陳清泉 房光萃 曾 彧 楊秀霖 陳開杰 陳 敏＊

（1福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，福州350004；2廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院，漳州36000）

心肌炎（Myocarditis）是指各種病因引起的心肌肌層局限性或彌漫性的炎性病變，以病毒感染引起的急性心肌炎最常見，部分轉(zhuǎn)為自身免疫性心肌炎，后期可發(fā)展至擴(kuò)張型心肌?。―ilated Cardiomyopathy，DCM）。DCM患者預(yù)后差，至今無(wú)特效的治療手段，在出現(xiàn)充血性心力衰竭的臨床表現(xiàn)后病死率高［1］。因此，如何有效控制心肌炎發(fā)展，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)急待解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)自身免疫反應(yīng)在心肌炎向擴(kuò)張型心肌病發(fā)展過程中起著重要的作用，這與輔助性T細(xì)胞異?；罨嘘P(guān)，并與慢性心肌炎和心肌纖維化的發(fā)生相關(guān)［2－4］。以往認(rèn)為，心肌的炎癥損傷機(jī)制是由IFN－γ介導(dǎo)的Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)過強(qiáng)所致，近來發(fā)現(xiàn)Th17／Treg細(xì)胞平衡對(duì)于控制自身免疫反應(yīng)的發(fā)展起關(guān)鍵作用。Th17細(xì)胞屬于CD4＋T輔助細(xì)胞亞群，其所分泌的IL－17是一種重要的促炎因子，與多種細(xì)胞因子產(chǎn)生協(xié)同作用以放大炎癥反應(yīng)［5，6］。視黃酸相關(guān)孤兒受體 （retinoic acid－related orphan receptor，RORγt），是調(diào)控Th17細(xì)胞分化發(fā)育的特異性轉(zhuǎn)錄因子。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)免疫作用的T淋巴細(xì)胞亞群，表達(dá)具有特異性調(diào)節(jié)作用的叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子（foxhead box protein 3，F(xiàn)oxp3），活化后主要分泌IL－10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming growth factor－β，TGF－β），抑制免疫細(xì)胞活化，從而抑制自身免疫反應(yīng)［7，8］。有研究報(bào)道，Treg細(xì)胞數(shù)量減少、Th17／Treg細(xì)胞失衡與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無(wú)力等多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［9，10］，但在自身免疫性心肌炎中Th17／Treg細(xì)胞分化的規(guī)律及其作用尚未清楚。本文通過實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎（Experimental Autoimmune Myocarditis，EAM）小鼠模型，研究EAM小鼠心肌組織中Th17及Treg細(xì)胞相關(guān)的RORγt、Foxp3、IL－17和TGF－βm RNA表達(dá)水平，以及血清IL－17和TGF－β的變化，分析Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞相關(guān)因子在EAM小鼠心肌組織中的變化規(guī)律，為尋找自身免疫性心肌炎的免疫治療方法提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只11－12周雄性健康SPF級(jí)Balb／C小鼠（許可證號(hào)：SCXK（滬）2012－0002），體質(zhì)量18－22 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。飼養(yǎng)條件：室溫20－25℃；空氣流通，相對(duì)濕度40%－70%；動(dòng)物自由攝食和飲水。

2.方法

2.1 EAM模型建立

參考Toyozaki等［11］的方法，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為EAM組與正常對(duì)照兩大組。EAM組小鼠18只：第0 d和第7 d，于小鼠左右側(cè)腹股溝、腋下等部位多點(diǎn)皮下注射心肌肌球蛋白（Sigma公司）和弗氏完全佐劑混合乳0.2 ml（含心肌肌球蛋白0.1 mg）；正常對(duì)照組18只：同劑量PBS代替心肌肌球蛋白。初次免疫后于7、21、56 d實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組隨機(jī)抽取6只小鼠，眼眶采血后處死小鼠迅速取出心臟HE染色和PCR檢測(cè)。

