復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海 200032

欖香烯脂質(zhì)體對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27的體內(nèi)外作用的初步研究

顧喜喜，鎖 濤，蔡定芳

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海 200032

背景與目的：近年來(lái)，許多研究表明欖香烯脂質(zhì)體在臨床治療消化道腫瘤及其惡性胸腹水中應(yīng)用廣泛。本研究結(jié)合體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)旨在觀察欖香烯脂質(zhì)體對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27生長(zhǎng)的抑制作用。方法：在體外實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用機(jī)器視覺-全自動(dòng)活細(xì)胞觀測(cè)分析系統(tǒng)(Cell-IQ)對(duì)不同濃度下的欖香烯脂質(zhì)體進(jìn)行觀測(cè)，以篩選出對(duì)人胃癌HGC-27細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用的最佳濃度，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析在最佳濃度下，欖香烯脂質(zhì)體對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27凋亡的影響。在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的裸鼠模型中，觀察欖香烯脂質(zhì)體、順鉑(cisplatin，DDP)等藥物對(duì)裸鼠腹膜腫瘤指數(shù)(peritoneal cancer index，PCI)的影響，并用免疫組化檢測(cè)CD31標(biāo)記的腫瘤微血管密度(microvessel density，MVD)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在腫瘤中的表達(dá)，以期對(duì)欖香烯脂質(zhì)體抑制胃癌HGC-27細(xì)胞腹膜轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行探討。結(jié)果：欖香烯脂質(zhì)體作用于人胃癌細(xì)胞HGC-27后，Cell-IQ分析抑制作用隨濃度增加，逐漸增強(qiáng)，以100 μg/mL為最佳，欖香烯脂質(zhì)體濃度再增高，其抑制腫瘤作用不再增強(qiáng)。最佳作用時(shí)間為4～19 h。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，100 μg/mL欖香烯脂質(zhì)體作用于人胃癌HGC-27細(xì)胞24 h后，腫瘤細(xì)胞凋亡率為45%，對(duì)照組僅有0.019%。處理組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組。人胃癌腹膜轉(zhuǎn)移裸鼠模型建立后給予欖香烯脂質(zhì)體等藥物干預(yù)，腹膜轉(zhuǎn)移瘤PCI指數(shù)有明顯差異，其中以聯(lián)合治療組下降明顯，免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD31-MVD及VEGF蛋白表達(dá)與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：欖香烯脂質(zhì)體對(duì)于人胃癌細(xì)胞有明確抑制作用，最佳質(zhì)量濃度為100 μg/mL，最佳作用時(shí)間為4～19 h；欖香烯脂質(zhì)體對(duì)人胃癌裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移有明確預(yù)防作用；欖香烯脂質(zhì)體對(duì)人胃癌細(xì)胞抑制作用的主要機(jī)制可能為誘導(dǎo)凋亡。

欖香烯脂質(zhì)體；胃癌；腹膜轉(zhuǎn)移；HGC-27；Cell-IQ；凋亡

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，多數(shù)確診時(shí)已屬中晚期，目前常規(guī)化療、放療對(duì)其治療效果均差，胃癌手術(shù)后5年生存率僅20%～30%［1-2］。腹膜播散是胃癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及治療失敗的常見表現(xiàn)形式。在胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的患者中，發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移的比例高達(dá)30%～50%［3-5］。即使是早期胃癌，根治手術(shù)后也有1.63%(4/308)的患者出現(xiàn)腹膜播散［6］。來(lái)自胃癌和結(jié)直腸癌的腹膜腔播散癌(peritoneal carcinomatosis，PC)患者的自然病程，平均僅為3～8個(gè)月［7-8］。發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移后生存期短的主要原因是由于血-腹膜屏障的存在，常規(guī)的全身化療藥物很難進(jìn)入，外科或腫瘤科醫(yī)生一般僅行姑息性治療。欖香烯脂質(zhì)體(elemene liposome)是我國(guó)醫(yī)藥工作者自行開發(fā)的國(guó)家二類抗腫瘤新藥，是從中藥溫郁金中提取的非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥。既往細(xì)胞學(xué)研究顯示，欖香烯脂質(zhì)體對(duì)于體外腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡，逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥，直接殺傷瘤細(xì)胞，增強(qiáng)免疫和抗血管生成等作用［9］。欖香烯脂質(zhì)體已廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的臨床治療中，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用。它具有低毒、高效和廣譜等優(yōu)點(diǎn)，不易產(chǎn)生耐藥，而且能改善機(jī)體的免疫功能［10］，特別是能夠用于臨床胸腹水的治療。2010年在瑞典舉行的第七屆國(guó)際腹膜表面腫瘤學(xué)會(huì)議，出現(xiàn)了一種治療PC的新理念，即對(duì)于那些高危發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移的患者給予早期干預(yù)，或術(shù)后1年左右進(jìn)行剖腹探查，或術(shù)中進(jìn)行預(yù)防性腹腔灌注治療進(jìn)一步除滅顯微鏡下的殘存腫瘤細(xì)胞，爭(zhēng)取更好的預(yù)后。

