余 琦 陳 穎 韓莉娟 徐 麗 王 蘭＊

（1西安醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，西安710021；2西安交通大學(xué)電子與信息工程學(xué)院，西安710049；3西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安710069；4西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，西安710077）

心血管病是在世界范圍內(nèi)危害人類健康的頭號殺手，而動脈粥樣硬化是心血管病的病理基礎(chǔ)之一。動脈粥樣硬化是一類復(fù)雜病變，使用動物模型是研究動脈粥樣硬化不可或缺的手段。但普通動物并不容易誘發(fā)動脈粥樣硬化形成，特別是大小鼠很難通過單純的高脂飼養(yǎng)誘發(fā)動脈粥樣硬化。家兔作為一種常用的實(shí)驗(yàn)動物模型，不僅脂蛋白譜和人類比較相似，而且很容易通過高膽固醇食物誘導(dǎo)形成動脈粥樣硬化［1］。目前，一些基因缺陷的動物模型，如渡邊遺傳性高脂血癥家兔、apoE敲除小鼠和LDL受體缺陷小鼠模型開發(fā)和應(yīng)用，使模型動物產(chǎn)生的動脈粥樣硬化病變更加接近于人類，幾乎可以形成與人類高度相似的各個時期動脈粥樣硬化病變。然而，復(fù)雜和更加接近于人類的動脈粥樣硬化病變也增加了研究的難度，特別是在對這些病變進(jìn)行定量分析的時候仍然需要大量繁瑣的工作和昂貴的圖像分析軟件進(jìn)行支持，加重了實(shí)驗(yàn)室人力和物力的負(fù)擔(dān)。針對這種情況，我們提出了一套分析動脈粥樣硬化的方法，能夠通過病變圖像的分析進(jìn)行較為精確的定量，該方法基于美國國立衛(wèi)生研究院（Nation Institute of Health，NIH）開發(fā)的、可運(yùn)用于多平臺的、基于java的免費(fèi)圖像處理軟件Image J。

材料和方法

1.標(biāo)本收集和處理

10只16月齡日本大耳白兔高膽固醇飼養(yǎng)（飼料中加入0.3%的膽固醇和3%的玉米油）28 w，處死動物后分離動脈樹，甲醛溶液固定后使用蘇丹Ⅳ對動脈樹進(jìn)行染色，采集圖片后分析病變，再將動脈樹中主動脈弓一段分割成10小段，石蠟包埋后切成10張連續(xù)切片備用［2］。家兔的心臟也被取出并由甲醛溶液固定，橫切成7個包塊，石蠟包埋后每個包塊切成10張連續(xù)切片備用（500或1000 mm間隔）。日本大耳白兔由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購買，所有動物實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容由西安醫(yī)學(xué)院倫理委員會審核并批準(zhǔn)。

2.免疫組化染色

所有動物的主動脈和心臟的切片進(jìn)行H＆E（hematoxylin and eosin ）染色、EVG （elastic van Gieson）染色和免疫組化染色。在免疫組化染色中，使用抗RAM11抗體（DAKO公司；1∶200）來定位巨噬細(xì)胞，使用抗HHF35抗體（thermo公司；1∶200）來定位平滑肌細(xì)胞，染色步驟與我們前面的研究相同［3］。

3.圖像采集和軟件下載

高質(zhì)量的病理圖像是圖像分析的基礎(chǔ)，參考以前的研究，我們認(rèn)為要得到合格的病理圖像需要以下步驟［4］：1）所有圖像必須在同一條件下采集；2）為了保證灰度值范圍在0－255之間，應(yīng)將顯微鏡圖像采集系統(tǒng)的自動白平衡關(guān)掉；3）應(yīng)通過增加光亮度將圖像空白部分調(diào)成白色，并且將假陽性的染色盡量排除在圖像以外；4）所有的圖像應(yīng)保存為無損的tiff格式（24－bit RGB），像素為640×480。

軟件下載可直接進(jìn)入http：／／Image J.nih.gov網(wǎng)站，根據(jù)自己電腦系統(tǒng)免費(fèi)下載Image J圖像軟件并安裝，目前該軟件支持包括Mac OS、Windows、Linux等即幾乎全部平臺系統(tǒng)。此外，用戶還可以根據(jù)圖像分析的目的下載近400種免費(fèi)插件，可以分析包括免疫組化在內(nèi)的各種靜態(tài)的圖像及動態(tài)的視頻。

