島β細(xì)胞增殖凋亡失衡，使其數(shù)量增加，胰島素分泌增多。雷帕霉素能夠抑制mTOR信號通路激活，降低與mTOR信號通路密切相關(guān)的胰島β細(xì)胞數(shù)量。但各類研究顯示CIH下仍有HIF-1、VEGF等多種信號通路與胰島β細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)，對β細(xì)胞的功能、數(shù)量產(chǎn)生影響[16]，由此可見對CIH下各類信號通路變化的分子機制以及臨床意義仍然需要進(jìn)一步探索。

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（收稿:2014-04-25 修回：2014-08-15）

The influence of the mammalian target of rapamycin pathway changes on islet β cell number in the rats under chronic intermittent hypoxia

JIAO Cheng,ZHANG Minjuan,YAN Jiangyu,LI Jing,YIN Min,CHENG Lei
Department of Otorhinolaryngology,The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing,Jiangsu, 210029,China

ObjectiveTo investigate the influence of the mammalian target of rapamycin pathway changes on islet β cell number in the rats under chronic intermittent hypoxia.MethodsEighteen adult male Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into 3 groups,including the normoxic group(group A),the CIH group(group B)and the CIH group with the rapamycin(group C).The group B and C were fed in low oxygen cabins.The group C received Intraperitoneal injection with rapamycin 0.2 mg/kg/day.After 5 weeks, we detect the expression of mTOR/p-S6/eIF4E,insulin positive area and β cell number per islet,and the serum insulin levels.ResultsIn comparison with group A,all indexes in group B increased except the expression of eIF4E,while the expression of p-S6, insulin positive area and the β cell number per islet decreased in group C.In comparison with group B,all indexes decreased in group C.ConclusionChronic intermittent hypoxia activated the mTOR pathway which induced the increase in the number of pancreatic islet β cells.Rapamycin can inhibit the activation of mTOR pathway and decrease the expression of the mTOR pathway related proteins and the β cell number in rats under CIH.

Obstructive sleep apnea;Insulin-secreting cells;Mammalian target of rapamycin

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2015.02.002

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程（JX10231801）；江蘇省人民醫(yī)院創(chuàng)新團隊（IRT-016）

1 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 江蘇省人民醫(yī)院耳鼻咽喉科（江蘇南京，210029）

殷敏，副教授. Email：simisodo@hotmail.com