重編程：生物學(xué)的黑匣子

重編程，意即把已分化的細(xì)胞逆轉(zhuǎn)回胚胎狀態(tài)，使其擁有可以發(fā)育成所有細(xì)胞類型的非凡能力，卵子與精子結(jié)合形成胚胎的過程也可以被看作一種重編程。從20世紀(jì)60年代，英國科學(xué)家約翰·戈登（John Gurdon）用蝌蚪的腸道細(xì)胞培育出一只的青蛙，到1996年，伊恩·威爾穆特（Ian Wilmut）用成體哺乳動物的細(xì)胞創(chuàng)造了多莉羊，重編程的研究已經(jīng)走過了幾十年的光陰。

2006年，研究人員對于重編程的興趣迅速上升，因為研究證明，僅需轉(zhuǎn)入4個基因，成熟的小鼠細(xì)胞就能被重編程，變?yōu)檎T導(dǎo)多能干細(xì)胞（ips）。這種方法非常簡單，幾乎所有的實驗室都可嘗試，現(xiàn)在該領(lǐng)域每年發(fā)表的論文超過1000篇。2014年，用多能細(xì)胞修復(fù)受損或患病組織的夢想已經(jīng)部分變成了現(xiàn)實，ips細(xì)胞分化出的視網(wǎng)膜細(xì)胞被移植到患有眼疾的女性體內(nèi)，這是重編程細(xì)胞首次移植到人體內(nèi)。

但是，沒人知道這是怎么發(fā)生的，連許多專門研究重編程的科學(xué)家也解釋不了。他們只知道，重編程就像生物學(xué)的一個黑匣子，分化細(xì)胞從這頭進(jìn)去，多能干細(xì)胞就會從那頭出來，這中間發(fā)生了什么卻不得而知。日本京都大學(xué)iPS細(xì)胞研究和應(yīng)用中心的分子生物學(xué)家克努特·沃爾特詹（Knut Woltjen）表示：“我們采用了許多研究手段，但重編程仍然令人感到困惑，我們正在做一件非常復(fù)雜的事?！?/p>

干細(xì)胞生物學(xué)家指出，問題之一在于，實驗材料總是細(xì)胞的混合物，其中每一個細(xì)胞的分子狀態(tài)都有些許不同。制造iPS細(xì)胞的過程通常效率低下，充滿變數(shù)：只有很小一部分細(xì)胞能夠被完全重編程，甚至這些重編程細(xì)胞之間還有著微妙但重要的區(qū)別。更重要的是，在不同實驗室中，重編程路徑可能根據(jù)細(xì)胞的生長條件不同而變化，因此難以對比已知的實驗結(jié)果。如果對細(xì)胞混合物的特征了解得不夠，就將其用于臨床則會引發(fā)安全上的擔(dān)憂。

不過，最近出現(xiàn)的新技術(shù)正在逐漸 打開黑匣子。通過對單個細(xì)胞進(jìn)行細(xì)致的分析、積累詳細(xì)的分子數(shù)據(jù)，生物學(xué)家正在探索重編程中發(fā)生的許多重要事件。最近，規(guī)模最大的重編程研究 國 際 合 作 計 劃——“宏 偉 計 劃 ”（Project Grandiose），公布了目前取得的進(jìn)展。項目團(tuán)隊采用一系列實驗，拍攝了重編程每個階段的高精度圖像，發(fā)現(xiàn)了多能性的另一種狀態(tài)?！斑@是對細(xì)胞狀態(tài)隨時間變化的首次高精度分析，”項目領(lǐng)導(dǎo)者、加拿大多倫多西奈山醫(yī)院干細(xì)胞生物學(xué)家安德拉斯·納吉（Andras Nagy）認(rèn)為，“毫不夸張地說，這是一項宏偉的事業(yè)”。

但是，要想進(jìn)一步操控這一過程，輕而易舉地得到治療性細(xì)胞，科學(xué)家還有很多工作要做?！安诲e，我們能獲得ips細(xì)胞，也能使它們分化，但我認(rèn)為，我們還不能控制它們，”以色列魏茨曼科學(xué)研究所的干細(xì)胞生物學(xué)家雅各布·漢納 （Jacob Hanna）說，“隨心所欲地控制細(xì)胞行為聽上去很酷，但要達(dá)到這個目的，我們必須獲得大量資料，詳細(xì)掌握細(xì)胞的分子生物學(xué)特性。”

