南京市中醫(yī)院腫瘤科， 江蘇 南京 210001

白頭翁皂苷B4、粉防己堿對奧沙利鉑耐藥的結(jié)腸癌細胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用及其機制

李敏，方明治

南京市中醫(yī)院腫瘤科， 江蘇 南京 210001

背景與目的：奧沙利鉑(oraliplatin，L-OHP)是結(jié)直腸癌最常用的化療藥物之一，但臨床上常見結(jié)直腸癌L-OHP化療耐藥。本研究旨在探討中藥單體白頭翁皂苷B4(anemoside B4，AB4)以及粉防己堿(Tetrandrine，Tet)對人結(jié)腸癌L-OHP耐藥細胞LoVo/L-OHP耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，并初步研究其機制。方法：采用濃度梯度實驗篩選無毒劑量的AB4、Tet，無毒劑量的AB4、Tet作用于LoVo/L-OHP細胞48 h后，檢測LoVo/ L-OHP細胞對L-OHP耐藥的變化，檢測處理后細胞凋亡、細胞周期變化情況，通過RT-PCR及Western blot檢測相關(guān)基因P-gp、zDHHC9和SMAD4的mRNA及蛋白的表達水平。結(jié)果：AB4及Tet作用48 h后對LoVo/L-OHP細胞的5%抑制率濃度分別為0.71及0.45 μg/mL，以此作為無毒劑量。L-OHP對LoVo/L-OHP細胞IC50為(112.5±23.6) μg/mL，分別加入0.71 μg/mL AB4及0.45 μg/mL Tet后，L-OHP對LoVo/L-OHP細胞的IC50值分別為 (62.8±21.4)及(58.9±26.3) μg/mL，IC50值均顯著下降(P值均<0.05)。細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，AB4及Tet處理后G1期細胞略有減少，S期細胞略有增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)AB4及Tet處理后凋亡率略有上升，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。RT-PCR檢測顯示耐藥細胞相對于親本細胞，P-gp及zDHHC9基因表達升高，SMAD4表達降低(P值均<0.05)，經(jīng)過AB4處理后，耐藥細胞P-gp基因表達下降。Western blot檢測相關(guān)蛋白水平后發(fā)現(xiàn)，耐藥細胞經(jīng)過AB4處理后，P-gp蛋白表達下降，經(jīng)過Tet處理后zDHHC9蛋白表達下調(diào)。結(jié)論：AB4及Tet能逆轉(zhuǎn)LoVo/L-OHP耐藥細胞對L-OHP的耐藥，AB4逆轉(zhuǎn)機制可能與降低P-gp表達有關(guān)，Tet逆轉(zhuǎn)機制與降低zDHHC9表達水平有關(guān)。

結(jié)直腸癌；化療耐藥；奧沙利鉑；白頭翁皂苷B4；粉防己堿

結(jié)直腸癌為最常見的惡性腫瘤之一。目前發(fā)病率逐年上升，化療是晚期結(jié)直腸癌患者最為重要的治療手段，但化療耐藥是導(dǎo)致治療失敗的重要原因，如何逆轉(zhuǎn)耐藥，提高療效，延長生存期是近年來研究的熱點。中藥及其提取物具有豐富的資源，從中尋找逆轉(zhuǎn)化療耐藥的小分子逆轉(zhuǎn)劑是一個比較有前景的研究方向，該研究通過篩選發(fā)現(xiàn)白頭翁皂苷B4(anemoside B4，AB4)及粉防己堿(tetrandrine，Tet)對于奧沙利鉑(oxaliplatin，L-OHP)耐藥的結(jié)直腸癌具有一定耐藥逆轉(zhuǎn)作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

AB4、Tet購自浙江瑪雅試劑有限公司。TRIzol溶液、cDNA合成試劑盒為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。細胞周期檢測試劑盒、Hoechst33258試劑盒，P-gp、SMAD4抗體以及二抗均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。zDHHC9抗體購自美國Sigma公司。RT-PCR擴增試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，RTPCR引物均由南京凱基生物公司合成。DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，小牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司，DMSO購自上海久億化學(xué)試劑有限公司，L-OHP購自恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，噻唑藍(MTT)購自美國Sigma公司，Gel DocTM XR凝膠成像系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.2 LoVo/L-OHP細胞的培養(yǎng)及其藥物處理

