遼寧省腫瘤醫(yī)院大腸外科，遼寧 沈陽 110042

下調(diào)miR-21對PDCD4表達及結(jié)腸癌HT-29細胞功能的影響研究

任宇鵬，宋純，張昊

遼寧省腫瘤醫(yī)院大腸外科，遼寧 沈陽 110042

背景與目的：miR-21可能通過抑制PDCD4表達調(diào)控結(jié)腸癌浸潤及轉(zhuǎn)移等惡性行為。本研究通過下調(diào)miR-21表達后，檢測結(jié)腸癌HT-29細胞功能的變化，并觀察PDCD4在蛋白及mRNA表達水平的改變，探討miR-21及PDCD4的表達在結(jié)腸癌惡性行為中的關(guān)系及機制。方法：構(gòu)建靶向miR-21的干擾質(zhì)粒simiR-21，轉(zhuǎn)染HT-29細胞后，以實時定量PCR(qRT-PCR)法檢測轉(zhuǎn)染效率，MTT法檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖變化，流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細胞調(diào)亡變化，Transwell檢測遷移及浸潤能力改變，蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)及qRT-PCR法檢測干擾后PDCD4表達水平變化。結(jié)果：經(jīng)qRT-PCR檢測simiR-21在HT-29細胞轉(zhuǎn)染效率為60%～65%，轉(zhuǎn)染效率佳；MTT顯示轉(zhuǎn)染后72、96和120 h，HT-29增殖能力減弱(t=1.276，P<0.05；t=3.276，P<0.01；t=4.523，P<0.01)；流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與si-negative control及miR-21組對比轉(zhuǎn)染后HT-29調(diào)亡率明顯增加(t=2.132，P<0.05；t=3.524，P<0.05)；Transwell結(jié)果顯示，simiR-21轉(zhuǎn)染細胞遷移能力降低(t=2.423，P<0.05；t=3.153，P<0.05)，侵襲能力降低(t=3.245，P<0.05；t=5.236，P<0.05)；Western blot檢測結(jié)果顯示，PDCD4蛋白在simiR-21細胞的表達水平明顯上調(diào)(t=2.342，P<0.05；t=4.215，P<0.05)；qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，PDCD4 mRNA在simiR-21細胞的表達水平明顯上調(diào)(t=2.261，P<0.05；t=3.492，P<0.05)。結(jié)論：simiR-21下調(diào)miR-21表達后，結(jié)腸癌HT-29細胞增殖能力受抑制，并促進其調(diào)亡，抑制遷移及浸潤能力，PDCD4上調(diào)。miR-21可能通過下調(diào)PDCD4表達促進腫瘤細胞惡性行為，可作為結(jié)腸癌治療新的靶向候選基因。

結(jié)腸癌；增殖；調(diào)亡；miR-21；HT-29

結(jié)腸癌發(fā)病率高，在惡性腫瘤中的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年快速上升趨勢，在發(fā)達國家及發(fā)展中國家更為明顯，發(fā)病越來越年輕化，在我國位居消化道惡性腫瘤致死率的第4位［1］。結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因參與的過程。miR-21是miRNAs家族成員之一，在胃癌、食管癌、卵巢癌及乳腺癌等多種腫瘤中高表達［2］，miR-21高表達與結(jié)腸癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、凋亡、遷移及浸潤等惡性行為具有正相關(guān)性［3］，但是對其分子生物學的研究相對較少。有研究認為，miR-21通過下調(diào)抑癌基因程序性死亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)的表達促進惡性腫瘤細胞的遷移及浸潤等惡性行為。PDCD4可能是miR-21直接和功能的靶分子［4］。本研究采用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)對結(jié)腸癌HT-29細胞株中miR-21基因表達進行干擾下調(diào)，旨在觀察miR-21基因表達在結(jié)腸癌細胞增殖及調(diào)亡中所起的作用，為進一步研究其功能及基因治療靶點提供試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