從核移植到iPS

戈登和威爾穆特在重編程青蛙和綿羊的細(xì)胞時，采用的方法幾乎一致：把卵細(xì)胞的DNA剝離，植入已分化細(xì)胞的細(xì)胞核?？茖W(xué)家知道，卵細(xì)胞中的某些物質(zhì)能使細(xì)胞核重編程，比如關(guān)閉與皮膚細(xì)胞相關(guān)的基因，而開啟那些與多能性相關(guān)的基因，進(jìn)而觸發(fā)一系列的分子事件。在接下來的十年中，研究人員開發(fā)了各種新的重編程方式，例如向受精卵和胚胎干細(xì)胞植入細(xì)胞核，但這些方法都沒能弄清楚，究竟是細(xì)胞中的什么成分啟動了重編程，這個過程又是如何工作的。

2006年，日本京都大學(xué)的山中伸彌（Shinya Yamanaka）和高橋和利（Kautoshi Takahashi）制造出了iPS細(xì)胞，改變了一切。他們發(fā)現(xiàn)，早期胚胎或胚胎干細(xì)胞中的4種蛋白，可以重編程成體細(xì)胞，這就為研究人員提供了在培養(yǎng)皿中研究重編程的關(guān)鍵工具。現(xiàn)在，干細(xì)胞生物學(xué)家確信，引入這些被稱作“山中因子”的蛋白后，細(xì)胞內(nèi)會引發(fā)一陣強(qiáng)烈的、可預(yù)測的基因表達(dá)。然而，幾天以后，細(xì)胞就會進(jìn)入一個神秘狀態(tài)：細(xì)胞會一直分裂，但一直停滯在這個狀態(tài)。一周后，大概只有千分之一的細(xì)胞成為真正的多能細(xì)胞。

這個過程不可預(yù)知，我們也不可能知道最初是哪些細(xì)胞被重編程，重編程為何需要較長時間，不過，某些方面也是可以預(yù)見的?！霸诘聡毡竞兔绹?，研究人員可以在同樣的時間以相同的速率獲得iPS細(xì)胞，”哈佛大學(xué)的亞歷山大·邁斯納（Alexander Meissner）指出，“我們知道這不是魔術(shù)，而是一種機(jī)制，這是個好消息，我們應(yīng)該能找到它，”可是，目前進(jìn)展不大，“幾乎令人失望”。

幾天以后，細(xì)胞就會進(jìn)入一個神秘狀態(tài)：細(xì)胞會一直分裂，但一直停滯在這個狀態(tài)。一周后，大概只有千分之一的細(xì)胞能成為真正的多能細(xì)胞。

從細(xì)胞的角度來看，分化就像生物學(xué)上的“鎖”，要逆轉(zhuǎn)完全的分化狀態(tài)是個巨大的挑戰(zhàn)。我們以成纖維細(xì)胞為例，這種細(xì)胞來自皮膚的結(jié)締組織，科學(xué)家經(jīng)常用它們做重編程試驗。成纖維細(xì)胞帶有獨特的身份印記——它們的DNA具有表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，比如甲基或組蛋白修飾（組蛋白與染色體結(jié)構(gòu)密切相關(guān)）。因為有這些標(biāo)記的存在，在正常的成纖維細(xì)胞中，只有與這類細(xì)胞相關(guān)的基因才能得以表達(dá)，否則皮膚細(xì)胞會像正在分化的干細(xì)胞，而這可能是癌癥等疾病的病發(fā)途徑。

現(xiàn)在，科學(xué)家對引入“山中因子”這種強(qiáng)力因素之后的最初48小時非常感興趣。在胚胎干細(xì)胞中，這些蛋白會激活“多能性網(wǎng)絡(luò)”中的基因，讓干細(xì)胞保持無限增殖的能力。但是，一旦被引入到成纖維細(xì)胞等成熟細(xì)胞中，這些蛋白的作用方式又有不同。美國賓夕法尼亞大學(xué)的細(xì)胞生物學(xué)家肯·扎雷特（Ken Zaret）把“山中因子”引入成纖維細(xì)胞后，在最初兩天內(nèi)跟蹤觀測了這些因子的位置。結(jié)果他發(fā)現(xiàn)，受阻于細(xì)胞染色體的結(jié)構(gòu)，“山中因子”無法接觸到目標(biāo)基因。

相反，這些蛋白會結(jié)合到染色體的其他區(qū)域。有時，它們會激活細(xì)胞的自殺基因；有時，它們會結(jié)合到名為“增強(qiáng)子”的、負(fù)責(zé)調(diào)控基因表達(dá)的區(qū)域上，增強(qiáng)與重編程過程相關(guān)的基因的表達(dá)。麻省理工學(xué)院的干細(xì)胞生物學(xué)家魯?shù)婪颉ふ材崾≧udolf Jaenisch）認(rèn)為，“山中因子”與染色體的結(jié)合是“雜亂無章”的。