4.對鏡下病變進(jìn)行定量分析

鏡下病變面積的計(jì)算需要將主動脈弓（切成10小段）和心臟（切成7個包塊）的切片進(jìn)行EVG的染色，可根據(jù)染色后的血管內(nèi)彈力板來界定病變范圍。所有需要分析的圖像應(yīng)該在分析之前進(jìn)行定標(biāo)。點(diǎn)擊Image J軟件窗口上的“Straght”工具，沿圖像中已知標(biāo)尺畫一條直線，進(jìn)入“Analyze”菜單的“Set measurement”子菜單點(diǎn)擊“Set Scale”中在“Know distance”選項(xiàng)中輸入標(biāo)尺的距離，然后在“Unitof length”中輸入距離的單位（圖2A）。完成定標(biāo)后可使用Image J軟件窗口上“Freehand sections”和“Freehand sections”工具對鏡像下病變區(qū)域進(jìn)行選擇，點(diǎn)擊“Measurement”進(jìn)行測量后結(jié)果將在新窗口中顯示，并將所有切面的病變面積進(jìn)行平均（圖2B）。

5.對主動脈大體病變面積和免疫組化進(jìn)行定量分析

所有經(jīng)過染色的圖像（包括主動脈病變蘇丹Ⅳ染色圖像和免疫組化染色圖像）需要轉(zhuǎn)換成灰度圖像后對陽性染色區(qū)域進(jìn)行定量分析（圖1A和圖3A）：1）進(jìn)入“Image”菜單然后點(diǎn)擊“Type”子菜單選擇“RGB Stake”選項(xiàng)將圖片分割成紅、綠和藍(lán)三個通道后轉(zhuǎn)換成三張灰度圖像；2）選擇一個陽性染色和背景分離最好的圖像作為定量的候選圖像；3）再次進(jìn)入“Image”菜單點(diǎn)擊“Adjust”子菜單，使用“Threshold”工具定位陽性染色區(qū)域，直到所有陽性染色區(qū)域被高亮成紅色；4）進(jìn)入“Analyze”菜單的“Set Measurement”子菜單，選擇“Area”，“Area Fraction”，“Limit to Threshold”和“Display Label”四個選項(xiàng)，點(diǎn)擊“OK”進(jìn)行保存，在同樣菜單下點(diǎn)擊“Measurement”進(jìn)行測量，結(jié)果將在新窗口顯示。為了排除假陽性染色區(qū)域，可在“Analyze”菜單的“Tools”子菜單中選擇“ROI Manager”工具，可限定圖像中感興趣的區(qū)域進(jìn)行計(jì)算。

6.數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SD）表示，并采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。為了驗(yàn)證Image J軟件的準(zhǔn)確性，另一款商業(yè)圖像分析軟件Image pro－plus 6.0（IPP；Media Cybernetics，Silver Spring，USA）被用來做對照，相關(guān)性通過Pearson相關(guān)系數(shù)來表示。

結(jié) 果

1.主動脈大體病變面積的計(jì)算

16月齡的家兔經(jīng)過28 w的高膽固醇飼料喂養(yǎng)即可形成嚴(yán)重的主動脈動脈粥樣硬化，此時的主動脈的病變較為多樣，通過Image J軟件將RGB圖像轉(zhuǎn)化為單通道的灰度圖像后，找出與背景色分離最好的綠色通道圖像進(jìn)行分析（圖1A）。軟件計(jì)算后可見經(jīng)過28 w的高膽固醇飼料喂養(yǎng)，家兔主動脈粥樣硬化病變面積達(dá)到60%以上，而主動脈弓病變面積可達(dá)90%（圖1B左）。通過IPP6.0進(jìn)行驗(yàn)證，可見兩種軟件計(jì)算結(jié)果非常相似（R≈0.998）。

圖1 使用Image J對主動脈大體病變面積進(jìn)行分析。A：將RGB圖像分離成單色圖像的步驟。B：主動脈動脈粥樣硬化大體病變面積（左）；兩個圖像軟件計(jì)算結(jié)果的相關(guān)性分析（右）。Fig.1 Quantification of the gross lesion by Image J.A：the steps of spliting the RGB image to monochromatic image.B：the areas of gross lesion in aorta，total and aortic arch respectively（left）；correlational analysis between results derived from two image softwares（right）.

