劉文蘭 油紅捷 趙青舟 歐陽羅丹 高變娥 張 欣 車念聰

首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京100069

肝纖維化大鼠陰虛證表征的觀察及一貫煎的干預(yù)作用

劉文蘭 油紅捷 趙青舟 歐陽羅丹 高變娥 張 欣 車念聰

首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京100069

目的檢測(cè)肝纖維化大鼠的陰虛證表征，觀察滋補(bǔ)肝腎中藥一貫煎對(duì)陰虛證表征的影響。方法將48只雄性Sprague-Dawlay大鼠隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組、一貫煎組，每組12只。除正常對(duì)照組外，均建立CCl4致肝纖維化大鼠模型，在CCl4停止注射后3 d，一貫煎組每只動(dòng)物給予相應(yīng)濃度的一貫煎濃縮液2mL/200 g灌胃，1次/d。陽性對(duì)照組給予秋水仙堿灌胃，0.25mg/kg，1次/d。正常對(duì)照組和模型組按相同方法灌服等量生理鹽水。4周后，檢測(cè)各組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等肝功能指標(biāo);通過HE染色評(píng)價(jià)肝臟炎癥活動(dòng)度(G)和纖維化程度(S);檢測(cè)大鼠體重、舌面干濕度、舌面溫度、舌微循環(huán)血流速度、飲水、大小便等陰虛證表征。結(jié)果①一貫煎在改善肝功能、減輕炎癥、抗肝纖維化方面作用較好:一貫煎組ALT［(41.66±3.72)U］較模型組［(61.00±0.00)U］降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);一貫煎組AST［(146.03± 46.41)U］較模型組［(218.90±12.56)U］降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);一貫煎組炎癥活動(dòng)度［(1.00±0.00)］較模型組［(3.00±0.00)］降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);一貫煎組纖維化程度［(1.00±0.00)］較模型組［(2.00±0.00)］降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。②肝纖維化大鼠具有陰虛證的表征，一貫煎能夠改善陰虛證的癥狀。體重:模型組的體重［(380.66±37.29)g］較正常對(duì)照組［(507.00±17.69)g］減少(P＜0.05);一貫煎組體重［(473.66±13.86)g］較模型組增高(P＜0.05)。舌面干濕度:模型組的舌面干濕度［(0.000 36±0.000 28)g］較正常對(duì)照組［(0.007 32± 0.001 26)g］減少(P＜0.05);一貫煎組舌面干濕度［(0.012 83±0.005 85)g］較模型組增高(P＜0.05)。舌面溫度:模型組的舌溫度［(34.48±1.24)℃］較正常對(duì)照組［(30.63±0.80)℃］增高(P＜0.05);一貫煎組舌溫度［(31.40±2.10)℃］較模型組降低(P＜0.05)。舌血流速度:模型組的舌血流速度［(69.78±21.44)AU］較正常對(duì)照組［(31.43±1.58)AU］增高(P＜0.05);一貫煎組舌血流速度［(40.50±3.89)AU］較模型組降低(P＜0.05)。飲水:模型組飲水量［(37.52±10.46)mL］較正常對(duì)照組［(59.65±6.05)mL］顯著減少(P＜0.05);一貫煎組飲水量［(53.69±8.74)m L］較模型組顯著增多(P＜0.05)。大便:模型組大便［(1.00±0.00)分］較正常對(duì)照組［(2.00±0.00)分］分值減少(P＜0.05);一貫煎組大便［(2.00± 0.00)分］較模型組分值增多(P＜0.05)。小便:模型組小便［(2.00±0.00)分］較正常對(duì)照組［(1.00±0.00)分］分值增高(P＜0.05);一貫煎組小便［(1.33±0.57)分］較模型組分值減少(P＜0.05)。結(jié)論肝纖維化大鼠具有陰虛證的特點(diǎn)，滋補(bǔ)肝腎中藥一貫煎不僅能改善肝纖維化大鼠的病理，還能改善陰虛證的癥狀。該研究為肝纖維化大鼠陰虛證的診斷和藥理機(jī)制的研究提供了新的思路。