有鑒于此，我們觀察在最佳濃度下，欖香烯脂質(zhì)體對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27凋亡的影響。以及比較在腹膜轉(zhuǎn)移早期應(yīng)用欖香烯脂質(zhì)體及常用腹腔化療藥物順鉑(cisplatin，DDP)對(duì)人胃癌HGC-27腹膜轉(zhuǎn)移裸鼠模型的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胃癌HGC-27細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。4～6周齡無(wú)胸腺裸鼠37只，雄性，體質(zhì)量18～20 g，在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物中心內(nèi)飼養(yǎng)。

欖香烯脂質(zhì)體注射液(5 mg/mL)購(gòu)自大連華立金港藥業(yè)有限公司，DDP (10 mg/支)購(gòu)自齊魯制藥有限公司，小牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自上海博升生物科技有限公司，胰蛋白酶(trypsin)由上海華舜生物工程有限公司分裝，Annexin Ⅴ和PI購(gòu)自上海萊茲生物科技有限公司，48孔培養(yǎng)板購(gòu)自丹麥NUNC公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Coulter公司，全自動(dòng)活細(xì)胞觀測(cè)分析系統(tǒng)(Cell-IQ)購(gòu)自芬蘭Chip-Man公司。

1.2 方法

1.2.1 分組

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程分批進(jìn)行，每批細(xì)胞按所要檢測(cè)的指標(biāo)隨機(jī)分為藥物處理組和空白對(duì)照組。其中藥物處理組設(shè)5個(gè)質(zhì)量濃度，分別為：25、50、100、150和200 μg/mL。0 μg/mL為空白對(duì)照，即不加入藥物。每孔設(shè)兩個(gè)復(fù)孔，作用時(shí)間為48 h。

1.2.2 Cell-IQ基本細(xì)胞參數(shù)檢測(cè)

使用48孔板，每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞，加0.5 mL、10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基置37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；待細(xì)胞貼壁后4 h后，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入25、50、100、150和200 μg/mL質(zhì)量濃度的欖香烯脂質(zhì)體，以0 μg/mL為對(duì)照組；將培養(yǎng)蓋換成Cell-IQ專用培養(yǎng)蓋(帶進(jìn)氣孔和空氣過(guò)濾器)；使用消毒后的膠布密封培養(yǎng)板和培養(yǎng)蓋；放入Cell-IQ專用培養(yǎng)箱；使用Cell-IQ Imaging軟件，進(jìn)行調(diào)焦記錄，觀察記錄48 h；待記錄結(jié)束后，使用Cell-IQ Analyser軟件分析細(xì)胞的增長(zhǎng)抑制曲線，篩選對(duì)欖香烯脂質(zhì)體作用的最佳濃度。

1.2.3 Annexin Ⅴ/PI雙染檢測(cè)胃癌細(xì)胞HGC-27凋亡的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞1×106個(gè)/mL接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分空白對(duì)照組和經(jīng)Cell-IQ篩選得到的最佳欖香烯脂質(zhì)體濃度組，檢測(cè)24 h；細(xì)胞收集：懸浮細(xì)胞直接收集到10 mL的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)/mL，350×g，離心5 min，棄去培養(yǎng)液；流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析判斷：在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為(FITC-/PI-)；右上象限是非活細(xì)胞，即凋亡晚期細(xì)胞，為(FITC+/PI+)；而右下象限為凋亡早期細(xì)胞，顯現(xiàn)(FITC+/PI-)。