HT-29細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫，所有細胞采用貼壁細胞法培養(yǎng)、傳代及保留，取對數(shù)生長期細胞進行試驗。MTT試劑盒購自美國Sigma公司，miRNA isolation提取分離試劑盒、RPMI-1640、LipofectamineTM2000及TRIzol購自美國Invitrogen公司，All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒購自美國GeneCopoeia公司，Annexin V-FITC/PI試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。兔抗人PDCD4單克隆抗體購自北京中杉金橋生物制品有限公司。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并合成，simiR-21及si-negative control均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。simiR-21上游引物：5’-GATCCAUCUTCGAAGUGACTT-3’，下游引物：5’-UGCUCUTUGACGUAUGGAGTT-3’；sinegative control上游引物：5’-UUCACCGUACGU CUCACCUGT-3’，下游引物：5’-ACUGGAACC UCUCGCGGAATT-3’；PDCD4上游引物：5’-CAGTCGCATCTCGGTATCA-3’，下游引物：5’-CCGGCCGTGATGAGCGTA-3’。

1.2 研究方法

1.2.1 simiR-21及si-negative control轉(zhuǎn)染HT-29細胞

將對數(shù)生長期細胞分為3組：miR-21組、simiR-21組及si-negative control組。對simiR-21組及si-negative control組對24 h內(nèi)細胞融合達到70%～90%的細胞株依照LipofectamineTM2000試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后按照miRNA isolation提取及分離試劑盒說明書提取miRNA進行總RNA完整性檢測，應(yīng)用紫外線分光光度儀進行RNA溶解吸光度(A)值檢測(介于260～280 nm處比值)，計算RNA濃度及純度，比值為1.8～2.1者用于進一步實驗，采用實時定量PCR(qRT-PCR)對轉(zhuǎn)染后HT-29中miR-21 mRNA表達與miR-21組及si-negative control組進行對比分析，檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 qRT-PCR測定轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染后PDCD4水平

按照TRIzol試劑盒說明書步驟進行提取純化各細胞株總RNA；所有RNA樣本濃度均稀釋至1 g/L，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄-擴增試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄及擴增。RT-PCR反應(yīng)體系(2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，引物正義鏈1 μL，50×Syber Green 2 μL，cDNA 2 μL，引物反義鏈1 μL，ddH2O 4 μL)，反應(yīng)的條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸10 s，共30個循環(huán)。所有反應(yīng)均設(shè)立復孔，并以DEPC水代替模板，cDNA作為陰性對照，GAPDH為內(nèi)參照。反應(yīng)結(jié)束后進行溶解曲線分析。

1.2.3 MTT(methyl-thiazolyl-tetrazolium)法檢測轉(zhuǎn)染后HT-29細胞增殖

取各組細胞，按MTT試劑盒說明操作，以5×103細胞/孔密度于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)進行接種，設(shè)3個復孔，培養(yǎng)24、48、72、96及120 h后，每孔加5 mg/mL MTT 2μL，繼續(xù)溫育4 h，棄去上清液，加入DMSO 150 μL，振蕩溶解結(jié)晶，比色選擇570 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔A值，重復3次試驗。

1.2.4 流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后HT-29細胞調(diào)亡

轉(zhuǎn)染48 h后，取各組細胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書進行操作，上流式細胞儀，Alexa FITC最大激發(fā)波長為488 nm，最大發(fā)射波長為509 nm，PI-DNA復合物最大激發(fā)波長為535 nm，最大發(fā)射波長為615 nm，用Cell Quest進行分析。Alexa FITC為X軸，PI為Y軸，每個樣本采集10 000例，可將早期調(diào)亡細胞、晚期調(diào)亡細胞及繼發(fā)壞死細胞區(qū)分開，計算出陽性細胞百分比，重復3次試驗。

1.2.5 細胞遷移能力檢測

按TranswellRPolycarbonate Membrane Inserts試劑盒的操作步驟試驗，檢測轉(zhuǎn)染前、后HT-29細胞遷移能力的變化。在顯微鏡下取8個不同的視野(×100)進行計數(shù)，重復3次，計算每次遷移細胞減少百分比。

1.2.6 細胞侵襲能力檢測

按BioCoat Matrigel invasion chamber試劑盒說明書進行試驗，顯微鏡下取8個不同的視野(×100)進行計數(shù)，重復3次，計算侵襲細胞減少的百分比。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測simiR-21轉(zhuǎn)染后PDCD4在蛋白水平表達