肝纖維化;陰虛證;一貫煎

陰虛證是指陰液虧虛，不能制陽所致的虛熱證候，又稱虛熱證［1］。其臨床表現(xiàn)有咽干口燥，形體消瘦，潮熱盜汗，顴紅，五心煩熱，小便短赤，大便干結(jié)，舌紅少津少苔，脈細(xì)數(shù)。陰虛證是慢性乙型肝炎的常見證候［2］。肝纖維化是慢性乙型肝炎的常見病理表現(xiàn)［3］，肝纖維化大鼠是否具有陰虛證的表征?滋補(bǔ)肝腎中藥除了改善肝纖維化病理外，對(duì)陰虛證表征是否存在影響?本研究制備CCl4致肝纖維化大鼠模型，觀察該模型陰虛證的表征，提示滋補(bǔ)肝腎中藥一貫煎除了改善肝組織病理外，對(duì)陰虛證表征也具備改善作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

Sprague-Dawlay大鼠，雄性，體重250～350 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK(京)2012-0001，共48只，飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部SPF級(jí)動(dòng)物室。

1.2 儀器

激光多普勒血流儀，英國moorVMS-LDF;電子天平，德國Sartorius TE1502S;紅外測(cè)溫儀，SHANFENG型號(hào)SF530。

1.3 試劑

秋水仙堿:西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)120412。橄欖油:阿果薩特級(jí)初榨橄欖油，原產(chǎn)國:西班牙(原裝進(jìn)口)，最大酸度0.4%，批號(hào)14001952。四氯化碳:四氯化碳分析純專用試劑，純度≥99.5%，北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)20060132。一貫煎濃縮液的制備:根據(jù)一貫煎原方藥物劑量和比例，選取北京同仁堂藥店的標(biāo)準(zhǔn)中藥北沙參9 g、麥冬9 g、當(dāng)歸9 g、生地黃20 g、枸杞子12 g、川楝子4.5 g，將飲片置煎煮容器內(nèi)，加相當(dāng)于藥材量5～7倍的冷水浸泡1～2 h，煮沸30min，過濾。藥渣加3～5倍量水繼續(xù)煎煮，煮沸20min，過濾。合并2次濾液，按照體表面積計(jì)算，大鼠每100 g體重所需生藥為0.65 g，將一貫煎濃縮液按照100 g大鼠灌胃1 m L的體積配成相應(yīng)濃度，冷卻裝入滅菌藥瓶，高溫滅菌后，對(duì)pH值、比重、衛(wèi)生學(xué)進(jìn)行檢測(cè)，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組、一貫煎組，每組12只。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，模型組、陽性對(duì)照組、一貫煎組每只動(dòng)物制備CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型:大鼠腹腔注射50%CCl4橄欖油溶液(0.2 mL/100 g)，每周2次，共2周;隨后腹腔注射0.1m L/100 g的CCl4橄欖油溶液，每周2次，共2周;接著腹腔注射0.05 mL/100 g的CCl4橄欖油溶液，每周2次，共2周。同時(shí)，正常對(duì)照組則以同樣方法注射等量橄欖油。在CCl4停止注射后3 d，一貫煎組每只動(dòng)物給予相應(yīng)濃度的一貫煎濃縮液2mL/200 g灌胃，1次/d，連續(xù)4周。陽性對(duì)照組給予秋水仙堿灌胃，0.25 mg/kg，1次/d，連續(xù)4周。正常對(duì)照組和模型組按相同方法灌服等量生理鹽水。

1.5 觀察指標(biāo)

治療4周后，測(cè)量大鼠體重、食物、飲水量，記錄大便、小便情況。大便干為1分，正常為2分，稀為3分;小便白為1分，黃為2分。在恒溫的實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物處于麻醉狀態(tài)下，使用紅外測(cè)溫儀檢測(cè)舌面溫度;使用pH試紙和精密電子天平檢測(cè)舌面干濕度;使用激光多普勒血流儀檢測(cè)舌面微循環(huán)血流速度;使用SXOUTⅡ半自動(dòng)生化分析儀測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等肝功能指標(biāo);對(duì)石蠟包埋的組織切片進(jìn)行HE染色，由同一名病理專家依據(jù)2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的慢性肝炎分級(jí)分期標(biāo)準(zhǔn)［4］，對(duì)大鼠的肝臟炎癥活動(dòng)度(G)和纖維化程度(S)進(jìn)行病理分級(jí)和分期診斷。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝功能檢測(cè)