1.2.4 接種與給藥

預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)9只裸鼠，接種1周后每周處死3只，剖腹探查了解成瘤情況，以腹腔腫瘤<1 mm時(shí)作為干預(yù)時(shí)間。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)為第8天時(shí)腫瘤腹膜內(nèi)已可見，約1 mm，選擇接種1周后給藥。調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)接種至裸鼠腹腔內(nèi)。接種細(xì)胞后第8天，分組給藥，每組7只，共4組，對(duì)照組自然病程，欖香烯脂質(zhì)體組50 μg/g，DDP組為20 μg/g，聯(lián)合用藥組欖香烯脂質(zhì)體50 μg/g+DDP 20 μg/g，以上藥物均采用腹腔注射，每只裸鼠注射0.2 mL，每周1次，連續(xù)給藥共3周。

1.2.5 飼養(yǎng)方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部飼養(yǎng)在中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房的空氣層流架內(nèi)，飼養(yǎng)條件為SPF級(jí)。

1.2.6 檢測(cè)指標(biāo)

第8周時(shí)，解剖動(dòng)物，肉眼觀察腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的局部生長(zhǎng)、腹水、鄰近淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，并全面探查腹腔，取出可疑腫瘤組織、腫大淋巴結(jié)，用4%甲醛溶液固定、切片、染色后行光鏡作常規(guī)病理組織檢查，VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒，記分標(biāo)準(zhǔn)參照許良中等［11］的方法。CD31結(jié)果及MVD判定標(biāo)準(zhǔn)：采用抗CD31單克隆抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，CD31定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜，棕色染色，計(jì)數(shù)MVD，由此來(lái)衡量血管生成的活躍程度，參照Weidner法［12］先在低倍鏡(×100)下選取組織微血管數(shù)量最豐富的區(qū)域，然后在高倍鏡(×400)視野范圍計(jì)算3個(gè)視野血管的數(shù)目，取其平均值作為MVD。

改良裸鼠腹膜表面腫瘤指數(shù)參考PCI評(píng)分(華盛頓腫瘤研究中心)及Klaver等［13］的制定PCI指數(shù)，腹腔劃分為8個(gè)區(qū)域，分為皮下、注射部位、大網(wǎng)膜、肝區(qū)、脾區(qū)、腸系膜、膈肌和壁腹膜，其中每個(gè)區(qū)域腫瘤大小分為4個(gè)等級(jí)，0分為肉眼未見明顯腫瘤，1分為腫瘤最大直徑1～2 mm，2分為腫瘤最大直徑2～4 mm，3分為腫瘤最大直徑大于4 mm，各個(gè)區(qū)域得分累計(jì)即為PCI指數(shù)。隨后進(jìn)行石蠟切片的制作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 機(jī)器視覺-全自動(dòng)活細(xì)胞觀測(cè)分析系統(tǒng)(Cell-IQ)分析結(jié)果

加入欖香烯脂質(zhì)體24及48 h時(shí)，隨著欖香烯脂質(zhì)體質(zhì)量濃度的上升，細(xì)胞死亡率逐漸升高，以100 μg/mL誘導(dǎo)的死亡率最高，質(zhì)量濃度再上升壞死細(xì)胞不再增多(圖1)。圖2為HGC-27細(xì)胞用100 μg/mL欖香烯脂質(zhì)體處理后24 h內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化情況。加入100 μg/mL欖香烯脂質(zhì)體后，胃癌HGC-27死亡細(xì)胞數(shù)逐漸上升，第4 h時(shí)超過(guò)正常細(xì)胞數(shù)，其中4～19 h作用最強(qiáng)，后逐漸下降。圖3顯示HGC-27細(xì)胞加入100 μg/mL欖香烯脂質(zhì)體后不同時(shí)間細(xì)胞的死亡率。以欖香烯脂質(zhì)體作用于HGC-27細(xì)胞后12 h的作用最強(qiáng)，細(xì)胞死亡率為52.16%±9.93%。綜合數(shù)據(jù)分析顯示，在加入100 μg/mL欖香烯脂質(zhì)體12 h后對(duì)HGC-27腫瘤細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。