按說明書提取HT-29總蛋白，BCA定量試劑盒測蛋白濃度，樣本均定量為5 g/L，每條泳道上樣10 μg 蛋白，采用12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，70 V 80 min電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗，4 ℃溫育過夜。TBST洗膜，加入二抗室溫溫育1.5 h，TBST清洗后ECL發(fā)光，凝膠顯像儀顯像。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用PASW Statistics 18.0軟件進行作圖及統(tǒng)計分析，計量資料采用±s表示，率的比較采用χ2檢驗，qRT-PCR結(jié)果采用GraphPad Prism 6.0進行ONE WAY ANOVA分析及作圖，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率

2.1.1 總RNA濃度測定

用DEPC水調(diào)零后，取1.5 μL樣本在ND-1000全波長紫外/可見光掃描分光光度計測樣臺上進行測量，記錄A260/A280值及濃度，結(jié)果顯示，總RNA樣本A260/A280值為1.8～2.0，RNA純度較高，無DNA、蛋白質(zhì)等污染，濃度在100～1 458.2 μg/μL。

2.1.2 總RNA完整性檢測

取RNA樣本1 μL，1%瓊脂凝膠電泳80 V 20 min，EB染色10 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。結(jié)果顯示，總RNA 5sRNA、18sRNA及28sRNA條帶完整，總RNA抽取比較完整(圖1)。

圖1 總RNA完整性檢測Fig. 1 Detecting the integrity of total RNA

2.1.3 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，simiR-21轉(zhuǎn)染后與si-negative control組及miR-21組對比，HT-29細胞miR-21在mRNA水平表達量明顯降低(t=2.542，P<0.05)，干擾效果明顯，沉默效率為60%～65%(圖2)。

圖2 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-21在mRNA水平表達Fig. 2 miR-21 mRNA expression detecting by qRT-PCR

2.2 simiR-21轉(zhuǎn)染后PDCD4在mRNA水平及蛋白水平的表達

Western blot檢測結(jié)果顯示，在52×103處有灰色調(diào)帶顯示，PDCD4蛋白在simiR-21細胞的表達量明顯高于miR-21細胞及si-negative control細胞(t=2.342，P<0.05；t=4.215，P<0.05，圖3A)；qRT-PCR結(jié)果顯示，PDCD4 mRNA在simiR-21細胞的表達水平明顯高于miR-21細胞及si-negative control細胞(t=2.261，P<0.05；t=3.492，P<0.05，圖3B)。

2.3 MTT檢測simiR-21干擾后HT-29細胞的增殖改變

通過采集0、24、48、72、96、120 h時間點的數(shù)據(jù)，simiR-21、miR-21與si-negative control細胞增殖率，72 h分別為：(41.7±14.6)%、(59.3±6.3)%、(58.3±3.2)%；96 h分別為：(43.6±15.4)%、(77.2±8.2)%、(78.5±7.3)%；120 h分別為：(49.6±16.4)%、(81.9±4.6)%、(85.2±3.8)%。simiR-21干擾后HT-29細胞增殖能力受到抑制，在72、96及120 h差異均具有統(tǒng)計學意義(t=1.276，P<0.05；t=3.276，P<0.01；t=4.523，P<0.01，圖4)。

圖3 simiR-21轉(zhuǎn)染前、后PDCD4在蛋白水平(A)及mRNA水平的變化(B)Fig. 3 PDCD4 expression at protein level (A) and mRNA level(B) after simiR-21 transfection

圖4 MTT檢測轉(zhuǎn)染后HT-29細胞增殖Fig. 4 HT-29 proliferation after transfection detecting by MTT

2.4 流式細胞儀檢測simiR-21干擾后HT-29細胞調(diào)亡改變

simiR-21、miR-21與si-negative control各組細胞凋亡率分別為32.74%、10.16%及14.98%，simiR-21與si-negative control及miR-21組對比，HT-29細胞調(diào)亡率增高，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.132，P<0.05；t=3.524，P<0.05，圖5)。

2.5 simiR-21轉(zhuǎn)染后細胞遷移能力檢測

Transwell結(jié)果顯示，simiR-21轉(zhuǎn)染細胞與si-negative control轉(zhuǎn)染細胞及miR-21細胞遷移減少百分比對比，明顯降低HT-29細胞的遷移能力(t=2.423，P<0.05；t=3.153，P<0.05，圖6A)。

