和鳳軍+唐柱生+吳冠儒+陳學(xué)秋+李啟勇+宋波+郝敬紅+黃利民

【摘 要】 目的：探討大椎穴神經(jīng)傳導(dǎo)通路及其與周圍非穴位區(qū)神經(jīng)通路有無差異，為針刺大椎穴治療疾病機(jī)理與神經(jīng)調(diào)節(jié)的相關(guān)性提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。方法：將12只SD大鼠分成實驗組和對照組，每組6只。大椎穴組（實驗組）和第6～7頸椎棘突間組（對照組）分別于大椎穴和第6、7頸椎棘突之間注射15%BDA，10μl/只，所有實驗大鼠注射后存活7天，行灌注固定取腦和脊髓，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖-0.1M PBS液沉底，取脊髓C1-C4和腦干行片厚10μm冰凍切片，免疫組化反應(yīng)，DAB顯色，觀察各組腦干和脊髓內(nèi)陽性細(xì)胞的分布特點和差異。結(jié)果：BDA陽性細(xì)胞呈棕黃色，胞核淡染，胞質(zhì)和突起染色深。在脊髓C1-C4節(jié)段灰質(zhì)前角、后角、灰質(zhì)聯(lián)合、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)均可見到數(shù)量不等、大小不一的陽性細(xì)胞，其中實驗組各部的陽性細(xì)胞均多于對照組，組間比較差異明顯有統(tǒng)計學(xué)意義;中腦內(nèi)紅核和中央尾葉核均可見陽性細(xì)胞，其中實驗組陽性細(xì)胞明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：BDA可以跨神經(jīng)元逆行轉(zhuǎn)運(yùn)，是穴位神經(jīng)通路示蹤的可靠神經(jīng)示蹤劑;大椎穴及其周圍非穴位區(qū)神經(jīng)通路在脊髓上頸節(jié)段和中腦傳導(dǎo)路徑相似，但是各部的陽性細(xì)胞數(shù)量有差異，實驗組陽性細(xì)胞明顯多于對照組，其機(jī)理和詳細(xì)神經(jīng)通路有待進(jìn)一步深入研究。

【關(guān)鍵詞】 SD大鼠;大椎穴;神經(jīng)通路示蹤;BDA

【中圖分類號】R33-33 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2014）13-0038-02

大椎穴是中醫(yī)臨床常用的穴位，可用于治療感冒、哮喘、發(fā)熱、失眠、椎-基底動脈供血不足、頸椎病、痤瘡、帶狀皰疹、白細(xì)胞減少癥、急性扁桃體炎、咽炎、糖尿病性周圍神經(jīng)病變、高血壓等[1]，是治療疾病、保健養(yǎng)生的要穴。但是，針刺或艾灸大椎穴治療以上疾病的具體機(jī)理還不完全清楚。目前普遍認(rèn)為神經(jīng)系統(tǒng)-免疫系統(tǒng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)之間存在相互調(diào)節(jié)，相互影響，共同構(gòu)成人體調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。本研究通過用生物素葡聚糖胺（Biotinylated-dextran amine，BDA）對SD大鼠大椎穴神經(jīng)通路進(jìn)行示蹤，以期探討該穴位區(qū)與中樞神經(jīng)之間的神經(jīng)通路聯(lián)系，這將有助于從神經(jīng)調(diào)節(jié)角度探討針刺或艾灸大椎穴治療疾病的機(jī)理，為闡明針刺大椎穴治療疾病的相關(guān)機(jī)理提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 SD大鼠12只 雌雄各6只，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，許可證號（合格證號）SCKK（川）2004-16，SCXK（川）2005-00010Q。分為大椎穴組（實驗組）和第6～7頸椎棘突間組（對照組）兩組，每組各6只。

1.2 注射方法 按林文注[2]大鼠大椎穴“在第7頸椎與第1胸椎間，背部正中”定位，25%烏拉坦按0.3ml/100g體重腹腔注射麻醉，以隆椎為體表標(biāo)志，剪去項背部正中皮毛，定位清楚后實驗組在大椎穴注射15%BDA，10μl/只，與棘突間平行進(jìn)針，深度約5mm，注射完后留針10min;對照組于項部正中，第6～7頸椎棘突間注射15%BDA，10μl/只，與棘突間平行進(jìn)針，深度約5mm，注射完后留針10min。兩組實驗大鼠注射神經(jīng)示蹤劑后籠養(yǎng)存活7天。

