復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學科，上海 200032

低強度超聲對肝癌細胞MHCC97H遷移與侵襲能力影響的體外研究

楊名珍，劉邦忠，石明芳，李 蘊，劉光華，王 平

復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學科，上海 200032

背景與目的：低強度超聲(low intensity ultrasound, LIUS)能殺傷腫瘤細胞，促進腫瘤細胞的凋亡，但對腫瘤細胞遷移侵襲作用的影響仍不清楚。該研究旨在探討LIUS對肝癌細胞MHCC97H遷移侵襲的影響及可能的機制。方法：實驗根據(jù)超聲照射強度的不同分為對照組(0 W/cm2)、0.5 W/cm2組、1.0 W/cm2組和1.5 W/cm2組；LIUS處理后劃痕實驗和Transwell小室體外遷移和侵襲實驗檢測腫瘤細胞的遷移和侵襲能力；顯微鏡及F-actin細胞骨架熒光染色觀察處理后細胞骨架的變化；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)及蛋白質(zhì)［?。蒇E法(Western blot)檢測各組MMP-2、MMP-9的表達變化。結(jié)果：LIUS(小于等于1.5 W/cm2)能促進肝癌細胞MHCC97H的遷移侵襲，劃痕實驗及Transwell遷移和侵襲實驗都表明LIUS處理后腫瘤細胞遷移侵襲數(shù)量增加；光學顯微鏡及熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)LIUS處理后肝癌細胞的形態(tài)發(fā)生變化；RTFQ-PCR及Western blot的結(jié)果表明超聲處理后MMP-2 mRNA 及蛋白表達水平上升，MMP-9的mRNA 表達水平上升。結(jié)論：LIUS可能通過改變腫瘤細胞的骨架及增加MMP-2的表達促進肝癌細胞MHCC97H的遷移及侵襲能力。

低強度超聲；肝癌細胞；轉(zhuǎn)移；基質(zhì)金屬蛋白酶

超聲是指頻率大于人耳能聽到的頻率(20～20 000 Hz)的聲波，低強度超聲(low intensity ultrasound，LIUS)通常指強度小于3 W/cm2的超聲。超聲的生物學效應(yīng)包括機械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，目前的研究主要集中于促進腫瘤細胞凋亡及其機制［1-2］、化療增敏［3］、增強基因治療效率［4］。然而，LIUS對腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響至今研究甚少，而對于惡性腫瘤而言轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)往往是患者死亡的主要原因，因此本研究的目的就是探究LIUS對肝癌細胞系MHCC97H的侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及可能的機制。

肝細胞肝癌是最常見的惡性腫瘤之一。我國屬于肝癌高發(fā)國家，發(fā)病人數(shù)占世界的50%以上。盡管近年來肝癌研究已取得很大進展，但患者的生存率仍然不高，5年生存率只有7%左右，根治性切除患者術(shù)后5年仍有40%～70%的復(fù)發(fā)率［5］。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導致肝癌患者死亡的主要原因。本研究旨在探討LIUS對肝癌轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑

人肝癌細胞系MHCC97H來自復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院肝癌研究所，細胞培養(yǎng)所用高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰酶均購自美國Gibco公司，一抗MMP-2、MMP-9購自美國Abcam公司，β-actin購自美國SCT公司，二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Transwell小室(24 well insert, por size 8 μm)購自美國Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司，蛋白裂解液、彩色預(yù)染蛋白購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，SYBR Premix Ex Taq購自寶生物工程(大連)有限公司。

超聲波儀器BTL-5000物理治療工作站-超聲治療儀(英國BTL實業(yè)公司)使用參數(shù)為：頻率1 MHz，強度為0.5、1.0和1.5 W/cm2，作用時間為1 min，占空比為25%。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組

將人肝癌細胞系MHCC97H接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞用0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，細胞懸液裝入無菌聚乙烯離心管中。