2.6 simiR-21轉(zhuǎn)染后細胞侵襲能力檢測

與si-negative control及miR-21組對比，HT-29細胞的侵襲能力在simiR-21轉(zhuǎn)染后明顯降低(t=3.245，P<0.05；t=5.236，P<0.05，圖6B)。

圖5 流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后HT-29細胞調(diào)亡Fig. 5 HT-29 apoptosis after transfection detected si-negative control by flowcytometry

圖6 轉(zhuǎn)染后遷移及侵襲檢測Fig. 6 Migration and invasion after transfection

3 討 論

結(jié)腸癌至發(fā)現(xiàn)時瘤體一般較大，因此多以貧血或急性腸梗阻為首發(fā)癥狀，首診時腫瘤已發(fā)展較晚，也是較容易被忽略的腫瘤之一［5］。對于結(jié)腸癌惡性生長行為的研究一直是熱點，微小RNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性小片段的非編碼RNA的調(diào)控因子，長度21個核苷酸左右，定位于17p23.2染色體，由72nt莖環(huán)樣結(jié)構(gòu)前體剪切加工成熟的具有自主轉(zhuǎn)錄單位的miRNA組成，其在腫瘤發(fā)展中的作用為癌基因或抑癌基因樣作用［6］。miR-21是miRNAs家族成員之一，在胃癌、乳腺癌及卵巢癌等腫瘤中高表達，并作為肺癌判斷預后的標志物［7-8］。

miR-21在結(jié)腸癌細胞中的研究目前報道較少［4］。有研究認為，miR-21過表達會下調(diào)PDCD4表達，PDCD4是抑癌基因，PDCD4蛋白在細胞凋亡所需新生大分子復合物之一，在細胞凋亡中增量調(diào)節(jié)。PDCD4及miR-21在胃癌及乳腺癌中具有相關(guān)性。

本研究采用siRNA技術(shù)成功構(gòu)建simiR-21，并轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HT-29細胞，經(jīng)qRT-PCR證明沉默效率達到60%以上，siRNA干擾技術(shù)在腫瘤細胞功能研究方面是成熟、便捷、有效及低成本的［9-10］。MTT顯示，miR-21下調(diào)表達72 h以后，HT-29細胞增殖能力明顯下降，在96及120 h時，simiR-21對HT-29細胞增殖的抑制更為明顯，與未下調(diào)組相比，差異具有統(tǒng)計學意義，miR-21基因編碼的蛋白產(chǎn)物可以造成DNA受損，促進細胞周期停滯于G1期，具有重要的促癌功能［11］。有研究顯示，miR-21基因高表達的結(jié)直腸癌中，緊密連接蛋白(ZO-1)及上皮鈣黏蛋白(E-cad)表達降低、神經(jīng)鈣黏蛋白(N-cad)及轉(zhuǎn)錄因子Slug的表達升高，第10號染色體上同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)表達量顯著降低、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表達升高，提示miR-21對人結(jié)直腸癌細胞EMT的發(fā)生有促進作用，并誘發(fā)細胞遷移和侵襲，其機制可能與下調(diào)PTEN蛋白表達、激活PI3K/Akt通路，從而促進EMT有關(guān)［12-13］。PTEN是PI3K/Akt信號通路中重要靶基因之一，miR-21可能通過下調(diào)PDCA4表達，從而抑制PTEN信號傳遞實現(xiàn)對結(jié)腸癌惡性行為的調(diào)控。