1.3 試劑及儀器 神經(jīng)示蹤劑Neuro Trace TM BDA-10，000 Neuronal Tracer Kit，U.S.A. 含：①10，000Mw BDA（A劑），凍干BDA 3mg/瓶×6瓶，②avidin-HRP（B劑），凍干avidin-HRP 100μg/瓶×6瓶，③DAB（C劑），250mg/瓶×1瓶。于-200C～-800C冰箱干燥避光保存，購自北京中杉金橋;DAB顯色試劑盒（20×）3ml，ABC各3ml，A濃縮緩沖液，B濃縮DAB溶液，C濃縮過氧化氫溶液;烏拉坦（氨基甲酸乙酯，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)）;PBS磷酸鹽緩沖液ZLI-9062 2000ml/袋（0.01M PH 7.2～7.4），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);France Millipore 超純水系統(tǒng);Leica CM 1900冰凍切片機(jī);Motic BA310-Moticam Pro282A病理圖像分析系統(tǒng)。

1.4 灌注取材 大鼠稱重，按25%烏拉坦0.3ml/100g體重腹腔注射麻醉，仰臥位將大鼠四肢和頭部固定在自制大鼠固定板上，從上腹部剪開皮膚至頸部，向兩側(cè)分離皮膚暴露胸部肌肉，從劍突兩側(cè)依次向嘴側(cè)剪開膈、肋和肋間肌，向嘴側(cè)翻起胸骨及其連帶組織，充分暴露胸腺、心包和肺。將輸液針從心尖刺入插至升主動脈，先灌注生理鹽水約130ml，剪開右心房排血至流出清亮液體，再灌注4%多聚甲醛約250ml至大鼠四肢和尾巴堅硬為止。將固定好的大鼠取俯臥位固定，從后正中線由尾側(cè)向嘴側(cè)剪開皮膚并向兩側(cè)分離，從棘突兩側(cè)切開分離肌肉充分暴露脊柱棘突、肋、枕骨、顱頂骨，從第四腰椎棘突平面始，用小止血鉗咬開棘突、椎板暴露椎管和馬尾，用細(xì)頭止血鉗輕輕插入椎管由橫突水平從尾側(cè)到頭側(cè)方向夾除椎弓板及橫突顯露脊髓，在頭部正中用手術(shù)刀背沿正中線劃數(shù)下，用剪子輕鉆一個小洞，從小洞用止血鉗向兩側(cè)撐開顱骨暴露腦，用止血鉗夾除延髓和脊髓交界處枕骨充分暴露腦和脊髓，從尾側(cè)提起脊髓，剪除兩側(cè)前后根絲等脊髓與椎管間的連結(jié)組織、剪除與腦相連的腦神經(jīng)根，將腦和脊髓一起取出置入4%多聚甲醛中存儲。

1.5 切片及染色 取腦干和上頸段C1-C4脊髓30%蔗糖沉底，行片厚10μm冰凍切片。0.01MPBS液漂洗切片3次，10min/次→切片入1.0μg/ml Avidin-HRP液中，40C冰箱濕盒過夜→PBS液漂洗切片3次，10min/次→0.003%DAB顯色時間3～5 min，有反應(yīng)后用蒸餾水終止DAB顯色→梯度上行酒精脫水（70%Alc→80%Alc→90%Alc→95%Alc→100%AlcⅠ→100%AlcⅡ，5～10min/次）→二甲苯透明（二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ，5～10min/次）→中性樹膠封片。endprint

1.6 觀察分析 在顯微鏡下，觀察腦干和脊髓上頸段切片中陽性細(xì)胞和陽性纖維的分布情況。Motic 病理圖像分析系統(tǒng)下拍片。兩組大鼠腦干和脊髓上頸段切片分別各取40片，在×200倍顯微鏡下計數(shù)陽性細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各部陽性細(xì)胞計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗，P﹤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

BDA陽性細(xì)胞呈棕黃色，胞核淡染，胞質(zhì)和突起染色深。在兩組大鼠脊髓C1-C4節(jié)段灰質(zhì)前角、后角、灰質(zhì)連合、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)均可見到數(shù)量不等、大小不一的陽性細(xì)胞（見圖①-⑧），其中實驗組各部的陽性細(xì)胞均多于對照組，組間比較差異明顯有統(tǒng)計學(xué)意義（具體見表1）。

脊髓前角可見大、中、小陽性細(xì)胞，大細(xì)胞多見于前角尖，后角可見少量小陽性細(xì)胞，背外側(cè)索見密集纖維。中央管前后灰質(zhì)連合見大量中、小陽性細(xì)胞，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)見中多個小細(xì)胞，胞核淡染，細(xì)胞呈梭形或多角形，可見明顯的突起。

中腦內(nèi)紅核和中央尾葉核均可見陽性細(xì)胞（見圖a-d），其中實驗組陽性細(xì)胞明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