2.2 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果

我們選擇流式細(xì)胞儀觀察欖香烯脂質(zhì)體促進(jìn)胃癌HGC-27細(xì)胞凋亡的作用。圖4熒光雙參數(shù)點(diǎn)圖顯示，100 μg/mL欖香烯脂質(zhì)體作用于人胃癌HGC-27細(xì)胞24 h后，腫瘤細(xì)胞凋亡率為45%，對(duì)照組僅有0.019%。處理組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組。從細(xì)胞凋亡時(shí)期來(lái)看，藥物作用24 h后細(xì)胞凋亡以早期凋亡為主，提示欖香烯脂質(zhì)體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其主要抗腫瘤機(jī)制之一。

圖1 不同濃度欖香烯脂質(zhì)體作用HGC-27細(xì)胞的細(xì)胞死亡率Fig. 1 Elemene liposome inducing HGC-27 cell death in a concentration-dependent manner

圖2 100 μg/mL欖香烯脂質(zhì)體加入HGC-27細(xì)胞后時(shí)間/細(xì)胞數(shù)曲線及cell-IQ圖像Fig. 2 Dynamic changes of HGC-27 treated with 100 μg/mL elemene liposome

2.3 對(duì)裸鼠生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

在造模4周時(shí)，對(duì)照組動(dòng)物開始出現(xiàn)消瘦、倦怠，活動(dòng)減少，而欖香烯脂質(zhì)體組、DDP組及聯(lián)合治療組則到5周才開始出現(xiàn)類似情況。對(duì)照組在造模7周時(shí)，有裸鼠在上腹部開始出現(xiàn)可觸及的腫塊，而欖香烯脂質(zhì)體組、DDP組、聯(lián)合治療組則較晚出現(xiàn)類似情況。動(dòng)物飼養(yǎng)至8周，部分對(duì)照組裸鼠瘤體突出至腹壁，皮下可捫及，還可見明顯的腹水癥。有些裸鼠肋骨隱約可見，腹部膨隆，呈弓背狀，出現(xiàn)明顯消瘦、活動(dòng)受限、倦怠乏力等衰竭癥狀。而聯(lián)合治療組裸鼠活動(dòng)及生長(zhǎng)狀態(tài)明顯好于對(duì)照組。

2.4 對(duì)裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移瘤的作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，打開腹腔，發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)腫瘤多發(fā)轉(zhuǎn)移，腸系膜、肝、大網(wǎng)膜等均現(xiàn)大小不等結(jié)節(jié)(圖5)。從改良裸鼠PCI指數(shù)結(jié)果可見，DDP組、欖香烯脂質(zhì)體組及聯(lián)合治療組的PCI指數(shù)分別為38、41和33，均較對(duì)照組明顯下降(表1)。這說(shuō)明欖香烯脂質(zhì)體對(duì)腹腔種植瘤生長(zhǎng)有明確抑制作用，其中尤以聯(lián)合治療組改善更加明顯。

2.5 欖香烯脂質(zhì)體對(duì)腫瘤組織CD31-MVD、VEGF表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組的CD31表達(dá)為3.50±0.97，與對(duì)照組的6.75±3.73比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。證明欖香烯脂質(zhì)體與DDP聯(lián)用后能夠在一定程度上抑制血管新生、發(fā)揮抗腫瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DDP組、欖香烯脂質(zhì)體組、聯(lián)合治療組與對(duì)照組VEGF表達(dá)有一定差異，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。結(jié)合CD31檢測(cè)結(jié)果提示，抗血管生成作用可能并非是欖香烯脂質(zhì)體抑制腫瘤的主要機(jī)制。

圖3 100 μg/mL欖香烯脂質(zhì)體作用HGC-27細(xì)胞后不同時(shí)間細(xì)胞死亡率Fig. 3 Death rates of HGC-27 cells treated with 100 μg/mL elemene liposome at different time points

圖4 Annexin Ⅴ/PI雙染檢測(cè)100 μg/mL欖香烯脂質(zhì)體對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞凋亡的影響Fig. 4 Manifestation of HGC-27 cell death induced by 100 μg/mL elemene liposome after Annexin Ⅴ/PI double staining

