姜潤學，胡萬寧，孫國貴，李 軍，韓曉晨，蔡海峰

1．河北聯(lián)合大學附屬唐山市人民醫(yī)院頭頸外科，河北 唐山063000；

2．河北聯(lián)合大學附屬唐山市人民醫(yī)院放化療科，河北 唐山063000

BTG1對喉癌細胞增殖和凋亡的影響及其機制研究

姜潤學1，胡萬寧1，孫國貴2，李 軍1，韓曉晨1，蔡海峰1

1．河北聯(lián)合大學附屬唐山市人民醫(yī)院頭頸外科，河北 唐山063000；

2．河北聯(lián)合大學附屬唐山市人民醫(yī)院放化療科，河北 唐山063000

背景與目的：在多種細胞中B細胞易位基因1(B-cell translocation gene 1，BTG1)能夠抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，調(diào)節(jié)細胞周期進程及分化。該研究通過體外實驗探討B(tài)TG1高表達對喉癌Hep-2細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響及其相關作用機制。方法：構建pEGFP-N1-BTG1，培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細胞，分為實驗組(轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-BTG1的Hep-2細胞)和對照組(轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空質(zhì)粒的Hep-2細胞)。采用蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測兩組細胞中BTG1蛋白的表達水平；應用MTT法檢測細胞的增值活性；使用流式細胞術檢測細胞周期分布和磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin Ⅴ-FITC/PI)檢測細胞凋亡；采用Western blot法檢測細胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1、凋亡相關蛋白Bcl-2表達情況。結果：成功構建pEGFP-N1-BTG1，Western blot檢測結果顯示，實驗組細胞中BTG1蛋白表達水平明顯高于對照組細胞(0.921±0.091 vs 0.308±0.047，P<0.05)。實驗組與對照組細胞相比，從第24 h實驗組細胞生長速度減慢，細胞增值能力降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組細胞中Cyclin D1蛋白表達水平下降(0.436±0.023 vs 0.916±0.092，P<0.05)，細胞周期的G0/G1期細胞比例升高［(85.1±5.2)% vs (63.8±3.1)%，P<0.05)］；S期細胞比例降低［(8.3±1.1)% vs (23.1±1.5)%，P<0.05］；實驗組細胞Annexin Ⅴ增多，細胞早期凋亡率升高［(10.3±1.1)% vs (2.8±0.3)%，P<0.05］，抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平降低(0.167±0.009 vs 0.834±0.084，P<0.05)。結論：BTG1高表達能明顯抑制喉癌Hep-2細胞的生長增殖、誘導凋亡，其可能的機制與BTG1參與細胞周期調(diào)控、誘導細胞凋亡相關。

喉癌；BTG1；增殖；凋亡；細胞周期

B細胞易位基因1(B-cell translocation gene 1, BTG1) 在許多腫瘤組織中表達水平低下，但在體外實驗中使其過量表達時則表現(xiàn)為腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力降低，凋亡增加［1-3］。因此，其可能是一種新型的抑癌基因并已受到廣泛關注。喉癌是一種頭頸部常見的預后較差的惡性腫瘤。本研究試圖通過對喉癌Hep-2細胞株轉(zhuǎn)染BTG1基因，以探討該基因的高表達在體外對喉癌細胞增殖、凋亡的影響，以期為探討喉癌治療的新途徑提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

人喉癌上皮細胞Hep-2購自上海拜力生物科技有限公司，質(zhì)粒pEGFP-N1、XhoⅠ內(nèi)切酶、KpnⅠ內(nèi)切酶、T4連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司，質(zhì)粒pDonR223-BTG1購自長沙愛科博生物科技有限公司，LipofectamineTM2000、DH5a感受態(tài)細胞購自美國Invitrogen公司，鼠抗人BTG1單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、鼠抗人CyclinD1單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化酶標記的二抗(山羊抗鼠)購自北京中杉金橋生物技術有限公司，ECL發(fā)光試劑購自上海碧云天生物技術有限公司，高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，10%胎牛血清購自HyClone公司，DMEM完全培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京賽馳生物科技有限公司，PVDF膜購自Millipore公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡試劑盒、MTT購自美國Sigma公司生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的 DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%飽和濕度的培養(yǎng)箱中；每周傳代2次，用0.25%胰酶消化細胞。