模型組的血清ALT、AST水平較正常對(duì)照組增高(P＜0.05)，說明該模型建立成功。一貫煎組ALT較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);陽性對(duì)照組、一貫煎組AST較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);結(jié)果提示，一貫煎能夠改善肝纖維化大鼠的肝功能，具有保肝降酶的作用。見表1。

2.2 肝組織病理檢測(cè)

模型組肝組織炎癥活動(dòng)度、纖維化程度與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示肝纖維化大鼠模型建立成功。一貫煎組炎癥活動(dòng)度較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);一貫煎組肝組織纖維化程度較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示一貫煎能夠改善肝纖維化大鼠肝組織的炎癥程度和纖維化程度。見表1、圖1。

表1 各組肝功能、炎癥活動(dòng)度、纖維化程度、陰虛證表征比較()

表1 各組肝功能、炎癥活動(dòng)度、纖維化程度、陰虛證表征比較()

注:與正常對(duì)照組比較，$P＜0.05;與模型組比較，※P＜0.05;ALT:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;AST:天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;G:炎癥活動(dòng)度;S:纖維化程度

組別只數(shù)ALT(U)AST(U)G(級(jí))S(期)體重(g)舌面干濕度(g)正常對(duì)照組模型組陽性對(duì)照組一貫煎組12 12 12 12 54.30±4.33 61.00±0.00$62.06±10.40 41.66±3.72※173.26±61.08 218.90±12.56$154.46±32.53※146.03±46.41※0.00±0.00 3.00±0.00$3.00±0.00 1.00±0.00※0.00±0.00 2.00±0.00$2.33±0.57 1.00±0.00※507.00±17.69 380.66±37.29$405.66±44.01 473.66±13.86※0.00732±0.00126 0.00036±0.00028$0.00610±0.00420 0.01283±0.00585※組別只數(shù)舌面溫度(℃)舌血流速度(AU)食物(g)飲水(mL)大便(分)小便(分)正常對(duì)照組模型組陽性對(duì)照組一貫煎組12 12 12 12 30.63±0.80 34.48±1.24$33.86±0.98 31.40±2.10※31.43±1.58 69.78±21.44$56.73±18.76 40.50±3.89※23.25±1.30 22.50±0.73 26.30±13.17 21.65±4.12 59.65±6.05 37.52±10.46$30.90±0.85 53.69±8.74※2.00±0.00 1.00±0.00$1.00±0.00 2.00±0.00※1.00±0.00 2.00±0.00$2.00±0.00 1.33±0.57※

2.3 體重檢測(cè)

模型組的體重較正常對(duì)照組減少(P＜0.05)，說明該模型形體消瘦。一貫煎組體重較模型組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示一貫煎能夠增加肝纖維化大鼠的體重。見表1。

圖1 治療后各組肝組織HE染色(200×)

2.4 舌面干濕度檢測(cè)

模型組的舌面干濕度較正常對(duì)照組減少(P＜0.05)，提示該模型存在口干癥狀。一貫煎組舌面干濕度較模型組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示一貫煎能夠改善肝纖維化大鼠的口干癥狀。見表1。

2.5 舌溫度檢測(cè)

模型組的舌溫度較正常對(duì)照組增高(P＜0.05)，提示該模型體溫偏高。一貫煎組舌溫度較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示一貫煎能夠改善肝纖維化大鼠的陰虛內(nèi)熱癥狀。見表1。

2.6 舌血流速度檢測(cè)

模型組的舌血流速度較正常對(duì)照組增高(P＜0.05)，提示該模型血流速度偏快。一貫煎組舌血流速度較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示一貫煎能夠降低肝纖維化大鼠的血流速度。見表1。

2.7 食物和飲水檢測(cè)

各組間食物量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，模型組飲水量較正常對(duì)照組顯著減少(P＜0.05)，提示該模型動(dòng)物口干但不欲飲;一貫煎組飲水量較模型組顯著增多(P＜0.05)。見表1。

2.8 大便和小便檢測(cè)

