南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京，210046

冬凌草甲素對胰腺癌細(xì)胞骨架蛋白F-actin的影響

劉軍樓，沈洪，徐力，楊繼兵，于希忠，孫志嶺

南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京，210046

背景與目的：中醫(yī)藥治療腫瘤不良反應(yīng)低且療效顯著，在防治胰腺癌方面有較大的潛力與優(yōu)勢，日益受到國內(nèi)、外醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。本研究觀察中草藥冬凌草的有效成分冬凌草甲素對人胰腺癌SW1990凋亡及細(xì)胞骨架蛋白F-actin的影響。方法：以不同濃度的冬凌草甲素作用于體外培養(yǎng)的SW1990細(xì)胞，采用MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率，DAPI染色法染色后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核凋亡、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，激光共聚焦顯微鏡觀察F-actin形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：冬凌草甲素對人胰腺癌SW1990細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，熒光顯微鏡見到典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，25、50 μmol/L冬凌草甲素給藥組早期凋亡的百分率顯著高于對照組(3.78±0.46，9.51±0.63 vs 0.73±0.06，P<0.05)，晚期凋亡和壞死細(xì)胞的百分率也顯著高于未給藥組(14.40±1.78，20.53±2.54 vs 4.16±0.31，P<0.05)。細(xì)胞骨架蛋白F-actin呈現(xiàn)解聚狀態(tài)。結(jié)論：冬凌草甲素可抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是藥物引起了細(xì)胞骨架蛋白F-actin解聚。

冬凌草甲素；胰腺癌；增殖抑制；凋亡；細(xì)胞骨架蛋白

中草藥冬凌草系唇形科香茶菜屬植物，學(xué)名碎米亞，味苦甘、性微寒，具有清熱解毒、消炎止痛、健胃活血及抗腫瘤等作用。冬凌草主要化學(xué)成分為貝殼杉烯類的二菇，其中最重要的抗癌有效成分確定為冬凌草甲素(oridonin)。最新研究結(jié)果表明，冬凌草甲素對胃癌SGC-7901細(xì)胞、人白血病細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞、膽囊癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞等有治療作用［1-6］。有研究提示冬凌草甲素對人胰腺癌細(xì)胞有生長抑制作用［7-8］。關(guān)于冬凌草甲素作用于細(xì)胞骨架蛋白肌動蛋白(actin)的研究，尚未見文獻(xiàn)報道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素對胰腺癌細(xì)胞有抑制作用，其作用機(jī)制可能是藥物引起了端粒酶hTERT mRNA表達(dá)下降，并影響了細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞骨架蛋白β-actin的形態(tài)［9-10］。本研究在前期基礎(chǔ)上進(jìn)一步作冬凌草甲素對人胰腺癌SW1990細(xì)胞骨架蛋白F-actin影響的研究，探究其可能機(jī)制，為其應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥物和細(xì)胞株

冬凌草甲素購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(純度≥98%)；人胰腺癌SW1990細(xì)胞株為上海長海醫(yī)院消化內(nèi)科實驗中心惠贈。SW1990細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于25 mL塑料培養(yǎng)瓶中，37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。冬凌草甲素用1 mL DMSO溶解后加入三蒸水9 mL，配制成含10% DMSO濃度為100 mmol/L的母液，-4 ℃保存，應(yīng)用時加培養(yǎng)基稀釋成目標(biāo)濃度(DMSO的終濃度≤0.01%，無明顯細(xì)胞毒作用)。

1.2 試劑

胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、MTT、DMSO(美國Sigma公司)、DAPI試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)、小牛血清(美國PAA公司)、CytoPainter Phalloidin-iFluor 594 Reagent(美國Abcam公司)。

1.3 主要儀器設(shè)備

MCO-20A IC二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO)，超凈工作臺，熒光顯微鏡，MDF-382超低溫冰箱(日本SANYO公司)，IX50型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，Biophometer分光光度計，5417型低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，F(xiàn)ACScan型流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)，激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)等。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞生長抑制率的測定