BDA是一種與生物素結(jié)合的多聚葡萄糖胺，可用于順行和逆行示蹤，由Glover等[3]于1986年首次成功地運(yùn)用在神經(jīng)束路追蹤中。陳亞亮[4]等應(yīng)用BDA法成功地顯示了大鼠脊髓小腦束、前庭束纖維在小腦中央核及前庭核中的投射。

本次實驗采用BDA進(jìn)行大椎穴及其周圍非穴位區(qū)神經(jīng)通路示蹤，兩組均于脊髓和腦干清楚顯示了BDA陽性細(xì)胞，提示BDA是穴位神經(jīng)通路示蹤的可靠示蹤劑，可以逆行跨神經(jīng)元示蹤;且實驗組的陽性細(xì)胞明顯多于對照組，可能與大椎穴處感受器、運(yùn)動神經(jīng)末梢比非穴位區(qū)密集有關(guān)，提示大椎穴治療疾病與神經(jīng)調(diào)節(jié)有一定的相關(guān)性。鑒于本次研究資料有限，大椎穴與延髓、腦橋、脊神經(jīng)節(jié)、頸交感神經(jīng)節(jié)、小腦、下丘腦等的神經(jīng)通路聯(lián)系還有待進(jìn)一步研究。大椎穴左、右旁開處、第7頸椎與第1胸椎棘突間與大椎穴神經(jīng)通路有無差異還需要進(jìn)一步探討。相信隨著研究的深入，項目組可以闡明大椎穴與中樞神經(jīng)聯(lián)系的神經(jīng)通路，為大椎穴治療疾病與神經(jīng)調(diào)節(jié)相關(guān)性提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]翟景慧，李曉泓，李輝，等.近年大椎穴臨床研究概況. 北京中醫(yī)，2004， 23（3）：186-188.

[2]林文注，王佩.實驗針灸學(xué).上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999，9：288.

[3]Glover J C， Petursdottir G， Jansen J K S. Fluorescent dextran-amines as neuronal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J Neurosci Method， 1986，18：243～254.

[4]陳亞亮，李 莉，高秀來. BDA法神經(jīng)束路追蹤技術(shù). 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002，23（3）：258-260.

（收稿日期：2014.05.08）endprint

1.6 觀察分析 在顯微鏡下，觀察腦干和脊髓上頸段切片中陽性細(xì)胞和陽性纖維的分布情況。Motic 病理圖像分析系統(tǒng)下拍片。兩組大鼠腦干和脊髓上頸段切片分別各取40片，在×200倍顯微鏡下計數(shù)陽性細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各部陽性細(xì)胞計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗，P﹤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

BDA陽性細(xì)胞呈棕黃色，胞核淡染，胞質(zhì)和突起染色深。在兩組大鼠脊髓C1-C4節(jié)段灰質(zhì)前角、后角、灰質(zhì)連合、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)均可見到數(shù)量不等、大小不一的陽性細(xì)胞（見圖①-⑧），其中實驗組各部的陽性細(xì)胞均多于對照組，組間比較差異明顯有統(tǒng)計學(xué)意義（具體見表1）。

脊髓前角可見大、中、小陽性細(xì)胞，大細(xì)胞多見于前角尖，后角可見少量小陽性細(xì)胞，背外側(cè)索見密集纖維。中央管前后灰質(zhì)連合見大量中、小陽性細(xì)胞，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)見中多個小細(xì)胞，胞核淡染，細(xì)胞呈梭形或多角形，可見明顯的突起。

中腦內(nèi)紅核和中央尾葉核均可見陽性細(xì)胞（見圖a-d），其中實驗組陽性細(xì)胞明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

BDA是一種與生物素結(jié)合的多聚葡萄糖胺，可用于順行和逆行示蹤，由Glover等[3]于1986年首次成功地運(yùn)用在神經(jīng)束路追蹤中。陳亞亮[4]等應(yīng)用BDA法成功地顯示了大鼠脊髓小腦束、前庭束纖維在小腦中央核及前庭核中的投射。

