胡明華 袁憲宇 吳長初 朱 喜

（1長沙醫(yī)學院人體解剖學和組織胚胎學教研室，長沙410219；2中南大學湘雅三醫(yī)院健康管理科，長沙410013）

CD34是人體內(nèi)一種常見的高糖基化分子，其分子表面存在許多糖修飾表位，根據(jù)糖修飾表位的不同［1］，CD34被分成I型、Ⅱ型、Ⅲ型。CD34在臨床上已經(jīng)被證實為造血干細胞的特異性標志物，同時，CD34還在許多成體干細胞中表達。CD34可參與細胞與細胞、細胞與基質(zhì)之間的粘連，具有不同的生物學功能及生物學結構活性，可廣泛分布在大多數(shù)白細胞、紅細胞、成纖維細胞、上皮細胞、角質(zhì)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞中。表皮組織具有強大的修復能力，主要是由于表皮干細胞的作用，但由于表皮干細胞缺乏特異性的CD分子標志物［2］，因此，尋找一種與表皮干細胞密切相關的標志物則十分重要。本研究采用組織學觀察法、雙免疫標記法、流式細胞術檢測人包皮、頭皮和軀干皮膚來源的組織標本中CD34蛋白表達，探討CD34蛋白作為表皮干細胞的標志物的可行性。

材料和方法

1.材料

分別選取2013年1月至2014年1月在我院泌尿外科進行包皮環(huán)切術患者包皮組織標本60份，其中20份供者年齡＜20歲，20份供者年齡20－40歲，20份供者年齡40歲以上。選取同時期健康者頭皮和軀干皮膚來源的組織標本各60份，頭皮組織和軀干皮膚均來源于自愿者，均簽署知情同意書。

2.方法

2.1 CD34免疫組織化學

組織標本均制成1 cm×0.5 cm的皮片，在4%多聚甲醛中進行固定，過夜后對組織進行梯度脫水，再用石蠟包埋，切片，厚度為5μm。首先將石蠟切片浸于一抗（CD34∶1∶50）中孵育，4℃過夜，使用PBS進行漂洗，室溫平衡20 min，加入酶標抗兔／鼠聚合物孵育，室溫30 min，DAB顯色，蘇木素進行復染，乙醇進行梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在普通光學顯微鏡進行觀察。采用SP法測定組織細胞中CD34，兔抗人CD33單克隆抗體有北京金橋生物公司提供?？瞻讓φ眨菏褂肞BS代替一抗作陰性對照，結果提示陰性；使用己知陽性切片作陽性對照，結果提示陽性，其他步驟與實驗標本相同。結果觀察：CD34組織著色棕色為陽性。

2.2 免疫雙標記

體外分離培養(yǎng)包皮基底層細胞，分別在原代，3代，6代時，進行免疫熒光雙標記染色檢測。細胞經(jīng)PBS漂洗，將培養(yǎng)基成分充分去除，加入4%中性多聚甲醛固定20 min；PBS充分漂洗，10%正常山羊血清進行封閉，后加入一抗（CD34各表位BI.3C5，QBend，581，B，整合素，p63），4℃孵育過夜，PBS漂洗，加入anti.Mouse IgG／Dy Light488（1：200），anti.Rabbit IgG／Dy Light594，室溫下孵育2 d；PBS漂洗，熒光顯微鏡下觀察各蛋白的表達情況。

2.3 流式細胞術

皮膚組織修整為l cm×0.5 cm大小的皮片。并按照上述分離富集表皮基底層細胞的方法獲取表皮基底層細胞。獲得細胞分別與CD34的三種表型p63或者β1整合素進行孵育，含BSA的PBS漂洗后，加入FITC.conjugated goat anti.mouseIgG（BD Pharmingen）作為二抗。用PBS溶液代替一抗，其他步驟相同作為空白對照。經(jīng)流氏檢測，記錄各表位的陽性率。

3.統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS19.0軟件處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用方差分析，計數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.CD34蛋白的表達

CD34蛋白在人包皮和頭皮的表皮基底層細胞中有表達，而在人軀干皮膚的表皮中無表達。并且，在同一組織內(nèi)，不同表位的CD34蛋白的表達也不均衡。Ⅰ型表位CD34蛋白的分布比Ⅱ、Ⅲ型表位CD34蛋白更加廣泛（圖1）。A1提示CD34主要表達在頭皮及包皮的表皮基底層細胞，A2提示在軀干皮表皮中未發(fā)現(xiàn)CD34各表位的表達。細胞的子細胞CD34陽性的細胞在表皮中的分布與表皮干細胞的分布基本相同，均主要在表皮突的底部。

圖1 CD34各表位在頭皮、包皮、軀干皮的分布情況。標尺＝50μmFig.1 CD34 epitope distribution in each scalp，foreskin，the skin of the trunk.Bar＝50μm

2.CD34陽性細胞與ESCs特征性標記表達情況

利用β1整合素或是p63對分離的基底層細胞進行分選能夠獲得ESCs，CD34陽性細胞同時表達p63或者β1整合素，并且CD34三種表位在體外培養(yǎng)的細胞中的表達隨著細胞傳代而減少。CD34陽性細胞、p63、β1整合素在原代及3代細胞中均存在表達，且與傳代陽性數(shù)目呈負相關性。

