梁 斌 袁 松 劉艷敏 宋旭紅

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室 廣東515041）

隨著生活方式的改變和老齡化進(jìn)程的加快，糖尿病的患病率急劇增加，而糖尿病心腦血管并發(fā)癥是糖尿病患者致死、致殘的重要原因。目前已證實(shí)，高血糖引起的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激是糖尿病慢性心血管并發(fā)癥的主要發(fā)病機(jī)制之一。

氧化應(yīng)激是指組織細(xì)胞在受各種有害因素刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)高活性分子如活性氧（ROS）和活性氮自由基（RNS）產(chǎn)生過(guò)多，超出細(xì)胞的清除能力導(dǎo)致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致潛在性損傷的病理過(guò)程。其中，NADPH氧化酶是細(xì)胞內(nèi)ROS生成的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者組織中NADPH氧化酶的亞基表達(dá)水平增加，與糖化血紅蛋白水平和糖尿病病程呈正相關(guān)［1，2］。Matsumoto等發(fā)現(xiàn)，噻唑烷二酮可以增加超氧化物歧化酶的活性，降低NADPH氧化酶的活性，緩解細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能［3］。

二甲雙胍是目前使用最廣的雙胍類口服降糖藥物，也是目前惟一有證據(jù)表明可以降低II型糖尿病患者心血管并發(fā)癥的降糖藥物，且心血管保護(hù)作用可能獨(dú)立于其降糖作用之外，能抑制動(dòng)脈粥樣硬化、心衰、心肌梗死等心血管病的發(fā)生和發(fā)展［4］。但其確切的心血管保護(hù)機(jī)制以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的影響仍不十分明確。本研究以高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠作為模型并用二甲雙胍進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)western blot、免疫組化和免疫熒光檢測(cè)，觀察二甲雙胍對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響，探討其在糖尿病病程中可能的心血管保護(hù)機(jī)制，為糖尿病臨床治療及預(yù)防提供理論依據(jù)及可能的解決方案。

材料和方法

1.材料及試劑

抗體：AMPKα、phospho－AMPKα（T172）抗體購(gòu)自Cell Signalling（Danvers，MA），p67phox抗體購(gòu)自GeneTex Inc.（Irvine，CA），p47phox抗體，3－NT （3－nitrotyrosine）抗體，MDA（malondialdehyde）抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA），4－HNE（4－h(huán)ydroxynonenal）抗體購(gòu)自 Cell Biolabs，Inc.（San Diego，CA）。 二 甲 雙 胍 （metformin）、鏈 脲 菌 素（Streptozotocin），MG132 購(gòu) 自 Sigma－Aldrich （St.Louis，MO），AICAR（5－Aminoimidazole－4－carboxamide 1－β－D－ribofuranoside） 購(gòu) 自 Toronto Research Chemicals Inc.（Toronto，Canada）。

2.方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株HAEC購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC），按細(xì)胞說(shuō)明書中指示，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基添加營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。高糖誘導(dǎo)處理采用高糖DMEM培養(yǎng)基（25 mmol／L）添加10%胎牛血清和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子培養(yǎng)。

2.2 Western blot

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分組誘導(dǎo)孵育后，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS－PAGE電泳分離蛋白樣品，電轉(zhuǎn)移至NC膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，用TBST稀釋一抗后，4℃孵育過(guò)夜。次日洗膜后二抗室溫孵育1 h，洗膜后ECL發(fā)光顯影，以β－actin作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，分析目標(biāo)條帶的表達(dá)變化。

2.3 免疫組化及免疫熒光檢測(cè)

組織切片經(jīng)二甲苯酒精脫臘、水化后，放入0.01 mol／L檸檬酸鈉緩沖溶液（p H6.0）在微波爐輕微沸騰并保持15 min，以修復(fù)抗原。BSA室溫封閉1 h后，一抗4℃孵育過(guò)夜。次日清洗后二抗室溫孵育1 h，清洗后DAB染色再封片觀察。免疫熒光檢測(cè)為細(xì)胞爬片經(jīng)4%甲醛固定及穿孔處理后，經(jīng)以上步驟（無(wú)需脫臘、水化、抗原修復(fù)）至一抗過(guò)夜后，清洗后再以熒光二抗室溫孵育1 h后清洗封片，上熒光顯微鏡觀察。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用±s表示，組間兩兩比較采用Student Newman Keul S（SNK）檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.高糖培養(yǎng)可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞HAEC中NADPH氧化酶亞基p47phox和p67phox表達(dá)上調(diào)