人結(jié)腸癌耐藥細胞株LoVo/L-OHP在前期研究的基礎(chǔ)上繼續(xù)誘導(dǎo)而成［1］。完全培養(yǎng)基為90%DMEM+10%小牛血清，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d換液1次，用0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化傳代，取對數(shù)生長期細胞實驗。細胞消化、計數(shù)、配制成濃度為5×104個/mL的細胞懸液，置于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細胞懸液；將96孔細胞培養(yǎng)板置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，用完全培養(yǎng)基將AB4、Tet倍比稀釋至濃度為4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/mL，每孔加入200 μL相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時設(shè)立陰性對照組和陽性對照組；將96孔細胞培養(yǎng)板置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；將96孔細胞培養(yǎng)板進行MTT染色，測定490 nm處吸光度(A)值，計算抑制率，繪制濃度-抑制率曲線，采用SPSS 16.0軟件計算AB4及Tet作用48 h后對LoVo/L-OHP 5%抑制率的濃度，作為逆轉(zhuǎn)耐藥的無毒劑量。無毒劑量AB4、Tet分別與不同濃度的L-OHP作用LoVo/ L-OHP 48 h后，SPSS 16.0軟件計算出AB4、Tet處理后L-OHP對LoVo/L-OHP的IC50值，并與L-OHP對未使用AB4、Tet處理的LoVo/L-OHP的IC50值進行比較，計算耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=未逆轉(zhuǎn)IC50值/逆轉(zhuǎn)后IC50值。

1.3 Hoechst33258染色檢測細胞凋亡

細胞爬片后，自然晾干細胞樣本，浸入4%多聚甲醛固定液中過夜，加入適當量Hoechst 33258染色液，充分覆蓋住待染色的細胞，室溫放置10 min。PBS浸泡5 min，清洗3次。用抗熒光淬滅封片液封片，封片后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 PI單染法檢測細胞周期

將對數(shù)生長期的細胞消化接種到6孔細胞培養(yǎng)板中，細胞貼壁后，根據(jù)組別設(shè)置加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時設(shè)立陰性對照組，藥物作用48 h后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集細胞；制備的單細胞懸液用體積分數(shù)為70%乙醇固定2 h，4 ℃保存；加100 μL RNase A 37 ℃水浴30 min；再加入400 μL PI染色混勻，4 ℃避光30 min；上機檢測，記錄激發(fā)波長488 nm 處紅色熒光。

1.5 RT-PCR檢測用藥前、后耐藥基因的mRNA表達情況

采用TRIzol試劑提取總RNA，測定總R N A濃度和純度，按照試劑盒步驟進行cDNA合成(20 μL體系)，對反轉(zhuǎn)錄好的cDNA稀釋至5倍后，進行PCR檢測。在冰上依次加入如下組份：10×Taq緩沖度5 μL ，MgCl2(25 mmol/L)4 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，引物順義鏈(10 μmol/L)1 μL，引物反義鏈(10 μmol/L)1 μL，cDNA 1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，滅菌雙蒸水至總體積50 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s；共32個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；上述產(chǎn)物立即進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。各基因引物如下：GAPDH(內(nèi)參)順義鏈：5’-AAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3’，反義鏈：5’-AGATGATGACCCTTTTGGCTC-3’；P-gp正義鏈：5’-TCGTAGGAGTGTCCGTGG AT-3’，反義鏈：5’-CATTGGCGAGCCTGG TAG-3’；SMAD4正義鏈：5’-TTTGCTCCCTT CGTTAT-3’，反義鏈：5’-GATGGATTCT GCCTTTAC-3’；zDHHC9正義鏈：5’-GTCTTC GCCTTCAACATCGT -3’，反義鏈：5’-AATCCA GTCAGTCCCACGAC-3’。

1.6 Western blot檢測蛋白表達

將細胞用胰酶消化后，冰預(yù)冷裂解緩沖液充分裂解。采用BCA檢測各組樣本的蛋白濃度。然后采用10% SDS-PAGE膠進行電泳，待目的條帶進入凝膠最佳分離區(qū)(大約為凝膠的2/3)時，停止電泳。進行轉(zhuǎn)膜90 min， 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出NC膜并作好標記，加入含5%脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩2 h進行封閉。TBST洗膜后放入含一抗(GAPDH 1:1 000；SMAD4 1∶1 000；zDHHC9 1∶400；P-gp 1∶250)的平皿中，4 ℃搖床振蕩溫育過夜。第2天取出，用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗(1:5 000)，室溫搖床振蕩反應(yīng)2 h。將ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒中的A、B兩種液體按1:1等體積混合，配制成工作液。將NC膜上滴加適量工作液，用保鮮膜覆蓋，置于顯影夾內(nèi)，關(guān)閉顯影夾，使膠片顯影和定影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 AB4、Tet對LoVo/L-OHP細胞的抑制作用