采用噻唑藍(lán)(MTT)還原法進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1× 105/mL，將細(xì)胞懸液接種于無菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)12 h細(xì)胞完全貼壁后棄上清液分別加入含3.125、6.25、12.5、25、50及100 μmol/L冬凌草甲素案的DMEM培養(yǎng)基100 μL，每種濃度均設(shè)6個平行孔；對照組加入不含藥物的0.05% DMSO的培養(yǎng)液100 μL。將培養(yǎng)板置于37 ℃、飽和濕度、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱中常規(guī)培養(yǎng)12、24、36和48 h后，于終止培養(yǎng)前4 h，各孔均加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液，各孔加入DMSO 150 μL，震蕩器上振蕩5～10 min溶解藍(lán)色結(jié)晶，待孔內(nèi)結(jié)晶完全溶解并色素均勻后，以酶標(biāo)儀于490 nm處讀取各孔吸光度(A490)值，計算細(xì)胞生長抑制率與IC50。細(xì)胞生長抑制率(%)=［A對照組-A實驗組］/A對照組×100%。實驗重復(fù)3次。

1.4.2 DAPI染色后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

采用DAPI染色法觀察細(xì)胞核凋亡變化。具體操作步驟為 ①細(xì)胞爬片：消毒滅菌的蓋玻片放置于6孔板內(nèi)，取對數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，將細(xì)胞懸液接種于無菌6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2 mL，培養(yǎng)12 h細(xì)胞完全貼壁后棄上清液分別加入含25及50 μmol/L冬凌草甲素的DMEM培養(yǎng)基2 mL；對照組加入不含藥物的0.05% DMSO的培養(yǎng)液2 mL。將培養(yǎng)板置于37 ℃、飽和濕度、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱中常規(guī)培養(yǎng)至24 h后棄上清液；②固定：PBS漂洗3次，培養(yǎng)細(xì)胞爬片在4 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛中固定30 min后，常溫下PBS漂洗3次，每次5 min；③DAPI染色：加入DAPI染色稀釋液，室溫染色3～5 min，PBS漂洗3次，每次5 min；④從培養(yǎng)板中取出蓋玻片，立即倒置于玻片上方，熒光封片劑封片，室溫放置1～2 h待封片劑凝固，于熒光顯微鏡上觀察并攝影。

1.4.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

用Annexin Ⅴ-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。細(xì)胞接種方法和濃度同1.4.2，培養(yǎng)24 h后棄上清液。PBS洗滌貼壁細(xì)胞1次，用胰酶細(xì)胞消化液(含有EDTA)消化細(xì)胞，加入2 mL的DMEM培養(yǎng)基，吹打細(xì)胞后轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1 000×g離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。取5～10萬重懸的細(xì)胞，1 000×g離心5 min，棄上清液，加入195 μL AnnexinⅤ-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，后加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，輕輕混勻。室溫(20～25 ℃)避光溫育10 min。1 000×g離心5 min，棄上清液，加入190 μL Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.4 采用F-actin抗體免疫熒光染色法觀察細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞骨架蛋白變化

具體操作步驟為 ①細(xì)胞爬片：潔凈的蓋玻片消毒滅菌后放置于6孔板內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL接種于6孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)12 h細(xì)胞完全貼壁后棄上清液分別加入含25及50 μmol/L冬凌草甲素的DMEM培養(yǎng)基2 mL，培養(yǎng)24 h后棄上清液；②固定：用PBS分3次取代6孔板中的培液后，去除PBS，培養(yǎng)細(xì)胞爬片在4 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛中固定30 min，常溫下PBS漂洗3次，每次5 min；③封閉：加入免疫染色封閉液，培養(yǎng)板放入濕盒，4 ℃冰箱封閉60 min；④CytoPainter Phalloidin-iFluor 594 Reagent劑盒中F-actin一抗溫育：按照1∶100比例用免疫染色一抗稀釋液稀釋F-actin抗體，吸凈封閉液，立即加入稀釋好的一抗，4 ℃冰箱溫育過夜后，常溫下PBS漂洗3次，每次5 min；⑤二抗溫育：按照1∶100比例用免疫熒光染色二抗稀釋液稀釋的二抗，吸凈PBS液，立即加入稀釋好的二抗，4 ℃冰箱中溫育1 h后，常溫下PBS漂洗3次，每次5 min；⑥從培養(yǎng)板中取出蓋玻片，立即倒置于載玻片上方，熒光封片劑封片，室溫放置1～2 h待封片劑凝固后，于激光共聚焦顯微鏡上觀察并攝影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以±s 表示，計量資料用方差分析比較組間差異性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 冬凌草甲素對SW1990細(xì)胞的生長抑制作用