2.2 HE染色

組織切片常規(guī)脫蠟至水化，將脫蠟干凈的切片浸入蘇木素液5 min；自來水沖洗后，1%鹽酸酒精分化15 s，自來水沖洗至細(xì)胞核藍(lán)色，結(jié)締組織無(wú)色；入蒸餾水5 min；甩干水分，浸入1%酒精伊紅染色液染色3 min；浸入70%酒精快速清洗，之后梯度乙醇浸洗脫水，再經(jīng)過二甲苯使切片透明，將染色完成的切片從二甲苯中取出，滴上中性樹膠，蓋上蓋玻片，鏡檢。

2.3 RT－PCR 檢 測(cè) IL－17、RORγt、Foxp3 和TGF－βm RNA 表達(dá)

利用Trizol一步法提取心臟組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以2μl cDNA為模板，應(yīng)用上下游引物行PCR擴(kuò)增。95℃預(yù)變性5 min；執(zhí)行35個(gè)循環(huán)：94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸60 s，最后72℃總延伸10 min。取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，染色，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，目的基因mRNA表達(dá)量＝目的基因DNA條帶／β－actin DNA條帶灰度值。引物序列詳見表1。

表1 RT－PCR引物序列Table 1

2.4 ELISA 檢測(cè)IL－17和 TGF－β

眼眶取血滴于1.5 ml EP管中，室溫靜置30 min，3000 r／min離心15 min，取上層血清。按照IL－17和TGF－β的ELISA試劑盒（R＆D公司）說明書進(jìn)行檢測(cè)。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。各組之間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student－Newman－Keuls檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組心肌組織病理學(xué)變化

正常對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間隙正常（圖A），EAM組小鼠出現(xiàn)不同程度的病理改變，7 d組小鼠心肌細(xì)胞腫脹，相鄰細(xì)胞間隙增大，排列紊亂（圖B），21 d組心外膜下及心肌間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肌纖維排列紊亂，核大深染、異型（圖C），56 d組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，部分心肌細(xì)胞斷裂，纖維增生 （圖D）。以上病理學(xué)變化表明EAM模型建立成功。

圖1 心肌組織病理變化（HE染色×200）A：對(duì)照組，B：EAM 7 d組，C：EAM 21 d組，D：EAM 56 d組 （HE×200）Fig.1 The pathology changes of the myocardial tissue in each group（HE×200）A：Normal group；B：Experimental group 7 d；C：Experimental group 21 d；D：Experimental group 56 d.

2.各 組 心 肌 組 織 IL－17、RORγt、Foxp3 和TGF－βm RNA的表達(dá)水平

EAM 21 d組心肌組織IL－17、RORγt、Foxp3、TGF－βm RNA的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；EAM 7 d組、56 d組表達(dá)量與正常對(duì)照組的差異無(wú)顯著性意義（P＞0.05），但低于EAM 21 d組 （P＜0.05）；對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)之間比較無(wú)差異（P＞0.05）（圖2）。

圖2 各組心肌組織IL－17、RORγt、Foxp3和TGF－βmRNA的表達(dá)水平a P＜0.01 vs對(duì)照組；b P＜0.05 vs EAM 7 d組和56 d組Fig.2 the expression of the mRNA of IL－17，RORγt，F(xiàn)oxp3and TGF－βin cardial tissue of each group tested by RT－PCRa P＜0.01 compared with normal group；b P＜0.05compared with EAM group 7 d and 56 d

3.各組血清IL－17和TGF－β濃度變化

圖3顯示，EAM 21 d組外周血IL－17水平明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01），也高于EAM 7 d組和56 d組 （P＜0.05），EAM 21 d和56 d組血清TGF－β水平較正常對(duì)照組升高 （P＜0.05），EAM 7 d組血清IL－17和TGF－β水平與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IL－17、TGF－β含量變化a P＜0.05 vs對(duì)照組；c P＜0.05 vs EAM 7 d組和56 d組；e P＜0.05 vsEAM 7 d組Fig.3 The level of IL－17 and TGF－βin mice peripheral blood serum tested by ELISAa P＜0.05 compared with normal group 21 d；c P＜0.05 compared with EAM group 7 d and 56 d；e P＜0.05 compared with EAM group 7 d