將AB4、Tet倍比稀釋至4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/mL，分別作用于LoVo/L-OHP細胞，圖1可見細胞抑制率隨濃度降低而逐漸下降，抑制作用與濃度呈正相關(guān)性。采用SPSS 16.0軟件計算出AB4及Tet作用48 h后對LoVo/L-OHP細胞的5%抑制率濃度分別為0.71及0.45 μg/mL，采用該濃度作為逆轉(zhuǎn)耐藥實驗的無毒劑量。

圖1 AB4、Tet對LoVo/L-OHP細胞的抑制作用Fig. 1 The inhibitory effect of AB4 and Tet on the cell proliferation of LoVo/L-OHP

2.2 AB4、Tet對LoVo/L-OHP耐藥逆轉(zhuǎn)作用

L-O H P對L o Vo/L-O H P細胞I C50為(112.5±23.6) μg/mL，分別加入無毒劑量的AB4 (0.71 μg/mL)以及Tet (0.45 μg/mL)后，L-OHP對LoVo/L-OHP細胞的IC50值分別為(62.8±21.4)及(58.9±26.3)μg/mL，IC50值均明顯下降(P值均<0.05)，逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)分別為1.79及1.91。表明AB4、Tet對LoVo/L-OHP均具有一定的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。

2.3 AB4、Tet對LoVo/L-OHP細胞周期的影響

將LoVo/L-OHP不加藥物干預(yù)細胞作為對照，細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，AB4及Tet處理后G1期細胞略有減少，S期細胞略有增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2、表1)。

表1 AB4、Tet對LoVo/L-OHP細胞周期的影響Tab. 1 The effect of AB4 and Tet on cell cycle of LoVo/L-OHP (%)

2.4 AB4、Tet對LoVo/L-OHP細胞凋亡的影響

將LoVo/L-OHP不加藥物干預(yù)細胞作為對照，細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，AB4及Tet處理后細胞凋亡率略有增加［(5.73±0.41)% v s (6.3 9±0.8 2)%，(5.7 3±0.4 1)% v s (6.82±0.90)%］，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

2.5 AB4、Tet對LoVo/L-OHP相關(guān)基因mRNA水平表達的影響

從圖4中可以看出，耐藥細胞相對于親本細胞，P-gp mRNA及zDHHC9 mRNA表達升高(P<0.05)，SMAD4表達降低(P<0.05)；AB4處理耐藥細胞后，P-gp mRNA表達顯著下降(P<0.05)，zDHHC9 mRNA以及SMAD4 mRNA表達無顯著變化；Tet對耐藥細胞的P-gp mRNA、zDHHC9 mRNA以及SMAD4 mRNA表達均無顯著影響。

2.6 AB4、Tet用藥后對LoVo/L-OHP相關(guān)蛋白水平表達的影響

通過Western blot檢測相關(guān)蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)，LoVo/L-OHP耐藥細胞的P-gp及zDHHC9蛋白表達水平上升(P<0.05)，SMAD4蛋白表達水平下降(P<0.05)；LoVo/L-OHP耐藥細胞經(jīng)過AB4處理后，P-gp蛋白表達下降(圖5)。

圖2 AB4、Tet對LoVo/L-OHP細胞周期的影響Fig. 2 The effect of AB4 and Tet on cell cycle of LoVo/L-OHP cells

圖3 AB4、Tet對LoVo/L-OHP細胞凋亡的影響Fig. 3 The effect of AB4 and Tet on cell apoptosis of LoVo/L-OHP cells

圖4 AB4、Tet用藥后對LoVo/L-OHP相關(guān)基因mRNA表達的影響Fig. 4 The effect of AB4 and Tet on mRNA levels of the genes in LoVo/L-OHP cells

圖5 AB4、Tet用藥后對LoVo/L-OHP相關(guān)蛋白表達的影響Fig. 5 The effect of AB4 and Tet on protein level of the genes in LoVo/L-OHP cells

zDHHC9及SMAD4蛋白表達均無顯著變化；LoVo/L-OHP耐藥細胞經(jīng)過Tet處理后，zDHHC9蛋白表達下降，P-gp和 SMAD4蛋白表達均無顯著變化。