圖5 8周后后裸鼠腹腔種植瘤表現(xiàn)Fig. 5 Eight weeks after peritoneal implantation in nude mice

表1 改良Sugarbaker裸鼠腹膜表面腫瘤指數(shù)(PCI指數(shù))Tab. 1 Modified sugarbaker nude mice peritoneal surface tumor index (PCI index)

表2 腹膜轉(zhuǎn)移瘤組織中CD31-MVD和VEGF表達(dá)的影響Tab. 2 Expression of CD31-MVD and VEGF in peritoneal metastatic tumors

3 討 論

傳統(tǒng)細(xì)胞檢測(cè)多以直接觀察和手工記錄為主，客觀性較差，耗時(shí)費(fèi)力，指標(biāo)較少，對(duì)于重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果容易出現(xiàn)較大差異，需要破碎細(xì)胞或?qū)?xì)胞造成一定程度的傷害，無(wú)法在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下實(shí)時(shí)觀察藥物對(duì)細(xì)胞的相互作用?；罴?xì)胞成像是近年來(lái)一種應(yīng)用最先進(jìn)的顯微鏡和計(jì)算機(jī)視覺系統(tǒng)分析活細(xì)胞動(dòng)態(tài)過(guò)程的非侵入性技術(shù)，是分析活細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、代謝和凋亡，以及其他各種生物學(xué)行為變化的新的觀察研究手段［14］。機(jī)器視覺-全自動(dòng)活細(xì)胞成像技術(shù)的聯(lián)合使用在不影響細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，觀察和記錄活細(xì)胞的各種運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)及形態(tài)特征，同時(shí)分析多孔、多位點(diǎn)、多種類細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)成為可能［15］。機(jī)器視覺的使用使實(shí)驗(yàn)獲取更多最大的時(shí)間以及空間分辨率優(yōu)勢(shì)，并且能夠降低分析成本［16］。

本研究應(yīng)用Chipman公司生產(chǎn)的全自動(dòng)活細(xì)胞觀測(cè)分析系統(tǒng)(Cell-IQ)可在細(xì)胞培養(yǎng)的同時(shí)，利用活細(xì)胞成像和機(jī)器視覺技術(shù)，自動(dòng)鑒定分析定量細(xì)胞的形態(tài)特征。我們應(yīng)用Cell-IQ觀察欖香烯脂質(zhì)體對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞的作用發(fā)現(xiàn)，與既往的分析方法只有少數(shù)幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程的資料不同，Cell-IQ系統(tǒng)能夠連續(xù)跟蹤和分析，具有強(qiáng)大的持續(xù)記錄和分析功能，而且能夠容納兩塊培養(yǎng)板，兼容6、12、24、48及96孔培養(yǎng)板，可以同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)細(xì)胞不同濃度的細(xì)胞檢測(cè)，顯著縮短了檢測(cè)的人力成本和時(shí)間成本。