超聲探頭與離心管之間涂以耦合劑，使之緊密接觸。根據(jù)超聲處理強度的不同分為4組：對照組(0 W/cm2)、0.5 W/cm2組、1.0 W/cm2組和1.5 W/cm2組。在頻率1 MHz、不同處理強度下，作用1 min后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 劃痕實驗

將超聲處理與不處理的細胞懸液接種于6孔板中，待細胞融合度達80%～90%時用無菌200 μL Tip槍頭在板底部劃等寬的直線。用PBS洗去漂浮細胞，將培養(yǎng)板放在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的無菌培養(yǎng)箱中溫育，分別在0、24、48和72 h顯微鏡下觀察拍照，并比較0與72 h的劃痕寬度，用細胞遷移率來表示，即(0 h的劃痕寬度-72 h的劃痕寬度)/0 h的劃痕寬度。

1.2.3 細胞遷移侵襲Transwell小室實驗

Transwell 遷移實驗：將饑餓24 h后的細胞用胰酶消化，將不含血清的DMEM調(diào)整細胞密度至5×104個/mL，取200 μL細胞懸液加入到Transwell小室的上室，下室加500 μL含30%FBS的DMEM，小室放在24孔板中，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的無菌培養(yǎng)箱溫育48 h。之后小室用4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，光學顯微鏡下觀察染色細胞的數(shù)量，任意取3個視野計數(shù)并做統(tǒng)計分析。

Transwell侵襲實驗：將Matrigel基質(zhì)膠與無血清的DMEM按1∶5稀釋，取50 μL稀釋的Matrigel基質(zhì)膠加到上室，放入培養(yǎng)箱中3 h。Matrigel基質(zhì)膠凝固之后的步驟同Transwell遷移實驗。

1.2.4 細胞形態(tài)及F-actin染色觀察細胞骨架

細胞經(jīng)LIUS處理后溫育在6孔板中，24 h后換液并在光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，100倍率拍照比較。

F-actin熒光染色：按照Abcam公司的F-actin細胞染色試劑盒(綠色熒光)提供的操作步驟對LIUS處理的細胞進行骨架染色。染色后利用熒光顯微鏡的藍色熒光激發(fā)，在放大1 000倍條件下觀察細胞的骨架變化，并拍照觀察形態(tài)變化情況。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)檢測MMP-2、MMP-9的mRNA的表達

將LIUS處理后的細胞鋪在6孔板中，細胞貼壁后用TRIzol提取總RNA，按照寶生物工程(大連)有限公司試劑盒的操作方法將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RTFQ-PCR用SYBR Green染料為熒光檢測信號，RTFQ-PCR在八聯(lián)管中反應(yīng)，每組每個基因設(shè)3個復(fù)孔。RTFQ-PCR引物見表1。

表1 GAPDH、MMP-2和MMP-9引物序列表Tab. 1 Primer sequence for GAPDH, MMP-2 and MMP-9

將RTFQ-PCR所得的目的基因的Ct值與相應(yīng)的GAPDH的Ct值相減得ΔCt值，再將處理組的ΔCt值與對照組的ΔCt值相減得ΔΔCt值，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行分析。

1.2.5 蛋白質(zhì)［?。蒇E法(Western blot)檢測MMP-2、MMP-9的蛋白表達

各組細胞超聲處理后在培養(yǎng)皿里培養(yǎng)24 h后，用RIPA細胞裂解液提取蛋白，冰上放置30 min。細胞充分裂解后，于12 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液，用BCA法測蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混勻，沸水煮5 min，按上海碧云天生物技術(shù)有限公司凝膠配制試劑盒說明配膠，上樣量20 μg，依次經(jīng)過電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉1 h之后加入一抗于4 ℃過夜。第2天加入一抗再次溫育1 h后，TBST沖洗3次，每次5 min，然后室溫敷二抗1.5 h，用TBST再沖洗3次，每次5 min。最后曝光顯示條帶。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用χ±s