3 討 論

結(jié)直腸癌是人類主要惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病率和死亡率分別位于第3位和第4位，每年有120萬新確診的患者，并且有超過60萬例患者死于結(jié)直腸癌［2］。化療是結(jié)直腸癌重要的治療手段，但出現(xiàn)化療耐藥是化療失敗的主要原因。結(jié)直腸癌化療耐藥現(xiàn)象非常普遍［3］，但結(jié)直腸癌化療耐藥的機制很復(fù)雜，He等［4］通過研究發(fā)現(xiàn)整合素alphaⅤ與結(jié)腸癌細胞HT-29耐藥有關(guān)，而下調(diào)整合素alphaⅤ的表達可降低HT-29對L-OHP的耐藥性。Ebert等［5］研究發(fā)現(xiàn)TFAP2E基因高甲基化與結(jié)直腸癌化療耐藥相關(guān)，TFAP2E基因?qū)е碌哪退幮酝ㄟ^DKK4介導(dǎo)。Zhou等［6］報道m(xù)iR-203通過抑制ATM激酶導(dǎo)致結(jié)直腸癌細胞L-OHP耐藥。有研究者通過長時間L-OHP誘導(dǎo)產(chǎn)生2種結(jié)直腸癌細胞株HT-29R和 Colo320R，通過基因芯片分析，2組耐藥機制完全不一樣［7］，說明不同患者耐藥情況亦有個體差異。本研究通過預(yù)實驗篩選了部分中藥單體的逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐藥細胞L-OHP耐藥的作用，發(fā)現(xiàn)中藥單體AB4及Tet具有一定的逆轉(zhuǎn)耐藥作用。AB4是中藥白頭翁的主要成分，AB4能夠調(diào)控肝癌細胞周期，阻滯G2/M期更替，誘導(dǎo)細胞凋亡［8］。Tet是從粉防己中提取的一種雙芐基異喹啉生物堿，文獻報道［9-10］Tet能夠通過調(diào)控caspase通路誘導(dǎo)細胞凋亡。也有文獻研究證實Tet具有一定的逆轉(zhuǎn)化療多藥耐藥作用，其機制與抑制耐藥蛋白P-gp的表達有關(guān)［11］。本研究結(jié)果顯示，L-OHP對LoVo/ L-OHP細胞IC50為(112.5±23.6) μg/mL，分別加入無毒劑量的AB4以及Tet后，L-OHP對LoVo/L-OHP細胞的IC50值分別為(62.8±21.4)及(58.9±26.3)μg/mL，IC50值均明顯下降(P值均<0.05)，逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)分別為1.79及1.91，表明AB4、Tet對LoVo/L-OHP均具有一定的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。通過細胞凋亡及細胞周期檢測，無毒劑量的AB4以及Tet處理后G1期細胞略有減少，S期細胞略有增加，AB4及Tet處理后凋亡率略有上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)耐藥基因參與是耐藥發(fā)生的重要原因，P-gp是最為常見的一種耐藥蛋白，它是位于細胞膜的ATP依賴性膜轉(zhuǎn)運蛋白，可將腫瘤細胞內(nèi)的藥物主動泵出細胞外，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)化療藥物的有效濃度下降，使腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性［12］。隋華等［13-14］研究采用慢病毒過表達COX-2可介導(dǎo)P-gp的表達從而導(dǎo)致人結(jié)腸癌細胞產(chǎn)生多藥耐藥，另外該作者還通過阻斷PI3K/Akt信號通路激活后，發(fā)現(xiàn)P-gp的表達水平明顯下降，L-OHP對HCT-116/L-OHP敏感性明顯上升，故認為COX-2以及PI3K/Akt信號通路的激活也通過介導(dǎo)P-gp而參與了結(jié)腸癌化療耐藥。本研究中耐藥細胞的P-gp表達水平上調(diào)，AB4處理后，表達下降。zDHHC9是Ras基因的激活酶，能調(diào)控Ras基因的功能，在結(jié)直腸癌細胞中高表達［15］。SMAD4是一種抑癌基因，參與TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［16-17］。同時也是結(jié)直腸癌重要的預(yù)后預(yù)測分子［18］。最新的研究發(fā)現(xiàn)，SMAD4也與結(jié)直腸癌的化療耐藥具有相關(guān)性，SMAD4缺失的結(jié)直腸癌患者通過激活A(yù)kt信號通路導(dǎo)致對以5-FU為基礎(chǔ)的治療耐藥［19］。通過查詢文獻發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中，SMAD4異?？赡軐?dǎo)致P-gp過表達［20］，另外通過Oncomine數(shù)據(jù)庫分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在耐藥結(jié)腸癌細胞中P-gp、zDHHC9表達升高，SMAD4下降，且zDHHC9與SMAD4呈負相關(guān)。因此，考慮L-OHP耐藥與其可能有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)耐藥細胞株zDHHC9表達明顯上調(diào)，而SMAD4表達水平下調(diào)，經(jīng)過Tet處理后發(fā)現(xiàn)zDHHC9表達下調(diào)，SMAD4表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，以上可能為逆轉(zhuǎn)耐藥的部分機制。