既往研究顯示，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是欖香烯脂質(zhì)體抗瘤作用機(jī)制的主要方面之一，這也是其不同于其他中藥抗腫瘤藥物的重要原因。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，也確實(shí)證實(shí)了這一點(diǎn)。另外本研究結(jié)果顯示，欖香烯脂質(zhì)體作用于胃癌細(xì)胞HGC-27后最佳作用質(zhì)量濃度是100 μg/mL，最佳作用時(shí)間為4～19 h。超過(guò)此時(shí)段，作用可能從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)化為直接細(xì)胞毒作用。本研究為探索欖香烯脂質(zhì)體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的最佳作用濃度和時(shí)間，發(fā)揮藥物的最佳效果，降低不良反應(yīng)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)于腹腔播散腫瘤的治療，由于醫(yī)療環(huán)境和診療常規(guī)的限制，目前國(guó)內(nèi)仍然存在很大的爭(zhēng)議，在患者選擇、預(yù)后評(píng)價(jià)、臨床證據(jù)、手術(shù)方式等方面，仍然沒(méi)有達(dá)成共識(shí)。腹膜表面腫瘤工作多限于臨床前的研究［17］。即使在開展腹腔治療的一些歐美國(guó)家，發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移后，只有10%～20%的患者能夠獲得積極的Sugarbaker方案治療，而且手術(shù)成本非常高，因此在發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移前進(jìn)行早期干預(yù)和預(yù)測(cè)是必然的考慮。鑒于此，我們建立了腹膜表面腫瘤胃癌裸鼠模型，在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移早期進(jìn)行干預(yù)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組裸鼠各項(xiàng)指標(biāo)均較治療組差，聯(lián)合治療組生活狀態(tài)明顯好于對(duì)照組，第8周解剖后各組PCI指數(shù)也證實(shí)了這點(diǎn)，可見欖香烯脂質(zhì)體對(duì)早期裸鼠胃癌腹膜轉(zhuǎn)移有明確的抑制作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明，Cell-IQ可以探索藥物誘導(dǎo)凋亡的最佳作用濃度和最佳作用時(shí)間，為臨床用藥時(shí)如何發(fā)揮藥物的最佳效應(yīng)，降低化療藥物的不良反應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。人胃癌裸鼠腹膜轉(zhuǎn)移瘤模型與臨床胃癌的發(fā)展進(jìn)程十分相似，在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移早期給予欖香烯脂質(zhì)體和常用腹腔化療藥物DDP進(jìn)行干預(yù)治療后發(fā)現(xiàn)有明確的療效，值得臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用，另外也給腹膜轉(zhuǎn)移性腫瘤的早期預(yù)防及治療提供思路。

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Preliminary research on the effect of elemene liposome on gastric cancer cell HGC-27 and its mechanism

GU Xixi, SUO Tao, CAI Dingfang(Department of Integrative Medicine, Zhongshan Hospital,Fudan University, Shanghai 200032, China)

CAI Dingfang E-mail: dingfangcai@163.com

Background and purpose:In recent years, many studies have showed that elemene liposome is widely used in the treatment of digestive tract tumors, malignant pleural effusion and ascites. This study combined in vitro and in vivo experiments to observe the inhibitory effect of elemene liposome on the growth of human gastric cancer and the HGC-27 cell line.Methods:In order to screen the optimum concentration of elemene liposome, machine vision automatic live cell observation analysis system (Cell-IQ) was applied to detect the best inhibitory effect on human gastric cancer cell line HGC-27, and the flow cytometry was applied to further detect the apoptosis of HGC-27 treated with elemene liposome. The model of human gastric cancer peritoneal metastasis in nude mice was established to investigate the intervention of elemene liposome and cisplatin (DDP) on peritoneal cancer index (PCI). CD31 marker of tumor microvessel density (MVD) and the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in tumor tissues were investigated to explore the mechanism underlying the inhibitory effect on peritoneal metastasis of HGC-27 cells in nude mice.Results:Cell-IQ analysis showed that the inhibitory effect of elemene liposome on HGC-27 presented in a positive concentration-dependent manner, which could not be further enhanced when the concentration exceeded 100μg/mL with the best reaction time between 4 and 19 hours. Flow cytometry showed that the early apoptosis rate was 45% in the elemene liposome group and only 0.019% in the control group. The early apoptosis rate was significantly higher in treatment group than that in control group (P<0.05). PCI was significantly lower in the group treated with elemene liposome plus DDP than that in control group (P<0.05) in the peritoneal metastasis of gastric cancer nude mice model. The expression of CD31-MVD and VEGF was not significantly different between the treated and control groups (P>0.05).Conclusion:Elemene liposome can inhibit human gastric cancer cells at the optimal concentration of 100 μg/mL with the best reaction time between 4-19 hours. Elemene liposome has a clear preventive effect on peritoneal metastasis of human gastric cancer in nude mice. Induction of apoptosis in gastric cancer cells may be the main mechanism underlying the inhibitory effect of elemene liposome on human gastric cancer cells.

Elemene liposome; Gastric cancer; Peritoneal metastasis; HGC-27; Cell-IQ; Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.12.005

R735.2

A

1007-3639(2015)12-0945-08

2015-07-25

2015-10-26）

上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥課題(2012L087A)。

蔡定芳 E-mail:dingfangcai@163.com