正常對(duì)照組大鼠小便顏色淡白，大便正常，模型組大鼠小便顏色變黃，大便干硬，兩組評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示該模型存在陰津損傷的病理。一貫煎組小便顏色淺黃，大便較正常，與模型組評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

3 討論

雖然動(dòng)物和人存在很大差異，動(dòng)物模型的證候診斷較難進(jìn)行，然而經(jīng)過大量的研究，動(dòng)物模型證候表征的評(píng)價(jià)方法逐漸成熟。研究觀察到大鼠/小鼠大量的癥狀和體征變化，包括毛發(fā)光澤、蜷縮、扎堆、胃寒喜暖、活動(dòng)減少、行動(dòng)呆滯、弓背、發(fā)抖、精神萎靡、消瘦、倦怠、欲睡、食欲不振、眼中無神、唇周發(fā)黑、便溏、肛門紅腫充血、體溫變化、心率變化、舌色變化、爪色變化、分泌物變化等。這些外在表征，在一定程度上反映了動(dòng)物當(dāng)時(shí)的證候類型。因此，這些外在表征也成為了證候模型評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)群［5-8］。

既往對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物陰虛證候的診斷，主要從以下幾方面進(jìn)行判斷:體重(相當(dāng)于形體消瘦);溫度(相當(dāng)于身熱);飲水(相當(dāng)于口干);汗出(相當(dāng)于盜汗);食物;爪、尾紅色程度(相當(dāng)于五心煩熱);大便;小便;毛發(fā)干枯;煩躁易怒;皮毛光澤度;行動(dòng)遲緩;反應(yīng)遲鈍等［9-13］。根據(jù)臨床陰虛證患者的癥狀表現(xiàn)，本研究選擇體重(相當(dāng)于形體消瘦)、舌面溫度(相當(dāng)于身熱)、舌面干濕度(相當(dāng)于口干)、舌血流速度(相當(dāng)于脈數(shù))、飲水情況、大便(反映津液損傷情況)、小便(反映津液損傷情況)7項(xiàng)指標(biāo)作為判斷陰虛證大鼠的表征。研究結(jié)果提示，肝纖維化大鼠體重減輕，舌面變干，舌血流速度增高，大便干，小便黃，飲水減少，但食物沒有明顯變化。提示CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型中醫(yī)證候更類似于陰虛證，而不是脾虛證。

本研究制備肝纖維化大鼠模型，采用滋補(bǔ)肝腎中藥對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，研究結(jié)果提示，滋補(bǔ)肝腎中藥一貫煎不僅能改善該模型大鼠的肝功能，減輕肝組織的炎癥程度和纖維化程度，對(duì)于陰虛證相關(guān)的表征也有一定的改善作用，一貫煎組大鼠在體重(消瘦)、舌面干濕度(口干)、舌面溫度(身熱)、舌血流速度(脈數(shù))、大小便(津液損傷)、飲水(津液損傷)等方面較模型組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示一貫煎具有改善肝纖維化大鼠陰虛證表征的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，肝纖維化大鼠具有陰虛證的特點(diǎn)，滋補(bǔ)肝腎中藥一貫煎不僅能改善肝組織的病理，還能改善陰虛證的癥狀。該研究為肝纖維化大鼠陰虛證的診斷和藥理機(jī)制的研究提供了新的思路。

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Features of hepatic fibrosis in rats with Yin deficiency syndrome and the intervention effects of Yiguanjian

LIU Wenlan YOU Hongjie ZHAO Qingzhou OUYANG Luodan GAO Bian＇e ZHANG Xin CHE Niancong
College of Traditional Chinese Medicine,Capital Medical University,Beijing 100069,China