2.對主動脈弓鏡下病變面積的計(jì)算

鏡下病變面積反映的是動脈粥樣硬化病變的厚度，可通過計(jì)算鏡下病變面積評估動脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度。在Image J軟件運(yùn)行下，以已知標(biāo)尺為基準(zhǔn)做直線進(jìn)行定標(biāo)，然后沿著病變外緣以及內(nèi)彈力板直接測量病變面積（圖2A、B）。在高膽固醇飼料誘導(dǎo)28 w后，可見家兔主動脈弓部的鏡下病變面積平均達(dá)到5 mm2以上，但這一階段的鏡下病變面積的差別也比較大（圖2C）。

圖2 使用Image J對主動脈弓部鏡下病變面積進(jìn)行分析。A：對EVG染色圖片進(jìn)行定標(biāo)×20；B：對鏡下病變進(jìn)行測算×20；標(biāo)尺＝2 mm。Fig.2 Quantification of microscopic lesions by Image J.A：To set scale in the image with EVG staining×20.B：To measure the area of microscopic lesions×20；Bar＝2 mm.

3.主動脈弓動脈粥樣硬化病變中細(xì)胞成分的計(jì)算

動脈粥樣硬化病變中細(xì)胞成分的改變?nèi)菀子绊懓邏K的穩(wěn)定性，因此我們也通過Image J軟件計(jì)算免疫組化的陽性面積來評估病變中細(xì)胞的成分。與分析主動脈大體病變面積相同，免疫組化圖像先通過Image J軟件分離成三個單色通道圖像，找出與背景顏色分離最好的綠色通道圖像進(jìn)行計(jì)算（圖3A）。通過計(jì)算可見，經(jīng)過28 w高膽固醇飼料誘導(dǎo)，家兔動脈粥樣硬化病變中巨噬細(xì)胞約占10%，而平滑肌細(xì)胞約占8%（圖3B）。

圖3 使用Image J對主動脈弓部病變中細(xì)胞成分進(jìn)行分析。A：將RGB免疫組化圖像分離成單色圖像的步驟×10。B：巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在主動脈弓病變中所占比例。Fig.3 Quantitative analysis of cellular components in lesions of aortic arch.A：the steps of splitting the RGB image of IHC to monochromatic image×10.B：the ratio of macrophages and smooth muscle cells in lesions of aortic arch.

4.冠狀動脈粥樣硬化病變的計(jì)算

普通家兔單純通過高膽固醇飼料誘導(dǎo)也可產(chǎn)生出冠脈動脈粥樣硬化病變，但是發(fā)生比率很低，因此本研究將心臟切成7個塊，有助于檢查發(fā)現(xiàn)病變（圖4A）。病變面積的計(jì)算方法和主動脈弓鏡下病變一致，通過EVG染色確定內(nèi)彈力板然后使用Image J計(jì)算面積（圖4B）。此外，冠狀動脈粥樣硬化病變中的細(xì)胞也能通過免疫組化染色進(jìn)行定量分析，方法和上述一致。

圖4 使用Image J對冠狀動脈粥樣硬化病變中進(jìn)行分析。A：家兔心臟被切成7塊進(jìn)行包埋。B：使用Image J測算冠脈動脈粥樣硬化病變×400。標(biāo)尺＝200μm。Fig.4 Quantitative analysis of coronary atherosclerotic lesions by Image J.A：the 7 blocks were made.B：coronary atherosclerotic lesion was quantified by Image J×400.Bar＝200μm.