表示，各組之間的比較用t檢驗的方法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 劃痕實驗表明低強度超聲促進MHCC97H細胞遷移

處理與未處理的細胞鋪板，待細胞長至80%～90%時做劃痕實驗，并觀察3 d，比較0和72 h的劃痕愈合率。由圖1可見，低強度超聲處理后的細胞劃痕愈合能力比對照組(0 W/cm2)細胞快，并且1.5 W/cm2組劃痕愈合最快，1.5 W/cm2組與1.0 W/cm2組、處理后各組與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，0.5 W/cm2組與1.0 W/cm2組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 Transwell小室細胞遷移侵襲結(jié)果

處理與未處理的細胞鋪板，24 h后去掉因LIUS導致的死亡或凋亡的細胞，貼壁的細胞胰酶消化后行Transwell遷移和侵襲實驗。實驗結(jié)果如圖2所示：Transwell小室上鋪不帶Matrigel基質(zhì)膠顯示的是細胞的遷移能力，Transwell小室上鋪有Matrigel基質(zhì)膠代表的是細胞的侵襲能力；各組細胞遷移數(shù)量的統(tǒng)計分析結(jié)果表明處理后細胞均比未處理細胞遷移增加，處理后各組與對照組相比差異有統(tǒng)計意義；各組細胞侵襲數(shù)量統(tǒng)計分析結(jié)果表明處理后細胞侵襲數(shù)量與未處理相比顯著增加，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這表明LIUS提高了MHCC97H的體外遷移侵襲能力。

2.3 LIUS處理后細胞形態(tài)的改變

LIUS處理細胞24 h后分別在光學顯微鏡下和熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和細胞骨架F-actin的變化。如圖3A顯示，處理后(尤其是1.5 W/cm2組)細胞之間變得疏松，連接不如對照組緊密，單個細胞的形態(tài)變得狹長伸出偽足。圖3B熒光顯色可見，對照組細胞之間有明顯的緊密連接，處理后緊密連接減少，細胞骨架變得狹長、伸出偽足。

2.4 低強度超聲處理對MMP-2、MMP-9 mRNA表達的影響

LIUS處理后細胞重新溫育24 h，之后提取RNA，用Real-time RT-PCR的方法檢測各組細胞中MMP-2、MMP-9的mRNA 的相對表達量。如圖4所示，MMP-2 mRNA 的相對表達量，與對照組相比均提高且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，另外本實驗1.0 W/cm2組MMP-2 mRNA的表達量最高，且與0.5 W/cm2組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MMP-9的mRNA相對表達量，與對照組相比，處理后各組的表達量均有增加，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但處理組各組之間表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 劃痕實驗觀察LIUS對MHCC97H遷移能力的影響Fig. 1 The influence of LIUS on the migration of MHCC97H through scratch assay

圖2 Transwell體外遷移侵襲實驗Fig. 2 Transwell migration and invasion assay in vitro

圖3 細胞形態(tài)及F-actin染色表示細胞骨架的改變Fig. 3 Cell morphology and cytoskeleton changes by F-actin staining

圖4 LIUS處理對MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達量的改變Fig. 4 The relative mRNA expression of MMP-2 and MMP-9 after LIUS irradiation

2.5 LIUS處理對MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

LIUS處理后細胞培養(yǎng)24 h后采用Western blot檢測MMP-2、MMP-9的蛋白表達變化情況。如圖5所示，MMP-2的蛋白表達受LIUS的影響，處理后細胞的表達量均比對照組增加，且1.0 W/cm2組是最高的；MMP-9的蛋白表達沒有明顯差異。

圖5 LIUS對MMP-2、MMP-9的蛋白表達的影響Fig. 5 The protein expression of MMP-2 and MMP-9 after LIUS irradiation