Objective To detect the Yin deficiency symptoms of hepatic fibrosis in rats,observe the effect of traditional Chinese medicine Yiguanjian on characterization of Yin deficiency syndrome.Methods 48 male Sprague-Dawlay rats were randomly divided into 4 groups:normal group,model group,positive control group,Yiguanjian group,each group had 12 rats.Except the normal group,hepatic fibrosis model induced by CCl4was established.After 3 days when the CCl4injection was stopped,each rat in Yiguanjian group was given Yiguanjian(2 m L/200 g)by intragastric administration,1 time/d.Positive control group was given Colchicine(0.25 mg/kg)by intragastric administration,1 time/d.The normal group and model group were fed with same volume of saline daily.After 4 weeks,serum levels of aspartate aminotransferase(AST)and alanine aminotrans-ferase (ALT)were measured by routine Methods;the HE staining was used to evaluate the semi-quantitative scoring of liver inflammation(G)and liver fibrosis(S);the features of Yin deficiency syndrome like body weight,tongue humidity, temperature of tongue,tongue microcirculation blood flow velocity,drinking,stool and urine were detected.Results①Yiguanjian had good effect in improving liver function,reduce inflammation,anti-liver fibrosis.Compared with the model group［(61.00±0.00)U］,ALT was significantly declined in Yiguanjian group［(41.66±3.72)U］,with statistically significant difference(P＜0.05).Compared with the model group［(218.90±12.56)U］,AST was significantly declined in Yiguanjian group［(146.03±46.41)U］,with statistically significant difference(P＜0.05).Compared with the model group［(3.00±0.00)］,the semi-quantitative scoring of liver inflammation was significantly declined in Yiguanjian group［(1.00± 0.00)］,with statistically significant difference(P＜0.05).Compared with the model group［(2.00±0.00)］,the semi-quantitative scoring of fibrosis was significantly declined in Yiguanjian group［(1.00±0.00)］,with statistically significant difference(P＜0.05).②The rat of hepatic fibrosis had symptoms of Yin deficiency syndrome,Yiguanjian could improve the symptoms of Yin deficiency syndrome.Bodyweight:compared with the normal group［(507.00±17.69)g］,the body weight was significantly declined in model group［(380.66±37.29)g,P＜0.05］.Compared with the model group,the body weight significantly increased in Yiguanjian group［(473.66±13.86)g,P＜0.05］.Tongue humidity:compared with the normal group［(0.007 32±0.001 26)g］,the tongue humidity was significantly declined in model group［(0.000 36±0.000 28)g, P＜0.05］.Compared with the model group,the tongue humidity significantly increased in Yiguanjian group［(0.012 83± 0.005 85)g］,(P＜0.05).Temperature of tongue:compared with the normal group［(30.63±0.80)℃］,the temperature of tongue significantly increased in model group［(34.48±1.24)℃,P＜0.05］.Compared with the model group,the temperature of tongue significantly declined in Yiguanjian group［(31.40±2.10)℃,P＜0.05］.Tongue microcirculation blood flow velocity:compared with the normal group［(31.43±1.58)AU］,the blood flow velocity significantly increased in model group［(69.78±21.44)AU,P＜0.05］.Compared with the model group,the blood flow velocity significantly declined in Yiguanjian group［(40.50±3.89)AU,P＜0.05］.Drinking:compared with the normal group［(59.65±6.05)mL］,the drinking significantly declined in model group［(37.52±10.46)mL,P＜0.05］.Compared with the model group,the drinking significantly increased in Yiguanjian group［(53.69±8.74)m L,P＜0.05］.Stool compared with the normal group［(2.00± 0.00)］,the semi-quantitative scoring of stool significantly declined in model group［(1.00±0.00),P＜0.05］.Compared with the model group,the semi-quantitative scoring of stool significantly increased in Yiguanjian group［(2.00±0.00),P＜0.05］.Urine:compared with the normal group［(1.00±0.00)］,the semi-quantitative scoring of urine significantly increased in model group［(2.00±0.00),P＜0.05］.Compared with the model group,the semi-quantitative scoring of urine significantly declined in Yiguanjian group［(1.33±0.57),P＜0.05］.ConclusionThe rat of hepatic fibrosis has the characteristics of Yin deficiency syndrome,Yiguanjian can not only improve the liver injury in rat,but also can improve the symptoms of Yin deficiency syndrome.This study provides a new idea to study the diagnosis and research of pharmacological mechanism of Yin deficiency syndrome in rats with liver fibrosis.

Hepatic fibrosis;Yin deficiency syndrome;Yiguanjian

R285.5

A

1673-7210(2015)03(a)-0007-05

2014-10-27本文編輯:程銘)

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)81273668)。

劉文蘭，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師;研究方向:慢性肝炎中醫(yī)證候病理基礎(chǔ)。