1.2.2 pEGFP-N1-BTG1構建與鑒定

根據(jù)人BTG1 cDNA序列(NM_001731)設計B T G 1基因擴增引物，序列如下： 5’-CGCCTCGAGATGCATCCCTTCTAC-3’(上游)和5’-CGCGGTACCTCA CCTGATACAGT CATC-3’(下游)。上游引物包含XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點，下游引物包含KpnⅠ限制性內(nèi)切酶位點。引物由南京金斯瑞基因科技有限公司合成。PCR反應體系：10×PCR緩沖液5 μL，引物順義鏈1 μL，引物反義鏈1 μL，dNTPs(10 mmol/L) 1 μL，pDonR223-BTG1 2 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 39.5 μL，共計50 μL。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應結束后進行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，然后對目的片段進行回收。對回收后的片段以及pEGFP-N1載體進行XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切反應，反應體系：BTG1 36 μL，XhoⅠ2 μL，KpnⅠ 2 μL，10×緩沖液H 5 μL，ddH2O 5 μL，總共50 μL。pEGFP-N1 6 μL，XhoⅠ 1 μL，KpnⅠ 1 μL，10×緩沖液H 2 μL，ddH2O 10 μL，共20 μL。對以上酶切體系放置37 ℃水浴反應4 h后，進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后回收目的片段。并進行連接反應：BTG1酶切產(chǎn)物3.0 μL，pEGFP-N1 1.0 μL，10×T4連接酶緩沖液2.0 μL，T4連接酶1.0 μL，ddH2O 13.0 μL，混勻，16 ℃反應過夜。之后轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細胞中。挑取陽性克隆進行質(zhì)粒提取備用，并將陽性克隆送交美國Invitrogen公司進行DNA序列測定。

1.2.3 Hep-2細胞株的瞬時轉(zhuǎn)染

Hep-2細胞分成兩組分別轉(zhuǎn)染pEGFPN 1-B T G 1和p E G F P-N 1空質(zhì)粒。采用LipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染試劑按其說明嚴格進行操作。

1.2.4 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測轉(zhuǎn)染后兩組細胞BTG1蛋白及兩組細胞中Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達情況

用IP裂解液分別提取兩組細胞的蛋白質(zhì)，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。每孔上樣量為50 μg行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)，穩(wěn)壓冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入一抗(1∶500的BTG1抗體)，4 ℃搖床過夜，加入二抗(以辣根過氧化酶HRP 標記)，室溫溫育2 h，雜交膜以ECL化學發(fā)光試劑在暗室中顯影并曝光，以β-actin作為內(nèi)參。Western blot法檢測Cyclin D1、Bcl-2蛋白，一抗分別為Cyclin D1、Bcl-2抗體，具體操作步驟同前。

1.2.5 MTT實驗檢測高表達BTG1體外對喉癌Hep-2細胞增殖的影響

取對數(shù)生長期的兩組細胞胰酶消化并制成等濃度分別加于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔內(nèi)加5 000個細胞，分別培養(yǎng)24、48、72和96 h，結束培養(yǎng)4 h前每孔加MTT溶液［5 mg/mL用PBS (pH<7.4)］20 μL在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)，到達時間后結束培養(yǎng)，棄去上清液，在每孔中加入異丙醇150 μL，搖蕩10 min待結晶溶解后在酶標儀上測定490 nm波長的各孔光密度(D)值，以時間為橫坐標、D值為縱坐標，將記錄的結果繪制細胞生長曲線。

1.2.6 磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測細胞凋亡

取轉(zhuǎn)染48 h后的兩組細胞胰酶消化，懸浮細胞(1×106個)用PBS洗2次，加入100 μL結合緩沖液和FITC標記的Annexin Ⅴ(20 μg/mL)10 μL，室溫避光放置30 min，再加入PI(50 μg/mL)5 μL，避光反應5 min后，加入400 μL結合緩沖液，立即用流式細胞儀檢測。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞周期