3 討 論

超聲治療是超聲醫(yī)學的重要組成部分。超聲治療是指應(yīng)用超聲能量作用于人體，產(chǎn)生相應(yīng)的作用，改變機體的功能與組織狀態(tài)，以達到治療疾病的方法。LIUS一般指輸出強度小于3 W/cm2，對人體組織不產(chǎn)生不可逆的損害，目前最常應(yīng)用于臨床康復(fù)理療中。超聲波治療作用基礎(chǔ)有3種效應(yīng)：機械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)。目前研究最多的是超聲波的空化效應(yīng)［6］，空化效應(yīng)指液體中的微小泡核在超聲波作用下被激化，產(chǎn)生泡核的震蕩、生長、收縮及崩潰等一系列動力學過程。

肝細胞肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，是導致癌相關(guān)死亡的第三大原因［7］，目前手術(shù)仍是治療的主要方法。雖然近年來治療方法有不斷的改進，但肝癌患者的預(yù)后仍不佳，主要原因是轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。MHCC97H屬于肝癌細胞系，來自復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院肝癌研究所，具有高侵襲性的特點，我們的研究主要觀察超聲處理后對于存活下的肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移有何影響。

近年來，LIUS在腫瘤診療中的應(yīng)用越來越多的被關(guān)注。一方面，超聲能促進微泡(聲敏劑)靶向治療腫瘤，從而提高藥物的敏感性及靶向濃度，達到治療腫瘤的目的［8-9］；另一方面，超聲能抑制腫瘤的生長，體內(nèi)、體外研究均證實超聲治療能有效殺傷腫瘤細胞、抑制腫瘤的生長［2,10］，我們的研究也證實了這一點。然而，LIUS對于存活下來的腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力有何影響，很少有學者對此進行研究。有學者［11］提出高強度超聲(high intensity ultrasound，HIUS)可能增加腫瘤轉(zhuǎn)移的風險，但也有不同的觀點，Xing等［12］用高強度聚焦超聲(high intensity focused ultrasound，HIFU)對黑素瘤進行了處理，發(fā)現(xiàn)HIFU不增加腫瘤轉(zhuǎn)移風險，而且可以抑制腫瘤免疫反應(yīng)。LIUS對腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移的影響目前研究很少，并且和我們的研究得出了不同的結(jié)果。Wei等［13］用LIUS(21 KHz、46 mW/cm2、30 s)聯(lián)合微泡對前列腺癌細胞PC-3侵襲轉(zhuǎn)移性進行了研究，認為超聲聯(lián)合微泡抑制PC-3細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，并解釋為這可能是通過降低金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2、MMP-9發(fā)揮作用的。吳歡等［14］利用1 MHz、0.3 W/cm2、60 s和1 MHz、0.6 W/cm2、30 s的超聲參數(shù)，發(fā)現(xiàn)超聲聯(lián)合血呋啉單甲醚和SonoVue降低了乳腺癌細胞株MDA-MB-231的增殖能力和侵襲能力。這可能是因為所研究的腫瘤細胞類型不同所致，也可能與所用超聲的強度、頻率、處理時間、處理方式及觀察時間點等的不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)1 MHz、處理1 min，在0～2 W/cm2的強度下，隨強度增加，超聲對細胞的殺傷作用增強(結(jié)果中未表示)；在2 W/cm2強度下，殘存的細胞幾乎很難生長，所以我們選取0～1.5 W/cm2的強度作研究。在本研究中，處理后細胞遷移侵襲能力增強，劃痕實驗、Transwell小室實驗結(jié)果均表明1.5 W/cm2組細胞遷移能力最強且與其他兩組間差異有統(tǒng)計學意義，但0.5 W/cm2組與1.0 W/ cm2組的差異不明顯。在Western blot結(jié)果中，1.0 W/cm2組MMP-2的蛋白表達量是最高的，這說明MMP機制可能只是其中一個參與機制，而其具體機制還需進一步探討。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是鋅離子依賴型的蛋白水解酶家族，能夠降解基底膜和細胞外基質(zhì)大多數(shù)組分，在調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的合成和代謝中起重要作用。其中，與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系最密切的是MMP-2、MMP-9，它們都屬于Ⅳ型膠原酶類［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LIUS處理后的細胞MMP-2的mRNA和蛋白表達均增加，說明MMP-2可能參與促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。有研究表明MMP-9既有抗腫瘤的作用也可促進腫瘤發(fā)展，可能與疾病階段有關(guān)，在腫瘤早期階段能促進腫瘤發(fā)展，在疾病晚期階段能抑制腫瘤發(fā)展［16］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LIUS只改變了MMP-9的mRNA表達，可能是MMP-9蛋白表達與轉(zhuǎn)錄并不完全一致，沒有發(fā)揮主要作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LIUS處理后的細胞形態(tài)發(fā)生了改變，在光學顯微鏡下可以看到細胞變長、失去正常上皮形態(tài)，這可能和細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。有研究表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵［17］。在熒光顯微鏡下通過對F-actin進行染色，可以清楚地看到未處理細胞間的緊密連接，而處理后細胞間連接減少、細胞變形、細胞周圍伸出細絲狀的偽足。這種形態(tài)的改變可能是細胞侵襲遷移能力增強的一個原因。

