魏靜萍

云南省紅河州蒙自市芷村鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南芷村 661102

豬沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

魏靜萍

云南省紅河州蒙自市芷村鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南芷村 661102

從豬糞中分離引起仔豬副傷寒的病原菌并對該病原菌進(jìn)行鑒定和藥物敏感性測定。通過細(xì)菌培養(yǎng)、形態(tài)鑒定、生理生化試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)，并參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》鑒定得到引起仔豬副傷寒的病原菌為甲型副傷寒沙門氏菌。通過藥敏試驗(yàn)，得到該分離菌對頭孢噻吩（抑菌圈24 mm）和頭孢唑啉（抑菌圈18 mm）敏感性最強(qiáng)；最不敏感的是諾氟沙星（抑菌圈為3 mm）。

甲型副傷寒沙門氏菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

沙門氏菌廣泛分布于自然界中，?？稍诟鞣N動物，如豬、牛、羊、馬等家畜及雞、鴨、鵝等家禽，飛鳥鼠類等野生動物的腸道中發(fā)現(xiàn)。雞是沙門氏菌最大的儲存宿主，各種年齡的畜禽均可感染，但幼年畜禽較易感。如豬以1～4月齡仔豬發(fā)病較多，羊以斷乳或斷乳不久羊最易感，感染的孕畜多發(fā)生流產(chǎn)[1]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病料采自蒙自市芷村鎮(zhèn)某規(guī)?；B(yǎng)殖場。將發(fā)病豬只的糞便無菌采集后帶回試驗(yàn)室保存在4℃的冰箱中備用。

1.2 培養(yǎng)基

1）普通培養(yǎng)基。牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH 7.1～7.4。

2）三糖鐵培養(yǎng)基。蛋白胨20 g，牛肉浸粉5 g，氯化鈉5 g，乳糖10 g，葡萄糖1 g，蔗糖10 g，酚紅0.025 g，硫酸亞鐵0.2 g，硫代硫酸鈉0.2 g，瓊脂12 g。

3）明膠液化培養(yǎng)基。蛋白胨5 g，明膠100～150 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

4）檸檬酸鹽培養(yǎng)基。檸檬酸鈉0.2 g，K2HPO40.05 g，NH4NO30.2 g，瓊脂1.5～2.0 g，1%酒精溶液，水100 mL。

1.3 主要試劑

1）結(jié)晶紫。溶液A：結(jié)晶紫2.5 g，95%乙醇25 mL。溶液B：草酸銨1.0 g，蒸餾水100 mL。

將結(jié)晶紫研細(xì)后，加入95%乙醇使之溶解，配成A液；將草酸銨溶于蒸餾水配成B液，兩液混合即成。

2）盧哥氏碘液。碘1.0 g，碘化鉀2.0 g，蒸餾水300 mL。

先將碘化鉀溶解在一小部分的蒸餾水中，再將碘溶解在碘化鉀溶液中，然后加入其余的蒸餾水即成。

3）番紅染色液。番紅2.0 g，蒸餾水100 mL。

4）甲基紅指示劑。甲基紅0.02 g，95%乙醇60 mL，水40 mL。配時先將甲基紅溶于乙醇后再加水。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及純化

先將采來的病料涂片，革蘭氏染色后，初步檢驗(yàn)是否有沙門氏菌。再進(jìn)行前增菌和選擇性增菌，然后將選擇性增菌的菌液劃線接種到分離培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，染色后挑取革蘭氏染色為紅色、短桿狀的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。重復(fù)上述步驟，直至革蘭氏染色鏡檢細(xì)菌形態(tài)一致。

1.4.2 細(xì)菌形態(tài)鑒定

1）革蘭氏染色。首先圖片固定：在載玻片上制薄的涂面，讓涂片自然晾干或通過火焰2～3次固定；其次結(jié)晶紫染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細(xì)菌涂面）的結(jié)晶紫染色液染色1 min，傾去染色液，用水小心地沖洗；再次媒染：滴加革蘭氏碘液，媒染1 min后用水洗去碘液，再將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇通過涂面脫色20～25 s至流出液無色，立即水洗；最后復(fù)染：滴加番紅復(fù)染3～5 min，用水洗去涂片上的番紅染色液，將染好的涂片放空氣中晾干或用吸水紙吸干即可。

2）鏡檢。挑選形態(tài)典型的單個菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，放到顯微鏡下觀察，菌體被革蘭氏染色染成紫色的為陽性，染成紅色的為陰性。

1.4.3 生理生化鑒定

將分離得到的革蘭氏染色為陰性細(xì)菌做各種糖發(fā)酵試驗(yàn)。再進(jìn)一步做生化試驗(yàn)，如過氧化氫試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、乙酰甲基醇試驗(yàn)、苯丙氨酸試驗(yàn)等。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》來確定所屬的種。

1.4.4 藥敏試驗(yàn)