取轉(zhuǎn)染48 h后的兩組細胞胰酶消化，離心去除上清液，用預冷的PBS液洗細胞2次，預冷70%乙醇，-20 ℃固定保存24 h。離心(800 r/min)固定的細胞5 min，去除乙醇，收集細胞，以1 mL的PBS洗細胞1次，加入500 μL PBS含50 μg/mL碘化丙啶(PI)，100 μg/mL RNase A，4 ℃避光溫育20 min。用流式細胞儀按照標準程序進行檢測，汞激發(fā)波長488 nm，計數(shù)10 000個細胞，結果用MultiCycle軟件分析，分別計算G0/ G1期、S期和G2/M期細胞的相對比例。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BTG1構成的鑒定

將pEGFP-N1-BTG1重組質(zhì)粒進行XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切反應，酶切后的產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析，如圖1雙酶切電泳圖譜顯示516 bp(BTG1序列大小)和4.7 kb(pEGFP-N1序列大小)的目的條帶。

圖1 雙酶切電泳圖Fig. 1 Electrophoresis pattern of double enzyme

該質(zhì)粒行DNA序列測定顯示與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的人類B T G 1基因序列(NM_001731)一致，表明BTG1 cDNA已經(jīng)成功克隆至pEGFP-N1載體。測序結果如下：ATGCATCCCTTCTACACCCGGGCCGCCACCA TGATAGGCGAGATCGCCGCCGCCGTGTCCT TCATCTCCAAGTTTCTCCGCACCAAGGGGC TCACGAGCGAGCGACAGCTGCAGACCTTCA GCCAGAGCCTGCAGGAGCTGCTGGCAGAA CATTATAAACATCACTGGTTCCCAGAAAAGC CATGCAAGGGATCGGGTTACCGTTG TATTCGCATCAACCATAAAATGGATCCTCTG ATTGGACAGGCAGCACAGCGGATTGG ACTGAGCAGTCAGGAGCTGTTCAGG CTTCTCCCAAGTGAACTCACACTCTGGGTT GACCCCTATGAAGTGTCCTACAGAATTGGA GAGGATGGCTCCATCTGTGTGCTGTATGA AGCCTCACCAGCAGGAGGTAGCACTCAAAA CAGCACCAACGTGCAAATGGTAGACA GCCGAATCAGCTGTAAGGAGGAACTTCTCT TGGGCAGAACGAGCCCTTCCAAAAACTA CAATATGATGACTGTATCAGGTTAA。

2.2 Hep-2細胞株中BTG1蛋白表達鑒定

采用Western blot法檢測兩組細胞中BTG1蛋白表達水平，從圖2中可以看出，轉(zhuǎn)染BTG1的實驗組細胞中BTG1蛋白表達水平明顯高于未轉(zhuǎn)染BTG1的對照組Hep-2細胞(0.921±0.091 vs 0.308±0.047，P<0.05)。從實驗結果可以清楚地看到，BTG1基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染進入喉癌Hep-2細胞中，而且可以使轉(zhuǎn)染細胞BTG1蛋白表達得到明顯提高。

2.3 MTT實驗檢測BTG1體外對喉癌Hep-2細胞生長的影響

經(jīng)MTT實驗檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組細胞相比較，從第24 h實驗組細胞生長即明顯降低，相對增值能力下降，D值明顯降低。各個時間點兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。本實驗結果表明，提高BTG1表達對喉癌Hep-2細胞生長具有明顯的抑制作用。

圖2 Western blot鑒定BTG1蛋白的表達Fig. 2 Identification of the expression of BTG1 protein by Western blot

圖3 BTG1高表達對細胞增殖的影響Fig. 3 The effects of BTG1 overexpression on the cell proliferation