4.心肌組織RORγt／Foxp3 mRNA相對(duì)表達(dá)量

EAM 21 d組與56 d組RORγt／Foxp3 m RNA比值較正常對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）（圖4）。

圖4 各組小鼠RORγt／Foxp3 mRNA相對(duì)表達(dá)量＊P＜0.05 vs對(duì)照組和EAM 7 d組Fig.4 Expression of RORγt／Foxp3 m RNA in myocardial tissue of each group＊P＜0.05 compared with normal group and EAM group 7 d

討 論

心肌炎是心肌自身的炎癥病變，急性期多見于病毒感染等因素侵犯心肌引起直接損傷，后期可繼發(fā)針對(duì)心肌肌球蛋白的免疫應(yīng)答，造成進(jìn)一步心肌損傷。其病理過程與實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎發(fā)生機(jī)制和結(jié)局有較多的共性，與多種T細(xì)胞異常活化介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)有關(guān)，其中促炎性Th17細(xì)胞與抑制性Treg細(xì)胞之間平衡狀態(tài)的打破與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)［12－13］，是自身免疫性疾病持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。

本文發(fā)現(xiàn)，在EAM組心肌組織炎癥初期，IL－17 mRNA表達(dá)量升高，21 d組達(dá)到高峰水平。同時(shí)外周血中IL－17含量與心肌組織RORγt mRNA呈現(xiàn)類似變化。RORγt是控制Th17細(xì)胞活化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［14］，其在EAM炎癥過程中的高表達(dá)，促進(jìn)初始CD4＋T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，分泌IL－17。IL－17作為重要的炎癥介質(zhì)，通過強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞及激活其他免疫細(xì)胞，促進(jìn)多種細(xì)胞釋放下游炎性因子［5，6］，導(dǎo)致心肌炎癥損傷甚至壞死。Alunno［15］認(rèn)為，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中Th17細(xì)胞發(fā)揮了主要的致炎作用，而Treg細(xì)胞功能下降，導(dǎo)致自身免疫性疾病進(jìn)入慢性階段。說明Th17細(xì)胞功能亢進(jìn)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病等的發(fā)生與發(fā)展。

Treg細(xì)胞是一群具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，通過分泌TGF－β和IL－10兩類抑制性細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞和部分效應(yīng)性T細(xì)胞活化和增殖，減輕炎癥反應(yīng)。Foxp3為Treg細(xì)胞發(fā)育過程中的核心轉(zhuǎn)錄因子［7］，可調(diào)控初始T細(xì)胞向Treg轉(zhuǎn)化。Zhang等［8］發(fā)現(xiàn)注射Treg細(xì)胞明顯減輕病毒性心肌炎急性期的炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)心肌組織，改善心臟功能的作用。本文結(jié)果顯示EAM 21 d組心肌組織TGF－β和Foxp3 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，血清TGF－β含量也顯著升高。TGF－β具有多重功能，在不同情況下可表現(xiàn)抗炎與促炎的不同作用。在高濃度的TGF－β與IL－6共同誘導(dǎo)作用下，初始CD4＋T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，而TGF－β單獨(dú)作用可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化。因此推測(cè)EAM 21 d組TGF－β升高對(duì)Th17細(xì)胞分化產(chǎn)生促進(jìn)作用，使得心肌炎癥反應(yīng)在同一時(shí)期達(dá)到高峰。EAM 56 d組Treg細(xì)胞表達(dá)降低，發(fā)揮免疫抑制作用的細(xì)胞數(shù)減少，不能有效控制自身反應(yīng)性T細(xì)胞激活，導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)的持續(xù)存在。提示在心肌炎癥階段存在Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子失衡狀態(tài)。抑制Th17分化或增強(qiáng)Treg功能，調(diào)節(jié)Th17／Treg細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡將有助于減輕心肌組織炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎與Th17相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子的高表達(dá)密切相關(guān)，研究Th17／Treg細(xì)胞分化在自身免疫性心肌炎發(fā)生發(fā)展的作用，有助于進(jìn)一步闡明自身免疫性心肌炎的發(fā)病機(jī)制，為尋找有效的心肌炎免疫治療方法提供新思路。

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