本研究只在體外環(huán)境下探究了超聲處理后細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的改變，在體內(nèi)環(huán)境中是否也有相同的變化還需進一步探究。

綜上所述，LIUS可以通過多種機制殺死腫瘤細胞、抑制腫瘤生長。LIUS對肝癌細胞MHCC97H的侵襲轉(zhuǎn)移能力是促進的，這可能與LIUS增加了MMP-2的表達有關(guān)，同時可能與LIUS改變腫瘤細胞的形態(tài)有關(guān)。

［參 考 文 獻］

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An in vitro study of the effect of low intensity ultrasound on the migration and invasion of MHCC97H

YANG Mingzhen, LIU Bangzhong, SHI Mingfang, LI Yun, LIU Guanghua, WANG Ping (Department of Rehabilitation, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China)

LIU Bangzhong E-mail: liu.bangzhong@zs-hospital.sh.cn

Background and purpose:Low intensity ultrasound (LIUS) can kill cancer cells and promote their apoptosis. However, it is still unknown how it affects the migration and invasion of tumor cells. This study aimed to explore the effect of LIUS on human hepatocellular line MHCC97H in migration and metastasis and the possible mechanism in vitro.Methods:According to the intensity of ultrasonic irradiation, 4 experimental groups were established: control group (0 W/cm2), 0.5 W/cm2, 1.0 W/cm2and 1.5 W/cm2group. The migration and invasion ability of hepatocellular cells was detected by scratch assay and Transwell migration and invasion assay after the irradiation of LIUS. The changes of cytoskeleton after irradiation were observed by microscope and F-actin green fluorescence staining. The expressions of MMP-2 and MMP-9 were examined by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR) and Western blot.Results:Low intensity ultrasound (≤1.5 W/cm2) promoted the migration and invasion of hepatocellular line MHCC97H. Scratch assay and Transwell assay showed much more cells under irradiation migrated through membrane than untreated. It was found that morphology of liver cancer cells changed after LIUS irradiation using optical microscope and fluorescence microscope. The results of RTFQ-PCR and Western blot showed upregulation of MMP-2 expression by LIUS in MHCC97H and high expression of MMP-9 mRNA.Conclusion:Low intensity ultrasound may promote the migration and invasion of MHCC97H through changing cytoskeleton and upregulating protein expression of MMP-2.

Low intensity ultrasound; Liver cancer cell; Migration; Matrix metalloproteinase

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.12.002

R735.7

A

1007-3639(2015)12-0926-07

2015-05-29

2015-10-10）

劉邦忠 E-mail:liu.bangzhong@zs-hospital.sh.cn