本研究顯示，通過流式細胞儀檢測，simiR-21干擾后，HT-29細胞株凋亡率明顯升高，并以早期凋亡為主，miR-21高表達可能抑制腫瘤細胞凋亡，對其基因進行敲除后結(jié)腸癌細胞凋亡增加。miR-21高表達會下調(diào)PDCD4表達，通過PI3K/Akt信號通路抑制結(jié)腸癌細胞凋亡，PDCD4高表達會加速結(jié)腸癌細胞凋亡，miR-21基因敲除后PDCD4表達上調(diào)，說明miR-21對PDCD4表達具有調(diào)控作用。miR-21通過與靶基因3’端非翻譯區(qū)的不完全配對抑制靶基因mRNA的翻譯或降解，從而參與細胞分化、增殖、發(fā)育、凋亡及代謝等生物過程［14］。遺傳或表觀遺傳改變、miRNA加工相關(guān)基因及相關(guān)蛋白異常變化是miRNA表達異常的主要原因［15］。遺傳改變是指染色體的異常，大部分miR-21位于脆性位點，因此，常常與癌變相關(guān)［16］。miR-21可能通過抑制人10號染色體缺失磷酸酶或PTEN、PDCD4及TPMI等抑癌基因作用而促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展，因此miR-21可能具有原癌基因的作用［17］。一部分腫瘤中的miR-21具有誘導細胞凋亡，抑制細胞轉(zhuǎn)移及浸潤的作用，在不同腫瘤中，miR-21可能扮演著抑癌基因及促癌基因的雙重作用。miR-21下調(diào)后，PDCD4明顯上調(diào)，PDCD4可能接受miR-21作用，如果miR-21高表達，PDCD4表達水平下降，癌細胞遷移及浸潤能力提高［18］。

與miR-21促進結(jié)腸癌細胞增殖，抑制其凋亡相關(guān)的基因及通道蛋白有抑制或促進細胞分裂、增殖、遷移及凋亡等功能［19］。本研究顯示，通過對miR-21基因的敲除，對結(jié)腸癌細胞的惡性行為具有抑制作用，這種抑制作用可能是由于對PDCD4表達水平的上調(diào)而引起的，miR-21可以作為結(jié)腸癌診斷及預后分析的標志物，也可能成為治療的靶點［20-21］。

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Silencing of miR-21 influences the function of colon cancer cell line HT-29 and the expression of PDCD4

REN Yupeng, SONG Chun, ZHANG Hao (Department of Colorectal Surgery, Liaoning Cancer Hospital and Institute, Shenyang Liaoning 110042, China)

REN Yupeng E-mail: pangheshangmomo@163.com

Background and purpose:PDCD4 may be inhibited by miR-21 to regulate the malignant behaviors of colon cancer such as invasion and migration. This study aimed to explore the function of colon cancer HT-29 cell lines by downregulating miR-21 expression and discuss the mechanisms and relationship between miR-21 and PDCD4 in colon cancer malignant behaviors.Methods:simiR-21 was transfected into colon cancer cell line HT-29 to downregulate the expression of miR-21. Proliferation, apoptosis, migration and invasion were detected by MTT, flow cytometry and Transwell assay after transfection. PDCD4 expression was detected by Western blot and qRTPCR.Results:The qRT-PCR analysis result proved that the transfection efficiency was 60%-65%. MTT analysis result showed that the proliferations of HT-29 cells were inhibited after the transfection of miR-21 for 72, 96, 120 h (t=1.276, P<0.05; t=3.276, P<0.01; t=4.523, P<0.01). Comparing with si-negative control and miR-21 groups, flow cytometry result showed that the apoptosis rate was increased after miR-21 expression downregulated (t=2.132, P<0.05; t=3.524, P<0.05). Transwell assay result showed that migration (t=2.423, P<0.05; t=3.153, P<0.05) and invasion(t=3.245, P<0.05; t=5.236, P<0.05) were inhibited; Western blot result showed that PDCD4 expression was up-regulated at protein level(t=2.342, P<0.05; t=4.215, P<0.05); qRT-PCR result showed that PDCD4 expression was up-regulated at mRNA level(t=2.261, P<0.05; t=3.492, P<0.05).Conclusion:The proliferation, migration and invasion are the inhibited, and apoptosis is attenuated after miR-21 downregulated by simiR-21 transfection, PDCD4 expression is up-regulated. miR-21 may enhance the malignant behavior of cancer cells by downregulating the PDCD4 expression, miR-21 might be a target gene for colon cancer therapy.

Colon cancer; Proliferation; Apoptosis; miR-21; HT-29

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.01.002

R735.53+

A

1007-3639(2015)01-0006-07

2014-10-07

2014-11-25）

任宇鵬 E-mail:pangheshangmomo@163.com