綜上所述，AB4及Tet能逆轉(zhuǎn)LoVo/L-OHP耐藥細胞對L-OHP的耐藥，AB4逆轉(zhuǎn)機制可能與降低P-gp表達有關(guān)，Tet逆轉(zhuǎn)機制與降低zDHHC9的表達水平有關(guān)。但是有研究發(fā)現(xiàn)，不同結(jié)直腸癌患者發(fā)生L-OHP耐藥的機制可能不一樣。因此，針對不同耐藥細胞篩選個體化用藥是下一步的研究方向。

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Resistance reverse effect of anemoside B4 and tetrandrine on oxaliplatin-resistant human colon cancer cells and the mechanism

LI Min, FANG Mingzhi (Department of Oncology, Nanjing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Nanjing Jiangsu 210001, China)

FANG Mingzhi E-mail: fangmingzhi@medmail.com.cn

Background and purpose:Oxaliplatin (L-OHP) is one of the most commonly used chemotherapy drugs in colorectal cancer and L-OHP-resistance is very common in colorectal cancer therapy. This research was to discuss the reversal effect in L-OHP-resistant human colon cancer cell line LoVo/L-OHP by anemoside B4 (AB4) and tetrandrine (Tet) and to clarify their molecular mechanism.Methods:LoVo/L-OHP cells were treated for 48 h by AB4 and Tet at different concentrations to get non-toxic dose. Drug sensitivity was measured by MTT. After the treatment, the cell cycle and apoptosis of the cells were detected. Expression of P-gp mRNA, zDHHC9 mRNA and SMAD4 mRNA were detected by RT-PCR. Expression of P-gp, zDHHC9 and SMAD4 protein were detected by Western blot.Results:The IC50of LoVo/L-OHP for L-OHP was (112.5±23.6) μg/mL, and the IC50decreased to (62.8±21.4) μg/mL (P<0.05) and (58.9±26.3) μg/mL (P<0.05) after the treatment with 0.71 μg/mL AB4 and 0.45 μg/mL Tet (non-toxic dose) separately. The cell cycle experiment showed that the cells in G1stage decreased and in S stage increased but with no statistical significance (P>0.05). The cell apoptosis experiment showed that the apoptotic rate increased after thetreatment with AB4 and Tet with non-toxic dose but with no statistical significance (P>0.05). The RT-PCR experiment showed that the expressions of P-gp mRNA and zDHHC9 mRNA were increased and SMAD4 mRNA was decreased in LoVo/L-OHP cells compared with in LoVo cells (P<0.05), while it was found that P-gp mRNA in LoVo/L-OHP cells was decreased after the treatment with AB4 at non-toxic dose (P<0.05). Western blot experiment showed the protein of P-gp in LoVo/L-OHP cells was decreased after treatment with AB4 (P<0.05), which was accordant to the PCR result. The expression of zDHHC9 protein in LoVo/L-OHP cells was decreased in LoVo/L-OHP cells after treatment with Tet (P<0.05).Conclusion:AB4 and Tet have some reversal effect on resistant to L-OHP in LoVo/L-OHP cells. The molecular mechanism of the resistance reverse effect was related to down-regulation of P-gp for AB4 and down-regulation of zDHHC9 for Tet.

Colorectal cancer; Chemo-resistance; Oxaliplatin; Anemoside B4; Tetrandrine

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.01.007

R735.3

A

1007-3639(2015)01-0038-07

2014-09-10

2014-11-27）

南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展青年啟動項目(QYK11135)。

方明治 E-mail:fangmingzhi@medmail.com.cn