3.不同年齡CD34的表達情況

CD34I型表位陽性表達率均明顯高于II型和III型（P＜0.05），不同年齡組的CD34各表位之間比較，陽性率無明顯差異（P＞0.05，表1）。

表1 流式細胞術檢測不同年齡CD34不同表位的表達（±s）Table 1 FCM different ages different epitopes CD34 expression（±s）

表1 流式細胞術檢測不同年齡CD34不同表位的表達（±s）Table 1 FCM different ages different epitopes CD34 expression（±s）

年齡（歲）Age（years）例數(shù)Cases CD34表位（CD34 epitope）Ⅰ型（Ⅰtype） Ⅱ型（Ⅱtype） Ⅲ型（Ⅲtype）＜20 20 35.04±2.41 8.92±0.30 20.63±1.12 20－40 20 35.49±2.67 9.27±0.90 20.48±0.81＞40 20 35.39±2.01 9.32±1.24 20.68±1.12

討 論

ESCs（胚胎干細胞）是皮膚自我修復及自我更新的關鍵，部分潛在的ESCs標記可分離ESCs與角質(zhì)細胞。部分研究顯示，ESCs重點分布在表皮突的深嵴部，CD34各個表位的陽性細胞同時也分布于表皮突的底部，分布于嵴間的略可見少許散在表達的CD34細胞，因此，在表皮分布區(qū)，可見到分布特征類似的ESCs與CD34。選用CD34蛋白作為篩選ESCs的潛在表面標記具有以下幾種優(yōu)點：一是皮膚可以不斷的進行自我更新；二是ESCs的數(shù)量不會隨著年齡的增長而減少；三是ESCs在環(huán)境刺激又到下發(fā)生轉分化的能力不會隨著年齡的增長而變?nèi)酢?/p>

表皮干細胞主要存在于表皮細胞的表皮突底部，在皮膚受到損傷時，能夠起到重要的自我修復作用［4］。而在研究中發(fā)現(xiàn)［5］，表皮干細胞的表面無特異性的CD分子標志物，傳統(tǒng)的研究中，主要使用β1整合素以及p63作為表皮干細胞的分選標記［7］。

實驗發(fā)現(xiàn)，表皮細胞中的CD34陽性細胞存在于表皮的表皮突底部，與表皮干細胞的分布十分相似。研究發(fā)現(xiàn)［8］，CD34陽性細胞同時存在β1整合素和p63的表達，因此，CD34陽性細胞有可能作為表皮干細胞分選的標志物。但CD34陽性細胞僅存在在于頭皮和包皮的基底層細胞中，而在軀干皮的基底層細胞中無表達，因此，其僅可能用于分選頭皮和包皮的表皮干細胞。實驗發(fā)現(xiàn)，CD34蛋白在表皮內(nèi)的含量并不會隨著年齡的增長而減少，作為分選表皮干細胞的標志物，CD34蛋白更加穩(wěn)定。在頭皮和包皮的表皮干細胞分選中，CD34蛋白是更加理想的分選標志物。

但在某些實驗室進行的CD34檢測實驗中，檢測結果存在嚴重差異，整合以往的資料，存在此種現(xiàn)象的原因可能分別以下幾種：（1）早期的實驗只進行單一的Ⅱ型表位檢測，因此在同時進行CD34的多種表位，可以更加清晰的表述CD34的表達狀態(tài)；（2）檢測部位的不同可能導致結論不同；（3）不同的實驗室可能采取的實驗方法存在差異，因此導致實驗結果的差異。針對上述情況，試驗中我們選取了不同解剖部位的皮膚進行CD34表位的表達情況的研究，可以找出早期實驗中存在差異結果的原因。

綜上所述，CD34陽性分子與表皮干細胞在頭皮和包皮的表皮基底層細胞中有十分相似的分布，可以作為頭皮和包皮中表皮干細胞分選的標志物，但其還需要不斷深入的研究，同時，ESCs具備多向分化的能力，且其自身多潛能的能力仍然在不斷發(fā)展，因此，在未來的研究中，ESCs將會更多的應用于臨床與動物疾病模型中。

［1］牛云飛，路衛(wèi)，夏照帆等.表皮干細胞在人體不同部位皮膚的分布差異.第二軍醫(yī)大學學報，2004，25（9）：959－961

［2］Aniket S.Wadajkar；Sonia Santimano；Liping Tang，et al.Magnetic－based multi－layer microparticles for endothelial progenitor cell isolation，enrichment，and detachment.Biomaterials，2014，35（2）：654－663

［3］劉愛軍，黃錦桃，李海標.胚胎干細胞源性表皮干細胞對小鼠全層皮膚缺損的修復.解剖學報，2007，38（3）：296－299

［4］Jiang S，Zhao L，Purandare B，et al.Differential expression ofstem cell markers in human fo licular bulge and interfollicular epidermal compartments.Histochem Cell Biol，2010，133（4）：455－465

［5］Kai－Hong J，Jun X，Kai－Meng H，et al.P63 expression pattern during rat epidermis morphogenesis and the role of p63 as a marker for epidermal stem cells.J Cutan Pathol，2007，34（6）：154－159

［6］林吉茂，卿素珠，成醒民等.山羊胚胎皮膚的發(fā)育及β1整合素在發(fā)育中的表達.中國組織工程研究與臨床康復，2007，2（37）：7337－7340

［7］黃培信，劉德伍，王肖蓉等.不同發(fā)育階段人皮膚表皮干細胞增殖分化相關基因的表達特征.中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（23）：4442－4446