討 論

目前很多基因缺陷或基因修飾模型動物的運(yùn)用，可以模擬出類似人類脂紋、纖維斑塊以及復(fù)雜病變的各種類型病變，并且這些病變的性質(zhì)也更加接近于人類［5］。評估這些模型動物病變程度最直接的辦法就是計(jì)算病變的大小和性質(zhì)，這也是檢測各類干預(yù)藥物對模型動物作用的最有效方法。然而，想要得到準(zhǔn)確的計(jì)算結(jié)果并不容易，需要三個步驟的協(xié)同完成［6］。第一，需要有高水平的病理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，這是對動脈粥樣硬化病變進(jìn)行分析的先決條件。第二，需要規(guī)范的圖像采集方法，在本研究中我們采用同一、無損和保證灰度范圍等采集方法，能夠得到高質(zhì)量的病理圖像。第三，需要準(zhǔn)確和全面的對圖像進(jìn)行分析。在本研究中，我們提出的分析方法不僅能涵蓋動脈粥樣硬化病變的面積和厚度兩個方面，也將病變中得細(xì)胞變化作為分析的對象。在本研究中，我們也使用Image J和另一款被廣泛使用商用圖像分析軟件IPP5.0做測量病變大體面積的比較，發(fā)現(xiàn)兩個軟件結(jié)果極其相似，如果忽略人為的測量差異，雖然這種比較不能說明Image J計(jì)算結(jié)果完全準(zhǔn)確，但反映出通過Image J可得到值得信賴的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在分析免疫組化染色圖像時，我們將彩色圖片轉(zhuǎn)為單色通道的灰度圖片，這樣能夠有效的將陽性染色和背景色分離，這使得對免疫組化的圖像分析更加準(zhǔn)確。主動脈弓切成10段的包埋法，也使得我們的分析結(jié)果對主動脈弓病變的大小和性質(zhì)評估更加全面。此外，我們也嘗試對家兔冠狀動脈粥樣硬化進(jìn)行分析，將家兔心臟切成7塊的方法可以使出現(xiàn)頻率較低的冠脈動脈粥樣硬化得以發(fā)現(xiàn)，對冠脈動脈粥樣硬化的分析也是對大動脈動脈粥樣硬化分析的極有價值的補(bǔ)充。由于本文中所有的分析都是基針對組織圖像展開的，所以需要一個功能強(qiáng)大的圖像分析軟件。Image J作為一款美國NIH在1997開發(fā)的跨平臺、開源和免費(fèi)的圖像軟件，經(jīng)過近20年的發(fā)展，已被世界各地研究者廣泛運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)圖像和視頻的分析，并且開發(fā)了400個以上的圖像分析插件，使其具有比別的商業(yè)圖像軟件更加強(qiáng)大的圖像分析功能［7］。

本文主要對圍繞動脈粥樣硬化病變圖像分析的部分軟件功能展開探討，基于Image J更為準(zhǔn)確和高效的分析方法還需要研究者進(jìn)一步探索，最終使得這款圖像分析軟件更好的為我國生物醫(yī)學(xué)研究服務(wù)。

在本研究中，我們提出了一套分析家兔動脈粥樣硬化病變圖像的方法，這套方法能夠較為準(zhǔn)確和全面的分析模型動物的動脈粥樣硬化病變。在實(shí)際運(yùn)用中，這套方法不僅簡單、實(shí)用，免費(fèi)和跨平臺的圖像分析軟件的應(yīng)用也降低了工作難度和研究成本，而且這套方法也可運(yùn)用于其他模型動物或臨床病人的相關(guān)病理圖像分析。

［1］Yu Q，Li Y，Waqar AB，et al.Temporal and quantitative analysis of atherosclerotic lesions in diet－induced hypercholesterolemic rabbits.J Biomed Biotechnol，2012，2012：506159

［2］Yu Q，Liu Z，Waqar AB，et al.Effects of antisense oligonucleotides against C－reactive protein on the development of atherosclerosis in WHHL rabbits.Mediators Inflamm，2014：979132.doi：10.1155／2014／979132

［3］Yu Q，Wang Y，Yu Y，et al.Expression of TRPV1 in rabbits and consuming hot pepper affects its body weight.Mol Biol Rep，2012，39（7）：7583－7589

［4］Blatt RJ，Clark AN，Courtney J，et al.Automated quantitative analysis of angiogenesis in the rat aorta model using Image－Pro Plus 4.1.Comput Methods Programs Biomed，2004，75（1）：75－79

［5］Gross DR.Animal models in cardiovascular research.Springer，2009

［6］Leong AS.Quantitation in immunohistology：fact or fiction？A discussion of variables that influence results.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2004，12（1）：1－7

［7］Schneider CA，Rasband WS，Eliceiri KW.NIH Image to Image J：25 years of image analysis.Nat Methods，2012，9（7）：671－675