首先，人主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HAEC經(jīng)高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)后，Western blot檢測(cè)可見NADPH氧化酶的亞基p47phox蛋白和p67phox蛋白表達(dá)上調(diào)，且存在時(shí)間依賴性。其中，p47phox在培養(yǎng)2 h、p67phox在培養(yǎng)4 h后表達(dá)有明顯增加。

圖1 高糖誘導(dǎo)人主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間的NADPH氧化酶亞基p47phox和p67phox的表達(dá)。Fig.1 The time course of expression of NADPH oxidase subunit p47phox and p67phox induced by high glucose in human aortic endothelial cell（HAEC）.

2.二甲雙胍可激活A(yù)MPK并抑制內(nèi)皮細(xì)胞中NADPH氧化酶p47phox和p67phox亞基的表達(dá)

隨后，我們?cè)诟咛桥囵B(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞4 h后，分別加入AMPK激活劑AICAR（2 mmol／L）和二甲雙胍（1 mmol／L）共同培養(yǎng)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AICAR和二甲雙胍均可在培養(yǎng)2 h后激活A(yù)MPK。同時(shí)，隨著AMPK的激活，細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶亞基p47phox和p67phox的表達(dá)逐漸減少（圖2A和圖2B）。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果也顯示二甲雙胍可減少因高糖誘導(dǎo)的NADPH氧化酶亞基p47phox和p67phox的表達(dá)。本結(jié)果提示，二甲雙胍可通過(guò)激活A(yù)MPK抑制p47phox和p67phox的表達(dá)。

圖2 二甲雙胍對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞HAEC中 NADPH氧化酶p47phox和p67phox亞基的表達(dá)的影響。A.Western blot檢測(cè)AMPK激活劑AICAR對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞HAEC中NADPH氧化酶p47phox和p67phox亞基的表達(dá)的影響。B.Western blot檢測(cè)二甲雙胍對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞HAEC中NADPH氧化酶p47phox和p67phox亞基的表達(dá)的影響。C.免疫熒光檢測(cè)二甲雙胍對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞HAEC中NADPH氧化酶p47phox和p67phox亞基的表達(dá)的影響。紅色和綠色熒光分別指示相應(yīng)目的蛋白表達(dá)。Fig.2 The effects of metformin on expression of NADPH oxidase subunit p47phox and p67phox in human aortic endothelial cell（HAEC）.A.Western blot analysis shows the effects of AMPK activator AICAR on the expression of p47phox and p67phox in HAEC cell.B.Western blot analysis shows the effects of metformin on the expression of p47phox and p67phox in HAEC cell.C.Immunofluorescence analysis shows the effects of metformin on the expression of p47phox and p67phox in HAEC cell.The red and green fluorescent light indicate the expression of proteins respectively.

3.二甲雙胍可降低糖尿病小鼠模型主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中的氧化應(yīng)激水平

圖3 免疫組化檢測(cè)二甲雙胍對(duì)糖尿病小鼠模型主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。3－NT（3－nitrotyrosine），MDA（malondialdehyde）和HNE（4－h(huán)ydroxy－2－nonenal）為細(xì)胞氧化應(yīng)激過(guò)程中的標(biāo)志性氧化產(chǎn)物。圖中黑色實(shí)心箭頭示主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞。Fig.3 Immunohistochemistry analysis shows the effect of metformin on the oxidative stress in aortic endothelial cell from diabetic mice models.

最后，本研究以二甲雙胍干預(yù)的糖尿病模型小鼠來(lái)觀察其對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激水平的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型組小鼠消瘦，毛色雜亂無(wú)光澤，精神萎靡，行動(dòng)遲緩，反應(yīng)遲鈍，出現(xiàn)不同程度的多飲、多食、多尿癥狀。二甲雙胍干預(yù)的糖尿病模型組與未干預(yù)糖尿病模型組相比，小鼠多飲、多食、多尿、消瘦癥狀在治療后明顯減輕，血糖水平有明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），體質(zhì)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