將培養(yǎng)好的細(xì)菌用涂布法涂在培養(yǎng)皿上，并把各種藥敏片做標(biāo)記后放在該培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)24 h之后觀察結(jié)果。觀察抑菌圈的大小，用抑菌圈大小判定各種藥敏片對細(xì)菌的敏感程度。

1.4.5 菌種保存鑒定

將分離到的甲型副傷寒沙門氏菌球菌，經(jīng)普通的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，按菌液∶20%甘油=1∶1的比例混合，置于-20℃的冰箱中。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征

在煌綠磺胺嘧啶培養(yǎng)基上，菌落為圓形，平板形成濕潤、表面光滑、邊緣整齊、呈淡黃色透明的、中央有凸起的菌落，同時在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的顏色由紅色變成了黃色（圖1）。沙門氏菌在顯微鏡下一般觀察到的是呈桿狀的，兩端成橢圓形的，經(jīng)革蘭氏染色后為紅色，是革蘭氏陰性（圖2）。

圖1 甲型副傷寒沙門氏菌體菌落圖

圖2 甲型副傷寒沙門氏菌菌體形態(tài)圖

所分離沙門氏菌的形態(tài)特征：菌落直徑約在0.5～1.5 mm之間，凸起，圓形，光滑，淡黃色，細(xì)菌為圓形，通常都以周身鞭毛運(yùn)動、無芽孢、無莢膜的直桿菌。

2.2 病原菌屬特性的分析與鑒定

對從豬糞中分離得到的病原菌進(jìn)行屬的鑒定，由表1可以看出，過氧化氫酶試驗(yàn)為陽性，革蘭氏染色試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、乙酰甲基醇試驗(yàn)、本丙氨酸試驗(yàn)等均為陰性，根據(jù)形態(tài)特征和常規(guī)的生理生化鑒定結(jié)果，試驗(yàn)分離出的細(xì)菌確定為沙門氏菌屬。

表1 分離細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 病原菌發(fā)酵特性的分析

將分離得到的沙門氏菌屬的菌株，做進(jìn)一步的糖發(fā)酵試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行種的鑒定，可得出所分離的沙門氏菌是甲型副傷寒沙門氏菌。

表2 分離株的糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

表3 藥敏試驗(yàn)抑菌圈的平均直徑 mm

表4 藥敏試驗(yàn)敏感度分析

2.4 病原菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

參照美國臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會1994年制定的抗生素敏感度判斷標(biāo)準(zhǔn)（NCCLS1994）判斷抑菌結(jié)果。抑菌圈直徑＞15 mm為高敏感度抑菌作用，用“+++”表示；10 mm＜抑菌圈直徑＜15 mm為中敏感度抑菌作用，用“++”表示；抑菌圈直徑＜10 mm為低敏感度抑菌作用，用“＋”表示；抑菌圈直徑＜5 mm的為無抑菌作用，用“－”表示。

由表3可知，分離的到的沙門氏菌對頭孢唑啉和頭孢噻吩敏感度高，對苯唑西林和甲氧芙啶中度敏感，對于四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、青霉素和萬古霉素敏感度低，而對于若氟沙星不敏感。評估結(jié)果見表4。

3 討 論

3.1 分離培養(yǎng)基的選擇

從不同的基質(zhì)中分離沙門氏菌時，據(jù)沙門氏菌的生長環(huán)境條件以及它在不同培養(yǎng)基上生長的情況進(jìn)行培養(yǎng)基各種組分的選擇。對于沙門氏菌的分離，較多的人是選擇麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌[2]。在SS瓊脂平板培養(yǎng)基上可觀察到無色半透明菌落，部分菌落中間帶黑色，在麥康凱培養(yǎng)基上觀察到菌落呈透明無色、圓形凸起、濕潤的菌落。本試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基是煌綠磺胺嘧啶瓊脂培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基上可以觀察到表面光滑、邊緣整齊、呈淡黃色透明的、中央有凸起的菌落，最主要的是在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的顏色由紅色變成了黃色，這是沙門氏菌培養(yǎng)最顯著的特點(diǎn)。

3.2 細(xì)菌的分離鑒定

細(xì)菌的分離鑒定方法很多，可以是常規(guī)的細(xì)菌分離鑒定，也可以是分子生物學(xué)的鑒定，包括DNA測定、PCR技術(shù)、血清鑒定等現(xiàn)代技術(shù)。較多的人是采用分子鑒定方法，PCR技術(shù)對檢測豬沙門氏菌具有特異性高、靈敏、快速等特點(diǎn)，適用于快速、準(zhǔn)確地檢測豬傷寒沙門氏菌，是一種快速簡便、靈敏特異檢測沙門氏菌的方法[3]。用PCR技術(shù)檢測豬個體中的傷寒沙門氏菌，結(jié)果具有高度的特異性和敏感性。但唯一的缺點(diǎn)是得不到純培養(yǎng)的細(xì)菌[4]。本試驗(yàn)是用常規(guī)細(xì)菌分離鑒定方法，這一方法包括了前增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)6個步驟。該方法是目前世界各國普遍接受的標(biāo)準(zhǔn)方法，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，同時得到純培養(yǎng)的細(xì)菌。