2.4 BTG1對喉癌Hep-2細胞凋亡的影響

采用Annexin Ⅴ分析法檢測結果顯示，實驗組細胞中早期凋亡率為(10.3±1.1)%，而對照組細胞早期凋亡率為(2.8±0.3)% 。兩者比較，實驗組早期凋亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4A、B)。

2.5 BTG1對喉癌Hep-2細胞周期的影響

應用流式細胞儀分析兩組細胞周期分布顯示，實驗組中，G0/G1期細胞所占比例明顯高于對照組細胞［(85.1±5.2)% vs (63.8±3.1)%，P<0.05］；而S期細胞明顯低于對照組細胞［(8.3±1.1)% vs (23.1±1.5)%，P<0.05］；G2/ M期細胞與對照組細胞無明顯差異(P>0.05)。本實驗結果顯示，使BTG1基因表達水平提高可以影響喉癌Hep-2細胞的細胞周期分布，BTG1可以導致Hep-2細胞G0/G1期阻滯，S期細胞明顯減少，G2/M期細胞阻滯不明顯(圖5A、B)。

2.6 BTG1對喉癌Hep-2細胞Cyclin D1、Bcl-2蛋白的影響

Western blot檢測結果顯示，實驗組細胞中Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達水平均明顯低于對照組細胞(0.436±0.023 vs 0.916±0.092和 0.167±0.009 vs 0.834±0.084, P<0.05)。作為內(nèi)參的β-actin蛋白表達基本一致，說明Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達水平的下降是由于BTG1基因表達水平提高所致。Cyclin D1為細胞周期蛋白，調(diào)控細胞周期變化；Bcl-2為抗細胞凋亡蛋白，阻礙細胞凋亡。本實驗結果表明，在實驗組細胞中BTG1基因高表達從而下調(diào)Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達水平是導致Hep-2細胞G0/G1阻滯和促進Hep-2細胞凋亡的機制之一(圖6A、B)。

圖4 BTG1高表達對細胞凋亡的影響Fig. 4 The effects of BTG1 overexpression on the cell apoptosis

圖5 BTG1高表達對細胞周期的影響Fig. 5 The effects of BTG1 overexpression on the cell cycle

圖6 高表達BTG1對Cyclin D1和Bcl-2的影響Fig. 6 The effects of BTG1 overexpression on Cyclin D1 and Bcl-2

3 討 論

喉癌在所有癌癥中所占的比例超過3%，其已成為全球第六位最常見的癌癥［4］。盡管不斷改進喉癌的診斷和治療方法，但是在過去20年里其患者生存期并沒有得到顯著改善。喉癌的形成是一個長時期、多因素參與、多階段的過程，這一過程會有多個癌基因的突變、抑癌基因的失活以及凋亡調(diào)節(jié)基因和DNA修復基因的改變等，需有眾多基因參與其中。在惡性腫瘤形成過程中目前已知有眾多癌基因及抑癌基因起著重要作用，當抑癌基因缺失或突變導致其表達異常從而常會引起細胞不受調(diào)控的增殖進而導致惡性腫瘤的發(fā)生。只有對喉癌的遺傳基礎及其發(fā)生的分子機制進行深入的研究和不斷的探索，才會在臨床中對喉癌的早期診斷、基因治療和預后評價具有進一步的指導作用。

BTG1是BTG/TOB基因家族成員之一，BTG/ TOB家族包括BTG1、BTG2/PC3/Tis21、BTG3/ ANA、BTG4/PC3B、Tob1/Tob及Tob2等6種基因，最初BTG1為慢性B淋巴細胞性白血病染色體在t(8;12)(q24;q22)進行易位相關的基因進行克隆得到［5］。20世紀90年代初法國Rouault等［6］從淋巴母細胞中分離出5620 bP的BTG1基因全長cDNA, 其定位在12q22染色體，mRNA 長度為1.8 kb，編碼相對分子質(zhì)量為19×103的蛋白。已知該家族所有成員都具有抑制細胞增殖及負向調(diào)控細胞周期的功能。BTG/TOB家族的主要特點是具備多個氨基酸N末端區(qū)域，被稱為BTG/TOB同源域。這個同源域結構包括A盒和B盒，均為較短并且高度保守的同源區(qū)，A盒具有抗增殖作用，B盒具有和許多靶分子結合的功能［7］。