也有研究指出，在重編程的早期階段，細(xì)胞的染色體也會發(fā)生全面變化。在2011年發(fā)表的一項研究中，邁斯納的研究小組發(fā)現(xiàn)，一種名為H3K4me2的組蛋白修飾在細(xì)胞基因組的1000多個位點上發(fā)生了變化：這種修飾出現(xiàn)在了“多能性基因”的多個位點上，而在成纖維細(xì)胞的特異性基因上，這種修飾消失了。與此同時，細(xì)胞的外觀和行為特征也出現(xiàn)不同：細(xì)胞之間更緊湊，移動較少。

邁斯納表示：“我們最初的想法是，‘山中因子’會造成混亂，但從我們的研究來看，重編程的第一階段是可以預(yù)見的，而且在所有類型的細(xì)胞中是一致的。”現(xiàn)在，他幾乎可以預(yù)見某個細(xì)胞類型在重編程過程中，“哪些位點可能被激活，哪些可能被修飾，而哪些將保持沉默，”他同時表示，“我們可以預(yù)測這部分。但是，這并不能回答接下來會發(fā)生什么”。

第一階段結(jié)束之后，為期一周的停滯階段讓科學(xué)家感到非常迷惑。在這一階段，細(xì)胞仍在發(fā)生變化，有的還會表達(dá)新基因，但這時的細(xì)胞行為很難預(yù)測，也很難理解。甚至邁斯納等人觀測到H3K4me2修飾，也要在這一階段較晚的時候，才能增強(qiáng)基因的表達(dá)?！按蠖鄶?shù)細(xì)胞會進(jìn)入部分重編程的狀態(tài)。有些細(xì)胞則更接近重編程狀態(tài)，我們還不清楚為什么會這樣，”邁期納說，“這是一個 ‘黑匣子’”。然而，如果一個細(xì)胞開始合成SOX-2蛋白，就是一個好的跡象。“一旦SOX-2出現(xiàn)，重編程就進(jìn)入正軌了，”詹尼施說（他研究過細(xì)胞近50個基因在重編程過程中的活動）。幾天之內(nèi)，SOX-2蛋白等與多能性有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)量就會迅速上升。

但是，這個過程為什么要花費(fèi)如此長的時間？效率又如此低呢？“我們還不清楚為什么不能更快，”沃爾特詹認(rèn)為，一個細(xì)胞可能需要經(jīng)過幾次分裂，每次至少需要半天，以便改變DNA上的表觀遺傳標(biāo)記。“也許，這是限制因素之一”。

關(guān)于低轉(zhuǎn)化率，山中伸彌提出了幾種可能的解釋。一是起始細(xì)胞包含各種類型，例如，研究人員采集的、用于提取成纖維細(xì)胞的組織，可能混雜了很多互有細(xì)微差異的細(xì)胞；而即便都是成纖維細(xì)胞，彼此也不盡相同，它們的蛋白質(zhì)和分子也各有差異。此外，在體外培養(yǎng)時，細(xì)胞狀態(tài)也會時常發(fā)生變化。這意味著，重編程因子對每個細(xì)胞造成的影響都是不同的?！皩σ徊糠旨?xì)胞有效，并不意味著對其他的也有效，”山中伸彌說。此外，細(xì)胞的培養(yǎng)基，細(xì)胞之間的相互作用都可能存在差異，這就使研究人員難以控制所有變量?！耙尲?xì)胞之間完全同步是不可能的”。

目前，研究人員試圖為完成了重編程的細(xì)胞分類，努力完善重編程技術(shù)，弄清楚重編程是怎么發(fā)生的，從哪一個階段發(fā)生的。沃爾特詹已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，4個重編程因子的組合比例，會影響ips細(xì)胞的產(chǎn)出。比如，某種比例下，重編程的成功率可能比較高，但最終結(jié)果不甚理想，細(xì)胞只進(jìn)入了部分重編程的狀態(tài)，且狀態(tài)不穩(wěn)定；而另一種比例雖然效率較低，得到的iPS細(xì)胞的質(zhì)量卻很高。

“宏偉項目”的研究也證明，不同的變量，會產(chǎn)生完全不同的iPS細(xì)胞。在納吉的推動下，“宏偉項目”發(fā)起于2010年，來自8個研究機(jī)構(gòu)的30名科學(xué)家參加了該項目，目的就是要打開生物學(xué)上的這個“黑匣子”。納吉說：“我想知道那里面有什么?！庇蒙街幸蜃佑|發(fā)重編程后，研究人員在1個月里每天收集1億個細(xì)胞，然后定期分析細(xì)胞的蛋白質(zhì)、RNA、甲基化狀態(tài)的改變等，然后將分析產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)分發(fā)給世界各地的合作者。納吉說，該項目的名字就來源于項目規(guī)模，“當(dāng)我們意識到我們已經(jīng)收集了多少信息之后，就想出了這個名字。毫不夸張的說，這是一項宏偉的事業(yè)?！?/p>