3.3 分離菌的耐藥性

甲型副傷寒沙門氏菌為臨床常見致病菌，致病具有一定的流行性，一旦流行暴發(fā)，危害極大。目前抗菌藥物種類繁多，使用量大，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性日趨嚴(yán)重。較多數(shù)人做的藥敏試驗(yàn)是采用頭孢噻肟、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、哌拉西林、氨芐西林、氯霉素、復(fù)方新諾明、氨芐西林、阿莫西林等。其結(jié)果是甲型副傷寒沙門菌對三代頭孢菌素（頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟）100%敏感。對喹諾酮類（氧氟沙星、環(huán)丙沙星）100%敏感。對復(fù)方新諾明93.6%敏感。對氯霉素和氨芐西林、氨芐西林／舒巴坦、阿莫西林／棒酸等高度敏感[5-7]。本研究主要是對頭孢唑啉、頭孢噻吩、苯唑西林、甲氧芙啶、四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、青霉素、萬古霉素、若氟沙星等進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果是分離得到的沙門氏菌對頭孢唑啉和頭孢噻吩敏感度高，對苯唑西林和甲氧芙啶為中度敏感，對于四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、青霉素和萬古霉素敏感度低，而對諾氟沙星最不敏感。因此，臨床醫(yī)生在進(jìn)行藥物治療前，應(yīng)該根據(jù)本地區(qū)目前的藥敏試驗(yàn)情況選用抗菌藥物，應(yīng)盡快采集標(biāo)本作細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)，以便為治療提供可靠依據(jù)。

4 結(jié) 論

4.1 沙門氏菌分離結(jié)果

本試驗(yàn)是采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生理生化特點(diǎn)，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》鑒定出從病料中分離出來的沙門氏菌，并根據(jù)各種生理生化試驗(yàn)鑒定出它是致病性甲型副傷寒沙門氏菌。

4.2 沙門氏菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)本試驗(yàn)的藥敏片產(chǎn)生的抑菌圈的大小知道，頭孢唑啉和頭孢噻吩的抑菌圈最大，敏感度高；苯唑西林和甲氧芙啶的抑菌圈在10～15 mm之間，中度敏感；萬古霉素、紅霉素、青霉素、氯霉素、四環(huán)素的抑菌圈在5～10 mm之間，敏感度低；若氟沙星的抑菌圈在5 mm以下，最不敏感。

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科學(xué)選擇抗寒飼料助生豬抵抗嚴(yán)寒

在低溫季節(jié)，適當(dāng)增喂一些抗寒飼料，可以加強(qiáng)生豬機(jī)體新陳代謝，增強(qiáng)體質(zhì)，提高抗病力，緩解寒應(yīng)激，從而促進(jìn)豬的生長發(fā)育。常用的抗寒飼料有如下幾種。

酒糟類。包括白酒糟和啤酒糟，除含有豐富的蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)外，還含有一定數(shù)量的乙醇，熱性大，通常稱之為“火性飼料”，有改善消化功能、加強(qiáng)血液循環(huán)、擴(kuò)張體表血管、產(chǎn)生溫暖感覺等作用。冬季應(yīng)用，抗寒應(yīng)激作用明顯。兩者因?qū)μ杭靶坌怨δ苡胁焕绊?，故不宜用于懷胎母畜及種公畜。

根皮類。蔬菜根皮中含有可產(chǎn)生御寒作用的礦物質(zhì)，用作飼料時，可增強(qiáng)養(yǎng)殖動物的抗寒能力。芹菜根、芫荽根、菠菜根、白菜根等蔬菜下腳料，以及胡蘿卜、馬鈴薯、甘薯等塊根，都可以用作御寒飼料。使用這類飼料時，一定要注意保留其外皮。

糧食類。黃豆性溫味甘，炒用性熱，屬暖性飼料，含粗蛋白質(zhì)37.90%，既是優(yōu)良的植物蛋白飼料，又是抗寒保暖飼料。黑豆含粗蛋白質(zhì)36.68%，性平味甘，炒用性極熱，是較好的抗寒保暖飼料。大麥性溫味咸，屬暖性飼料，熟用效果好。另外，稻谷、稻草也屬于暖性飼料。

肉食類。羊肉和狗肉產(chǎn)熱量高，是冬季肉食性和雜食性畜禽首選的保暖抗寒飼料。動物肝臟含鐵較多（動物缺鐵時特別怕冷），且易于吸收，冬季給畜禽適當(dāng)增喂一些動物肝臟，可以補(bǔ)鐵、御寒。淡水蝦性溫味甘，屬高熱量飼料，有補(bǔ)腎壯陽、強(qiáng)化雄性功能之效，適用于冬季體衰怕冷的動物，無鹽鮮蝦可直接應(yīng)用，鹽漬干蝦需水浸去鹽后應(yīng)用。

來源：農(nóng)民日報

2015-01-12

魏靜萍，女，1978年生，獸醫(yī)師。