冬凌草甲素濃度為3.125、6.25 μmol/L時對細(xì)胞的生長無明顯的抑制作用，冬凌草甲素濃度為12.5、25、50和100 μmol/L處理細(xì)胞后抑制率隨給藥濃度增加和作用時間延長而逐漸增加，呈明顯的時間和劑量依賴關(guān)系。其中12.5、25和50 μmol/L的藥物作用24 h的抑制率分別為38.9%、45.9%及62.1%，24 h冬凌草甲素作用的IC50值為35.43 μmol/L［9］。

2.2 冬凌草甲素對SW1990細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

DAPI染色后，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核凋亡。對照組細(xì)胞核較大，核大小及染色均勻，染色較淺(圖1A)。冬凌草甲素給藥組細(xì)胞數(shù)量減少，部分細(xì)胞核體積變小，細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡改變(見圖中白色箭頭)，凋亡細(xì)胞主要表現(xiàn)熒光染色增強、細(xì)胞核濃縮及細(xì)胞核碎裂等典型改變(圖1B、C)。

2.3 冬凌草甲素對SW1990細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，冬凌草甲素均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。冬凌草甲素不同濃度組早期凋亡、晚期凋亡和壞死細(xì)胞、死亡細(xì)胞總數(shù)的百分率，與對照組相比，顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1、圖2)。

圖1 DAPI熒光染色后觀察細(xì)胞核凋亡Fig. 1 Morphology of cell apoptosis was observed by DAPI stain after oridonin treatment (×200)

表1 流式細(xì)胞儀檢測冬凌草甲素對SW1990細(xì)胞凋亡的影響Tab. 1 Cell apoptotic rate was detected by flow cytometry after treated with different concentrations of oridonin

圖2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果Fig. 2 Apoptotic rate of SW1990 cells treated with different concentrations of oridonin was detected by flow cytometry

2.4 冬凌草甲素對SW1990細(xì)胞骨架蛋白F-actin的影響

對細(xì)胞爬片進(jìn)行掃描，攝影形成F-actin抗體免疫熒光染色細(xì)胞質(zhì)圖。同等培養(yǎng)條件下，鬼筆環(huán)肽(phalloidin)能和細(xì)胞的纖維肌動蛋白F-actin特異性的結(jié)合，由FITC-phalloidin標(biāo)記的細(xì)胞F-actin呈橘紅色熒光，主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。激光共聚集顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，陰性對照組細(xì)胞平鋪在培養(yǎng)皿底部，伸展良好，有大量的偽足出現(xiàn)；細(xì)胞的形狀不規(guī)則，細(xì)胞中F-actin較為濃密，排列規(guī)則。在細(xì)胞的周邊和突出的部位F-actin相對富集(圖3A)。經(jīng)過冬凌草甲素藥物處理后的細(xì)胞，細(xì)胞的F-actin纖維在胞質(zhì)中明顯減少，且排列比較紊亂，在細(xì)胞膜的周邊，出現(xiàn)了F-actin纖維的堆積，邊緣呈破損狀。與對照組相比差別明顯，細(xì)胞中央?yún)^(qū)F-actin稀疏，免疫熒光減弱，排列紊亂，且處理后的細(xì)胞偽足結(jié)構(gòu)少，細(xì)胞呈現(xiàn)蜷縮的狀態(tài)，冬凌草甲素濃度越高細(xì)胞數(shù)目減少越明顯，蜷縮越明顯(圖3B、3C)。