打開“黑匣子”

最近的一個重要發(fā)現(xiàn)是一種新的多能干細(xì)胞，稱為F級細(xì)胞（F-class cell），它們的外觀毛茸茸的。研究人員對重編程方法進(jìn)行微調(diào)，就產(chǎn)生了這些細(xì)胞：研究人員并沒有像之前那樣，只在重編程開始后的前幾天引入重編程因子，而是持續(xù)加入?！斑@就導(dǎo)致了不同的結(jié)果，”納吉說。

F級細(xì)胞與iPS細(xì)胞不同，因為前者未能通過最嚴(yán)格的多能性測試之一：注射到小鼠胚胎后，它們不能由此發(fā)育成小鼠組織。出于這個原因，一些批評者說，F(xiàn)級細(xì)胞可能是其他科學(xué)家所說的 “部分重編程”細(xì)胞。但納吉認(rèn)為，這類細(xì)胞沒有發(fā)育成組織不代表它們沒有多能性，因為它們擁有其他多能性特征：例如，它們會形成畸胎瘤，而其中包含多種類型的細(xì)胞。

納吉指出，其他人都忽略了F級狀態(tài)，因為他們只是在尋找類似于胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞，而他的團(tuán)隊“在多能性這個問題上是無偏見的”。他認(rèn)為，可能有更多的多能性狀態(tài)會被發(fā)現(xiàn)，而他和同事也會在海量數(shù)據(jù)中尋找這些狀態(tài)?！斑@在概念上是很重要的，它開辟了另一扇大門”。

這些研究，讓科學(xué)家在重編程的核心問題上爭論得越來越激烈：重編程過程是否本身就有隨機(jī)的、不可預(yù)測的因素？直到最近，科學(xué)家才達(dá)成普遍的共識：重編程確實是隨機(jī)的。根據(jù)該“隨機(jī)”模式，重編程因子觸發(fā)分子事件后，一些細(xì)胞將進(jìn)入重編程狀態(tài)，一些不會——后者的去向無法預(yù)測。

但在一些研究，包括漢納的一項研究都表明，重編程方法可以調(diào)整，使這一過程更加高效——這表明隨機(jī)性可以控制甚至消除。這些研究意味著，重編程可以從一個隨機(jī)過程轉(zhuǎn)變?yōu)榇_定性的過程。

許多科學(xué)家說，現(xiàn)在重編程過程中既有確定性的階段（開始和結(jié)束），也有隨機(jī)的階段（中間神秘的一周）。對于這種爭論，漢納輕描淡寫，在他看來重編程的隨機(jī)性和確定性并沒有矛盾。他把重編程比作擲硬幣：每次擲硬幣的結(jié)果都是隨機(jī)的，但擲上100次，人像那面朝上的比例接近50%。類似的，任何一個細(xì)胞進(jìn)入重編程狀態(tài)都是隨機(jī)的，但隨著時間的推移，重編程技術(shù)每次能產(chǎn)生的多能細(xì)胞將到達(dá)一個確定的百分比 （或許是10%）。扎雷特表示，進(jìn)一步研究將解決這些爭論，弄清楚是什么因素讓細(xì)胞跳出一周的停滯期。

對于扎雷特而言，關(guān)于重編程的爭論引出了更重要的問題：引發(fā)隨機(jī)性的生物學(xué)規(guī)則是什么。“細(xì)胞系統(tǒng)本身是構(gòu)建在一些‘固有噪音’和隨機(jī)事件之上的，而這些因素會在一定程度上將細(xì)胞引向確定的命運(yùn)方向。細(xì)胞的命運(yùn)并沒有因為隨機(jī)事件而變來變?nèi)?，”他說。這個問題是涉及細(xì)胞類型的基礎(chǔ)，這也吸引著他開展研究。

而對于其他人，比如山中伸彌，打開“黑匣子”的目的很實際：更高效的重編程能使實驗完成得更好，得到更可靠的細(xì)胞來源，最終用于疾病治療。“我的研究動機(jī)是給病人治病，任何有助于推動iPS細(xì)胞進(jìn)入臨床的研究都讓我感到興奮?！?/p>

（摘自《環(huán)球科學(xué)》2015年2月號總第110期）