在喉癌的發(fā)生、發(fā)展中腫瘤細胞異常生長增殖發(fā)揮著重要的作用，正常情況下應該凋亡的細胞未發(fā)生凋亡而繼續(xù)生存，顯示出惡性增長行為［8］。本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法而明顯提高了BTG1表達水平的喉癌Hep-2細胞進行MTT細胞生長增殖實驗檢測，結果發(fā)現(xiàn)，高表達 BTG1 蛋白的Hep-2細胞株生長減慢，增殖明顯受到抑制，說明BTG1在其中發(fā)揮了重要的生物學作用，且隨著作用時間的延長表現(xiàn)出與對照組細胞體外增殖能力差異的顯著增大。本實驗采用流式細胞儀檢測細胞周期實驗中提高喉癌Hep-2細胞中BTG1的表達量，結果發(fā)現(xiàn)實驗組G0/G1期細胞所占比例升高，S期細胞比率減少，Hep-2細胞被阻滯在G0/G1期，這一檢測結果所顯示通過誘導細胞G0/G1期阻滯來抑制喉癌Hep-2細胞的生長是BTG1的一重要分子機制。Western blot檢測還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因細胞中Cyclin D1蛋白表達明顯降低，表明BTG1高表達抑制細胞生長，誘導細胞周期的阻滯，可能與BTG1使細胞周期蛋白Cyclin D1表達下降有關。Cyclin D1被認為是一種原癌基因，是Cyclin D家族基因的重要成員，在人類多種腫瘤組織中高表達或存在突變［9］。Cyclin D家族還包括Cyclin D2、Cyclin D3，其功能與Cyclin D1相似，可以形成CDK4/Cyclin D以及CDK6/Cyclin D復合物，促進G1/S期轉(zhuǎn)換的發(fā)生。有研究［10-11］結果顯示，BTG1基因家族中BTG2和TOB2也能夠使得細胞周期蛋白表達下調(diào)。本研究結果顯示，BTG1基因是一個喉癌細胞增殖抑制基因，其作用機制之一是通過CDK/Cyclin D1途徑參與并影響腫瘤細胞周期的調(diào)控。

細胞凋亡在生理或病理條件下均可發(fā)生，其是一種自發(fā)的、程序化的細胞死亡過程。在其發(fā)生過程中會受到體內(nèi)、外許多因素的影響并涉及到一系列相關基因的變化［12］。增強對腫瘤細胞的誘導，促進其凋亡也是腫瘤基因治療的又一有效途徑。我們在Annexin Ⅴ實驗中發(fā)現(xiàn)，提高喉癌Hep-2細胞中BTG1的表達，可以誘導細胞凋亡。Corjay等［13］對患有遺傳性高脂血癥的人群進行研究時發(fā)現(xiàn)，含有大量巨噬細胞組織內(nèi)的凋亡細胞中BTG1會出現(xiàn)高表達現(xiàn)象。Lee等［14］經(jīng)過實驗證實，在腦膠質(zhì)細胞瘤細胞凋亡的過程當中BTG1發(fā)揮著積極的促進作用。Nahta等［15］研究證明，在Bcl-2的反義核酸介導乳腺癌MCF7細胞凋亡過程中BTG1出現(xiàn)高表達。我們隨后通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，Hep-2細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯下降，Bcl-2是重要的抗凋亡基因，同時又是癌基因，通過阻斷內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的DNA剪切活性或抑制凋亡刺激信號從而起到阻滯細胞凋亡的作用。當某種因素使Bcl-2基因出現(xiàn)過度表達時，導致細胞不能啟動正常的凋亡程序，細胞過長時期生存會促使腫瘤形成［16］，并且高表達Bcl-2的腫瘤患者其預后較差［17-18］。本研究采用Annexin Ⅴ分析法檢測了BTG1高表達對細胞凋亡的影響，實驗結果顯示轉(zhuǎn)染BTG1的喉癌細胞早期凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)，表明BTG1高表達能夠誘導喉癌Hep-2細胞的凋亡。結合以上的研究結果，BTG1誘導喉癌Hep-2細胞凋亡的機制之一是通過下調(diào)Bcl-2的表達來實現(xiàn)的。

