林永利 趙海鷹 劉金鋼 楊福全 田 忠

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院普通外科，遼寧沈陽110004

ERK 1/2和p-ERK 1/2在膽管癌組織中的表達及臨床意義

林永利 趙海鷹 劉金鋼 楊福全 田 忠

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院普通外科，遼寧沈陽110004

目的檢測細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)和其磷酸化狀態(tài)(p-ERK1/2)在膽管癌組織中的蛋白表達及臨床意義。方法收集肝外膽管癌組織標(biāo)本74例，正常膽囊結(jié)石膽囊管組織標(biāo)本25例，應(yīng)用SP免疫組化法檢測ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達情況;采用卡方檢驗分析ERK1/2和p-ERK1/2表達水平與臨床指標(biāo)關(guān)系;應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，單因素分析采用Kaplan-Meier模型，多因素分析采用COX比例風(fēng)險模型。結(jié)果膽管癌組織中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達陽性率分別為32.4%(24/74)和60.8%(45/74)，均明顯高于正常肝外膽管組織［16.0%(4/25)、24.0%(6/25)］，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。p-ERK1/2蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度密切相關(guān)(P＜0.05);p-ERK1/2陰性表達的肝外膽管癌患者總體生存期明顯長于p-ERK1/2表達陽性的患者(P=0.034)。單因素分析發(fā)現(xiàn)，p-ERK1/2的表達、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、臨床分期和腫瘤的分化程度均與患者預(yù)后相關(guān)(P＜0.05)，多因素分析證實p-ERK1/2的表達是影響預(yù)后的獨立風(fēng)險因素(P＜0.05)。結(jié)論膽管癌組織存在ERK1/2和p-ERK1/2高表達;p-ERK1/2的表達與臨床分期可作為膽管癌的預(yù)后因子。

ERK1/2;p-ERK1/2;膽管癌;病理;免疫組織化學(xué)

膽管癌是一類嚴(yán)重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤，占全部胃腸道腫瘤的3%，我國的發(fā)病率以每年遞增5%的速度上升，是消化道腫瘤中上升速度最快的腫瘤，近年來其發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)有快速上升的趨勢，臨床中膽管癌的重要性在逐步提升［1-2］。手術(shù)治療雖是目前最為有效的治療手段，但術(shù)后1、2、3年生存率分別為42.6%、30.0%、22.5%，中位生存時間為10個月［3］，研究膽管癌發(fā)生機制可以提高臨床醫(yī)生對膽管癌的認(rèn)識，幫助改進診斷治療的方法、尋找有效的預(yù)防措施，從而進一步改善膽管癌的預(yù)后。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular regulated kinase 1/2，ERK1/2)和p-ERK1/2作為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族的主要成員［4］，是近幾年的研究熱點，但其在膽管癌中的研究國內(nèi)少有報道，因此探討膽管癌中ERK1/2、p-ERK1/2的表達及臨床意義具有重要的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2005年1月～2009年10月中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院病理科經(jīng)病理明確診斷的肝外膽管癌手術(shù)切除組織標(biāo)本74例，其中男45例，女29例，年齡29～79歲,平均50.9歲，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者44例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例。臨床分期按1997年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期，所有患者術(shù)前均末接受化療、放療及其他抗腫瘤治療。另取25例膽囊結(jié)石膽囊切除術(shù)后的膽囊管殘端作為對照，經(jīng)病理檢測確認(rèn)為正常組織，其中男15例，女10例，年齡18～68歲，平均53.2歲。肝外膽管癌與對照患者在性別、年齡等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 免疫組化染色方法

采用免疫組化SP法檢測74例標(biāo)本中ERK1/2和p-ERK1/2在肝外膽管癌組織中的表達。鼠抗人ERK1/2和p-ERK1/2單克隆抗體購自NeoMarker公司，兔抗人表皮生長因子受體-2(HER-2)多克隆抗體購自武漢博士德公司;SP試劑盒、DAB顯色劑均購自北京中杉金橋公司。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化法(Streptavidin-Peroxidase，SP)，將標(biāo)本制成4μm的連續(xù)切片，60℃烤片2 h。經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫苯，水化后，進行S-P免疫組織化學(xué)染色，ERK1/2和p-ERK1/2的一抗稀釋度1∶100，二抗的稀釋度1∶200。采用PBS液代替一抗作為陰性對照，北京中杉金橋公司提供的陽性片作為陽性對照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