圖3 F-actin抗體免疫熒光染色Fig. 3 The morphological changes of F-actin by immunofluorescence staining were observed by laser confocal microscopy

3 討 論

胰腺癌是惡性程度較高的人類腫瘤之一，其臨床癥狀隱匿，早期診斷十分困難，80%～85%的胰腺癌患者確診時已至中晚期。中晚期胰腺癌西醫(yī)治療療效欠佳，而中醫(yī)藥治療腫瘤毒副作用低且療效顯著，在防治胰腺癌方面有較大的潛力與優(yōu)勢，日益受到國內(nèi)、外醫(yī)學(xué)界的關(guān)注［11-15］。本研究探討了中藥單體冬凌草甲素對人胰腺癌SW1990細(xì)胞的生長抑制作用，并分析了其可能作用機(jī)制，為該藥的臨床抗胰腺癌應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

本研究選擇SW1900細(xì)胞株，應(yīng)用多種方法觀察冬凌草甲素對腫瘤細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，冬凌草甲素處理細(xì)胞后抑制胰腺癌細(xì)胞生長，與文獻(xiàn)報道［7，16］一致。本研究DAPI染色后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核凋亡發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素給藥組細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡改變。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示不同濃度組早期凋亡、晚期凋亡和壞死細(xì)胞、死亡細(xì)胞總數(shù)的百分率，均高于對照組，說明冬凌草甲素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

細(xì)胞骨架是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)成分組成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，包括微管、微絲和中間纖維。微絲是3種骨架結(jié)構(gòu)中最細(xì)的，主要由actin組成，以游離球狀actin(G-actin)或F-actin形式存在。Rao等［17］研究表明actin聚合/解聚狀態(tài)的改變，即actin骨架重組，對惡性腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和表型有非常重要的調(diào)節(jié)作用，認(rèn)為干預(yù)細(xì)胞骨架微絲actin重組可作為抗癌藥物的作用靶點，也可作為研發(fā)新的抗腫瘤藥物的依據(jù)。本研究通過F-actin抗體免疫熒光染色法觀察冬凌草甲素對腫瘤細(xì)胞骨架蛋白影響，研究結(jié)果提示，藥物干預(yù)后引起了F-actin聚合/解聚狀態(tài)的改變，主要可能是藥物引起了F-actin解聚，導(dǎo)致F-actin相對減少而G-actin相對增加，從而呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)熒光染色減弱。

關(guān)于冬凌草甲素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制，魏鳳香等［16］認(rèn)為抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)的降低和促凋亡蛋白Bax上調(diào)是其誘導(dǎo)胰腺癌SW1900細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要作用機(jī)制，宋芳等［7］認(rèn)為冬凌草甲素通過下調(diào)survivin的表達(dá)和上調(diào)p21的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和周期阻滯。actin是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分，其表達(dá)水平的變化與細(xì)胞形態(tài)變化密切相關(guān)，研究已明確顯示細(xì)胞骨架的動態(tài)變化能調(diào)控細(xì)胞凋亡［18-19］。細(xì)胞凋亡時actin細(xì)絲發(fā)生斷裂，actin網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞，這是細(xì)胞凋亡時形態(tài)改變的一個典型特征，那么，通過改變這一典型特征是否就能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡呢？對此，White等［20］作了深入的研究。他們用細(xì)胞松弛劑D抑制氣管1HAEo細(xì)胞和主支氣管上皮細(xì)胞actin的延伸，或通過Jaspakinolide促進(jìn)actin的聚集，發(fā)現(xiàn)改變actin的整體性會導(dǎo)致細(xì)胞在5 h內(nèi)出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。該研究提示actin可能是細(xì)胞凋亡早期的調(diào)控物之一。進(jìn)一步研究表明，通過改變actin穩(wěn)定狀態(tài)，可以導(dǎo)致凋亡的發(fā)生［21-22］。F-actin的解聚是凋亡過程中所必須的，其解聚出現(xiàn)在凋亡小體形成之前。actin是Caspases蛋白水解酶的作用底物，當(dāng)Caspases攻擊actin時，可將其切斷降解為15×103和31×103兩個片段，使之不能重新聚合，并由于15×103片段的形成而引起細(xì)胞凋亡形態(tài)的改變［23］。本研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時藥物干預(yù)后引起了actin狀態(tài)的變化，即細(xì)胞骨架蛋白F-actin解聚，分析其作用機(jī)制可能是藥物引起了F-actin解聚從而導(dǎo)致了凋亡的發(fā)生。至于F-actin解聚是否由于Caspases蛋白水解酶作用尚有待進(jìn)一步研究。