以往研究發(fā)現(xiàn)，自由基與DNA、蛋白質(zhì)和脂類反應(yīng)后生成的氧化產(chǎn)物，可以作為反映自由基水平或者氧化應(yīng)激水平的標(biāo)志物［5－8］。經(jīng)以上的血糖和體重檢測(cè)證明二甲雙胍對(duì)模型高血糖的抑制作用后，我們通過(guò)免疫組化方法進(jìn)一步檢測(cè)了小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激標(biāo)志產(chǎn)物3－NT，MDA和4－HNE的表達(dá)。結(jié)果顯示，經(jīng)二甲雙胍干預(yù)的糖尿病模型小鼠其血管內(nèi)皮細(xì)胞中以上三種氧化應(yīng)激標(biāo)志物的水平均較未干預(yù)的模型小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中的水平明顯降低，顯示二甲雙胍可緩解糖尿病小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中的氧化應(yīng)激水平。

討 論

在糖尿病和胰島素抵抗的情況下，氧化應(yīng)激（oxidative stress）水平明顯增高，可能是糖尿病微血管病變和大血管病變的主要原因。隨著對(duì)氧化應(yīng)激機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)NAD（P）H 氧化酶是Ros生成的關(guān)鍵因素。近年研究發(fā)現(xiàn)，NAD（P）H氧化酶不僅存在于吞噬細(xì)胞，也廣泛存在于非吞噬細(xì)胞中，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。雖然該酶參與血管病變的機(jī)制目前還不完全明確，但研究已證明NAD（P）H氧化酶參與氧化應(yīng)激至少包括兩個(gè)環(huán)節(jié)：一是NAD（P）H氧化酶在各種因素作用下表達(dá)增加或活性增強(qiáng)，產(chǎn)生過(guò)多的活性氧；二是過(guò)多的活性氧通過(guò)各種細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)途徑引起氧化還原相關(guān)基因表達(dá)，參與血管壁構(gòu)成細(xì)胞的各種病理生理過(guò)程，如血管平滑肌增生，影響血管的舒縮功能，激活炎癥反應(yīng)等，從而引起各種心腦血管疾病的發(fā)生。因此，抗氧化治療可以減輕氧化應(yīng)激，從而阻止或延緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展，這也是現(xiàn)代臨床治療糖尿病相關(guān)并發(fā)癥尤其是心腦血管病變時(shí)，均以抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)為主要措施的原因。但一些研究結(jié)果表明，現(xiàn)有的抗氧化劑對(duì)糖尿病并發(fā)癥的預(yù)防和治療仍缺乏有效性。維生素類藥物如維生素C的抗氧化作用在體外實(shí)驗(yàn)中已得到證實(shí)，但臨床應(yīng)用的結(jié)果卻未得到流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)的支持［9］。因此，研究開發(fā)新的抗氧化藥物是當(dāng)前防治糖尿病的心血管并發(fā)癥的當(dāng)務(wù)之急。

近年來(lái)大量臨床和基礎(chǔ)研究均發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍具有降糖作用外的心血管保護(hù)作用。這種保護(hù)作用的具體機(jī)制仍不明確，可能通過(guò)降血脂，降血壓，改善IR等作用，減少心血管疾病的危險(xiǎn)因素，從而達(dá)到心血管保護(hù)作用［10，11］。體內(nèi)外研究均證實(shí)，二甲雙胍可增加內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）的磷酸化及其表達(dá)，從而增加血漿NO水平及降低全身血管阻力，起到改善內(nèi)皮功能的作用［12］。Gallo A等人研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可通過(guò)增加抗氧化酶的產(chǎn)生抑制高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞中AMPK激酶活性，抑制NADPH氧化酶的胞質(zhì)內(nèi)亞基p47phox和p67phox的表達(dá)，從而緩解細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明，與糖尿病模型組小鼠相比，小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激標(biāo)志性產(chǎn)物3－NT（3－nitrotyrosine），MDA（malondialdehyde）和 HNE（4－h(huán)ydroxy－2－nonenal）的表達(dá)均明顯降低，證明二甲雙胍具有確切的心血管保護(hù)作用，這種作用可能由于AMPK的激活緩解了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，從而減少血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。因此，本研究探討了二甲雙胍、氧化應(yīng)激與糖尿病心血管并發(fā)癥之間的相互關(guān)系，有助于進(jìn)一步深入了解糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，為糖尿病及其并發(fā)癥的治療及預(yù)防提供了一個(gè)新的方案。

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