本次實驗采用BDA進(jìn)行大椎穴及其周圍非穴位區(qū)神經(jīng)通路示蹤，兩組均于脊髓和腦干清楚顯示了BDA陽性細(xì)胞，提示BDA是穴位神經(jīng)通路示蹤的可靠示蹤劑，可以逆行跨神經(jīng)元示蹤;且實驗組的陽性細(xì)胞明顯多于對照組，可能與大椎穴處感受器、運(yùn)動神經(jīng)末梢比非穴位區(qū)密集有關(guān)，提示大椎穴治療疾病與神經(jīng)調(diào)節(jié)有一定的相關(guān)性。鑒于本次研究資料有限，大椎穴與延髓、腦橋、脊神經(jīng)節(jié)、頸交感神經(jīng)節(jié)、小腦、下丘腦等的神經(jīng)通路聯(lián)系還有待進(jìn)一步研究。大椎穴左、右旁開處、第7頸椎與第1胸椎棘突間與大椎穴神經(jīng)通路有無差異還需要進(jìn)一步探討。相信隨著研究的深入，項目組可以闡明大椎穴與中樞神經(jīng)聯(lián)系的神經(jīng)通路，為大椎穴治療疾病與神經(jīng)調(diào)節(jié)相關(guān)性提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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[3]Glover J C， Petursdottir G， Jansen J K S. Fluorescent dextran-amines as neuronal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J Neurosci Method， 1986，18：243～254.

[4]陳亞亮，李 莉，高秀來. BDA法神經(jīng)束路追蹤技術(shù). 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002，23（3）：258-260.

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1.6 觀察分析 在顯微鏡下，觀察腦干和脊髓上頸段切片中陽性細(xì)胞和陽性纖維的分布情況。Motic 病理圖像分析系統(tǒng)下拍片。兩組大鼠腦干和脊髓上頸段切片分別各取40片，在×200倍顯微鏡下計數(shù)陽性細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各部陽性細(xì)胞計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗，P﹤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

BDA陽性細(xì)胞呈棕黃色，胞核淡染，胞質(zhì)和突起染色深。在兩組大鼠脊髓C1-C4節(jié)段灰質(zhì)前角、后角、灰質(zhì)連合、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)均可見到數(shù)量不等、大小不一的陽性細(xì)胞（見圖①-⑧），其中實驗組各部的陽性細(xì)胞均多于對照組，組間比較差異明顯有統(tǒng)計學(xué)意義（具體見表1）。

脊髓前角可見大、中、小陽性細(xì)胞，大細(xì)胞多見于前角尖，后角可見少量小陽性細(xì)胞，背外側(cè)索見密集纖維。中央管前后灰質(zhì)連合見大量中、小陽性細(xì)胞，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)見中多個小細(xì)胞，胞核淡染，細(xì)胞呈梭形或多角形，可見明顯的突起。

中腦內(nèi)紅核和中央尾葉核均可見陽性細(xì)胞（見圖a-d），其中實驗組陽性細(xì)胞明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

BDA是一種與生物素結(jié)合的多聚葡萄糖胺，可用于順行和逆行示蹤，由Glover等[3]于1986年首次成功地運(yùn)用在神經(jīng)束路追蹤中。陳亞亮[4]等應(yīng)用BDA法成功地顯示了大鼠脊髓小腦束、前庭束纖維在小腦中央核及前庭核中的投射。

本次實驗采用BDA進(jìn)行大椎穴及其周圍非穴位區(qū)神經(jīng)通路示蹤，兩組均于脊髓和腦干清楚顯示了BDA陽性細(xì)胞，提示BDA是穴位神經(jīng)通路示蹤的可靠示蹤劑，可以逆行跨神經(jīng)元示蹤;且實驗組的陽性細(xì)胞明顯多于對照組，可能與大椎穴處感受器、運(yùn)動神經(jīng)末梢比非穴位區(qū)密集有關(guān)，提示大椎穴治療疾病與神經(jīng)調(diào)節(jié)有一定的相關(guān)性。鑒于本次研究資料有限，大椎穴與延髓、腦橋、脊神經(jīng)節(jié)、頸交感神經(jīng)節(jié)、小腦、下丘腦等的神經(jīng)通路聯(lián)系還有待進(jìn)一步研究。大椎穴左、右旁開處、第7頸椎與第1胸椎棘突間與大椎穴神經(jīng)通路有無差異還需要進(jìn)一步探討。相信隨著研究的深入，項目組可以闡明大椎穴與中樞神經(jīng)聯(lián)系的神經(jīng)通路，為大椎穴治療疾病與神經(jīng)調(diào)節(jié)相關(guān)性提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]翟景慧，李曉泓，李輝，等.近年大椎穴臨床研究概況. 北京中醫(yī)，2004， 23（3）：186-188.

[2]林文注，王佩.實驗針灸學(xué).上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999，9：288.

[3]Glover J C， Petursdottir G， Jansen J K S. Fluorescent dextran-amines as neuronal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J Neurosci Method， 1986，18：243～254.

[4]陳亞亮，李 莉，高秀來. BDA法神經(jīng)束路追蹤技術(shù). 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002，23（3）：258-260.

（收稿日期：2014.05.08）endprint