染色結(jié)果由兩位有經(jīng)驗且對患者病情不了解的病理科醫(yī)生觀察，鏡下細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒的為ERK1/2陽性表達;鏡下細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒的為p-ERK1/2陽性表達。隨機高倍鏡下選擇5個視野(400×)，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞，共1000個，計算每張切片陽性細(xì)胞百分率。ERK1/2陽性分級標(biāo)準(zhǔn):先按陽性細(xì)胞所占百分比打分，無陽性細(xì)胞數(shù)為0分，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分;再按鏡下細(xì)胞著色強度:無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分比與細(xì)胞著色強度的乘積: 0～3分陰性(-)，4～6分弱陽性(+)，7～9分強陽性(++)，參考Cooper［5］等的報道。p-ERK1/2陽性分級標(biāo)準(zhǔn):先按陽性細(xì)胞所占百分比打分，無陽性細(xì)胞數(shù)為0分，陽性細(xì)胞數(shù)＜1%為1分，1%～＜10%為2分，10%～50%為3分，＞50%為4分;再按細(xì)胞的著色強度打分:無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，參考Zhong等［6］的報道:陽性細(xì)胞百分比與細(xì)胞的著色強度乘積:0～3分陰性(-)，4～6分弱陽性(+)，7～9分中度陽性(++)，10～12分強陽性(+++)。

1.4 隨訪

隨訪截至2010年9月1日，生存時間定義為術(shù)后到患者死亡的時間。對中途失訪的患者，終止時間以最后一次的訪問時間為準(zhǔn)。電話隨訪跟蹤，失訪16例(21.62%)，死亡50例(67.57%)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗;應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，單因素分析采用Kaplan-Meier模型，多因素分析采用COX比例風(fēng)險模型。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在膽管癌組織中ERK1/2和p-ERK1/2的表達情況

實驗組中，ERK1/2和p-ERK1/2陽性表達率分別為32.4%(24/74)和60.8%(45/74)(圖1，封三);對照組中，ERK1/2和p-ERK1/2陽性表達率分別為16.0%(4/25)和24.0%(6/25);與對照組比較，實驗組ERK1/2和p-ERK1/2陽性表達率均顯著增高(均P＜0.05)。

2.2 ERK1/2和p-ERK1/2表達與膽管癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性

ERK1/2的表達與肝外膽管癌患者腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、年齡、性別比較均未見相關(guān)性。p-ERK1/2表達與腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān):淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例，p-ERK1/2陽性率明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例(χ2=5.323，P= 0.021);腫瘤分化程度低的患者，p-ERK1/2陽性表達率明顯高于分化程度高的患者(χ2=8.435，P=0.015)。不同腫瘤大小、年齡、性別患者中，p-ERK1/2蛋白陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 膽管癌患者臨床病理參數(shù)與ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達的關(guān)系［n(%)］

2.3 ERK1/2和p-ERK1/2表達與患者預(yù)后的相關(guān)性

ERK1/2和p-ERK1/2表達與肝外膽管癌患者的總體生存期的關(guān)系研究結(jié)果:ERK1/2表達水平與肝外膽管癌患者的總體生存期無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，見圖2。p-ERK1/2陽性表達的患者總體生存期明顯短于p-ERK1/2陰性表達者(P=0.034)，見圖3。

圖2 ERK表達水平與膽管癌患者臨床預(yù)后相關(guān)性分析

圖3 p-ERK1/2表達水平與膽管癌患者臨床預(yù)后相關(guān)性分析

2.4 總體生存期風(fēng)險因素分析

進行單變量COX回歸法分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、p-ERK1/2與患者的OS均顯著相關(guān)。進一步進行多變量COX回歸分析，引入分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、p-ERK1/2等因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNM分期和p-ERK1/2表達為影響預(yù)后的獨立風(fēng)險因素。見表2、3。

表2 總體生存期的單因素分析(個月)

表3 總體生存期的多因素分析

3 討論

ERK屬于絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶，是MAPK家族的重要成員，可以將多種細(xì)胞外信號，如腫瘤啟動因子、細(xì)胞因子、生長因子等，經(jīng)過磷酸化活化逐級傳遞至細(xì)胞核，并激活多種核轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂及分化等［7-8］，是多種生長因子如表皮生長因子(EGF)［9］、神經(jīng)生長因子(NGF)［10］、血小板源性生長因子(PDGF)［11］等的下游蛋白，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中ERK及其信號途徑起中介和放大信號作用:接受來自絲裂原、生長因子、環(huán)境刺激等的信號;通過ERK信號級聯(lián)反應(yīng)作用于核轉(zhuǎn)錄因子如AP21、NF2κB等，調(diào)控基因表達［12-13］。

ERK的過度激活在許多癌癥，如口腔癌［14］、黑色素瘤［15］、乳腺癌［16］等中均可發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)有研究顯示，ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過調(diào)控線粒體凋亡途徑減弱了TRAIL誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞株HeLa的凋亡［17］。ERK1/2途徑的激活參與XCL12/CXCR4和肝細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的膽管癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［18-19］。而目前在肝外膽管癌組織中關(guān)于ERK1/2的表達研究較少。