有研究顯示actin重組與Rho家族蛋白密切相關(guān)，Rho家族蛋白最主要的功能是調(diào)節(jié)actin重組，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)變化和運動。它歸屬Ras超家族，為一類小分子G蛋白(small G protein，又稱GTPase)。Rho家族蛋白3個亞家族Rho、Rac和CDC42通過Rho/ROCK、Rac/PAK和CDC42/PAK通路來調(diào)節(jié)actin聚合/解聚狀態(tài)引起細(xì)胞骨架重組［24-27］。冬凌草甲素可抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是藥物干預(yù)后引起了F-actin解聚。至于藥物引起F-actin解聚的機(jī)制是否與Rho家族蛋白密切相關(guān)，尚有待進(jìn)一步研究證實。

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Effects of oridonin on cytoskeletal protein F-actin in human pancreatic carcinoma cells

LIU Junlou, SHEN Hong, XU Li, YANG Jibing, YU Xizhong, SU Zhiling (The First Clinical Medicine College of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing Jiangsu 210046, China)

SHEN Hong E-mail: shenhong999@163.com

Background and purpose:Traditional Chinese medicine with notable effect and little adverse reaction is increasingly concerned about the medical profession because of its great potential and advantage in treating pancreatic carcinoma. In this experiment, we studied the effects of oridonin on apoptosis and cytoskeletal protein F-actin in human pancreatic carcinoma SW1990 cells.Methods:SW1990 cells in culture medium were treated with different concentrations of oridonin. The inhibitory rate of the cells was measured by MTT assay. Morphology of cell apoptosis was observed by DAPI stain and cell apoptotic rate was detected by flow cytometry (FCM). The morphological changes of F-actin were observed by laser confocal microscopy.Results:The growth of human pancreatic carcinoma SW1990 cells was significantly inhibited by oridonin. Apoptosis morphological changes including condensation of chromatin and nuclear fragmentation were observed clearly by DAPI stain. The early apoptotic rate of SW1990 cells treated with 25, 50 μmol/L oridonin was significantly higher than that of the control group (3.78±0.46, 9.51±0.63 vs 0.73±0.06, P<0.05), and the late apoptotic rate and cell necrosis rate were also significantly higher than that of the control group (14.40±1.78, 20.53±2.54 vs 4.16±0.31, P<0.05). F-actin was showed from polymerization to depolymerization after oridonin treatment.Conclusion:Oridonin can obviously inhibit the proliferation and induce apoptosis of SW1990 cells. The mechanisms may involve the depolymerization of F-actin after treatment with oridonin.

Oridonin; Pancreatic carcinoma; Antiproliferation; Apoptosis; Cytoskeletal protein

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.01.006

R735.9；R73-36

A

1007-3639(2015)01-0031-07

2014-09-22

2014-12-04）

江蘇省中醫(yī)藥局課題資助項目(LZ11196)；江蘇省高校自然科學(xué)基金資助項目(13KJB360011)。

沈洪 E-mail:shenhong999@163.com