在急性B淋巴細胞性白血病患者中由于BTG1基因缺失而引起其低表達占9%，但是在急性T淋巴細胞性白血病患者中未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象［19］。因此，BTG1表達與遺傳及表觀遺傳的關系仍然有待我們進一步研究。在本實驗中，我們在體外模型中論證了BTG1高表達能夠影響喉癌細胞周期調(diào)控蛋白、抗凋亡蛋白的表達水平，可以使喉癌細胞發(fā)生細胞周期阻滯，通過上述的作用能夠使喉癌細胞的增殖生長受到抑制，誘導凋亡。

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The effect of BTG1 overexpression on the proliferation and apoptosis of laryngeal cancer cells and its molecular mechanism in vitro

JIANG Runxue1, HU Wanning1, SUN Guogui2, LI Jun1, HAN Xiaochen1,CAI Haifeng1(1.Department of Head and Neck Surgery, Tangshan People’s Hospital of Hebei United University, Tangshan 063000, Hebei Province, China; 2.Department of Chemoradiotherapy, Tangshan People’s Hospital of Hebei United University, Tangshan 063000, Hebei Province, China)

HU Wanning E-mail: rmyy_hwn@163.com

Background and purpose:B-cell translocation gene 1(BTG1) can inhibit cell proliferation, promote cell apoptosis and regulate cell cycle progression and differentiation in a variety of cell types. This study aimed to explore the influence on cell proliferation, apoptosis and cell cycle and its related mechanism of laryngeal cancer Hep - 2 cell lines through BTG1 overexpression by in vitro experiments.Methods:The BTG1 expression plasmids were constructed and transfected into Hep-2. They were divided into experimental group (transfected BTG1 of Hep-2 cells) and control group (transfected empty plasmid of Hep-2 cells). Western blot method was used to identify BTG1 protein expression levels of cells; proliferation activity of cells was detected by MTT assay; flow cytometry was used to analyze the cell cycle distribution and Annexin Ⅴ-FITC/PI cell apoptosis; Western blot was also used to assay cell cycle regulatory protein and apoptosis-related protein expression.Results:The pEGFP-N1-BTG1 plasmid was constructed successfully, and the expression of BTG1 protein was higher in experimental group than that in control group(0.921±0.091 vs 0.308±0.047, P<0.05). Compared with the two group of laryngeal cancer Hep-2 cells, the cell growth in experimental group was slowed down and the proliferation was reduced (P<0.05); Cyclin D1 protein expression level was decreased (0.436±0.023 vs 0.916±0.092, P<0.05), the proportion of G0/G1phase cell cycle was increased [(85.1±5.2)% vs (63.8±3.1)%, P<0.05], the proportion of S phase cell was decreased [(8.3±1.1)% vs (23.1±1.5)%, P<0.05], phosphatidylserine ectropion in experimental group was increased, cell early apoptosis was significant [(10.3±1.1)% vs (2.8±0.3)%, P<0.05] and anti-apoptotic protein Bcl-2 expression level was reduced(0.167±0.009 vs 0.834±0.084, P<0.05).Conclusion:BTG1 high expression could inhibit the proliferation growth of laryngeal Hep-2 cells and promote its apoptosis, and the possible mechanisms are interrelated with BTG1 involved in cell cycle regulation and causing cell apoptosis.

Laryngeal cancer; BTG1; Proliferation; Apoptosis; Cell cycle

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.12.007

R739.63

A

1007-3639(2015)12-0959-07

2014-07-12

2015-03-25）

胡萬寧 E-mail:rmyy_hwn@163.com