ERK1/2磷酸化后即p-ERK1/2，p-ERK1/2是ERK1/2的活化形式，磷酸化后的ERK1/2(p-ERK1/2)作用于細(xì)胞核內(nèi)的c-jun、NF-κB、c-fos等轉(zhuǎn)錄因子，磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子和其他蛋白激酶等多種底物，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進而參與細(xì)胞生長、發(fā)育等，并在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等病理過程中起重要作用［20-21］。目前國內(nèi)關(guān)于p-ERK1/2在肝外膽管癌組織中的表達研究報道較少?；诖?，本文研究肝外膽管癌組織中ERK1/2和p-ERK1/2的表達及其與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，具有重要的臨床意義和社會價值，可能為膽管癌的治療提供一個新的腫瘤的治療的靶點。

本研究結(jié)果:ERK1/2、p-ERK1/2在膽管癌組織、正常膽管組織中均有表達，但膽管癌組織中ERK1/2、p-ERK1/2的表達率明顯高于對照組(正常膽管組織)，提示膽管癌的發(fā)生可能與ERK1/2、p-ERK1/2的過表達密切相關(guān)。在分化程度低、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者中p-ERK1/2表達明顯增高，提示p-ERK1/2與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。膽管癌組織中p-ERK1/2表達越高，其總體生存期越短。綜合研究提示，p-ERK1/2表達可能作為膽管癌判斷預(yù)后的獨立風(fēng)險因子。而研究發(fā)現(xiàn)ERK1/2的表達與患者臨床病理參數(shù)、預(yù)后無統(tǒng)計學(xué)差別，提示ERK1/2的表達可能不是膽管癌的一個預(yù)后因子。

總之，從本研究結(jié)果可以得出這樣的結(jié)論:膽管癌組織存在ERK1/2和p-ERK1/2高表達;p-ERK1/2表達與臨床分期可作為膽管癌的預(yù)后因子。

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Expression and clinical significance of ERK1/2 and p-ERK1/2 in cholangiocarcinoma

LIN Yongli ZHAO Haiying LIU Jingang YANG Fuquan TIAN Zhong
Department of General Surgery,Shengjing Hospital of China Medical University,Liaoning Province,Shenyang 110004,China

Objective To study the expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 in cholangiocarcinoma and its clinical significance.MethodsERK1/2 and p-ERK1/2 protein expression were detected in 74 cases of cholangiocarcinoma and 25 cases of normal bile ducts tissues using immunohistochemistry(SP method).The correlations of expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 with the clinical index were detected by chi-square test.Survival probabilities were estimated by the Kaplan-Meier method and assessed by a Log-rank test.The Kapla-Meier model was used to analyze single factor. Cox’s proportional hazard regression model was performed to evaluate the multi-factors.ResultsThe positive expression rate of ERK1/2 and p-ERK1/2 in the cholangiocarcinoma tissues were 32.4%(24/74),60.8%(45/74),which were significantly higher than those in normal bile ducts tissues［16.0%(4/25),24.0%(6/25)］,the differences were statistically significant(P＜0.05).The expression of p-ERK1/2 protein was associated with lymph node metastases state and differentiation level of tumor(P＜0.05).The survival time in patients with p-ERK1/2 negative expression was longer than patients with positive expression(P=0.034).Single factor analysis showed that p-ERK1/2 expression,differentiated degree of tumor,lymphatic metastasis and clinical stages were connected with prognosis(P＜0.05).Multi-factor analysis proved that p-ERK1/2 expression and clinical stages could be regarded as independent risk factors of cholangiocarcinoma prognosis(P＜0.05).ConclusionThere are higher expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 in cholangiocarcinoma.p-ERK1/2 and clinical stages may be served as a prognostic factor in cholangiocarcinoma.

ERK1/2;p-ERK1/2;Cholangiocarcinoma; Pathology;Immunohistochemistry

R735.8

A

1673-7210(2015)03(a)-0019-05

2014-11-18本文編輯:任念)

遼寧省自然科學(xué)基金項目(編號20102297);遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃項目(編號2009225036)。

林永利(1979-)，男，遼寧遼陽人，中國醫(yī)科大學(xué)2007級臨床專業(yè)在讀碩士研究生;研究方向:肝膽疾病。

趙海鷹(1973-)，女，副教授，碩士生導(dǎo)師;研究方向:膽道疾病、乳腺、甲狀腺等疾病的外科手術(shù)治療以及腹腔鏡微創(chuàng)手術(shù)治療。