金 蕾，孫愛華，胡瑋琳，葛玉梅，林旭璦

甲型副傷寒沙門菌ompN基因原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建及其產(chǎn)物免疫保護(hù)作用

金 蕾1，孫愛華2，胡瑋琳1，葛玉梅1，林旭璦1

目的 了解甲型副傷寒沙門菌外膜蛋白o(hù)mpN基因攜帶率及其重組表達(dá)產(chǎn)物抗原性和免疫保護(hù)作用。方法 采用PCR擴(kuò)增甲型副傷寒沙門菌參考標(biāo)準(zhǔn)株50001及126株臨床菌株ompN基因并測序。構(gòu)建ompN基因原核表達(dá)系統(tǒng)，Ni-NTA親和層析法提取目的重組蛋白rOmpN。采用家兔免疫法和ELISA檢測rOmpN免疫原性。微量肥達(dá)試驗(yàn)和激光共聚焦顯微鏡法分別檢測OmpN在甲型副傷寒沙門菌株中表達(dá)率及其膜定位。采用小鼠感染模型了解rOmpN對甲型副傷寒沙門菌致死性感染的免疫保護(hù)作用。結(jié)果 所有甲型副傷寒沙門菌株中均擴(kuò)增出全長ompN基因片段，其核苷酸和氨基酸序列相似性分別高達(dá)98.6%～99.9%和98.7%～100%。OmpN是甲型副傷寒沙門菌跨膜蛋白。ompN基因表達(dá)系統(tǒng)能表達(dá)rOmpN，免疫家兔后能產(chǎn)生高效價(jià)抗血清。98.2%(55/56)甲型副傷寒病人血清標(biāo)本中rOmpN-IgG陽性，rOmpN兔抗血清能有效凝集甲型副傷寒沙門菌。100和200 μg rOmpN對感染小鼠的免疫保護(hù)率分別為60.0%(9/15)和73.3%(11/15)。結(jié)論 甲型副傷寒沙門菌ompN基因分布廣泛且序列保守， rOmpN有較強(qiáng)的抗原性和免疫保護(hù)作用。

甲型副傷寒沙門菌；ompN基因；重組表達(dá)；抗原性；免疫保護(hù)性

傷寒和副傷寒是我國重點(diǎn)監(jiān)控的消化道傳染性疾病[1]。早年我國人群中傷寒沙門菌(Salmonellatyphi)感染引起的傷寒發(fā)病率較高，但近年我國不少地區(qū)甲型副傷寒沙門菌(S.paratyphiA)感染引起的甲副傷寒發(fā)病率顯著增高，江蘇、云南、江西、廣西和浙江等地區(qū)甚至出現(xiàn)甲副傷寒暴發(fā)流行[2-5]。北美、歐洲尤其是東南亞地區(qū)近年甲副傷寒病例也顯著增加，故甲副傷寒的流行被認(rèn)為是當(dāng)前人類面臨的重要公共衛(wèi)生問題之一[6-9]。

傷寒和副傷寒多價(jià)全菌死疫苗因副作用較大早已停用，近年我國使用傷寒沙門菌莢膜多糖抗原制備的Vi疫苗進(jìn)行預(yù)防接種。由于甲型副傷寒沙門菌不產(chǎn)生莢膜，故Vi疫苗對該菌感染無保護(hù)作用[9-11]。因此，研發(fā)甲副傷寒疫苗對于預(yù)防和控制甲副傷寒流行均具有重要意義[12]。本研究中我們檢測了ompN基因在甲型副傷寒沙門菌臨床菌株中的攜帶和表達(dá)率，構(gòu)建了ompN基因原核表達(dá)系統(tǒng)并檢測了表達(dá)的目的重組蛋白rOmpN免疫原性及其對感染小鼠免疫保護(hù)作用，以期為rOmpN作為甲型副傷寒多價(jià)基因工程疫苗候選抗原提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和血清標(biāo)本 甲型副傷寒沙門菌參考標(biāo)準(zhǔn)株50001購自北京中國藥品生物制品檢定研究院。126株甲型副傷寒沙門菌臨床菌株、56份甲副傷寒病人恢復(fù)期血清分別由浙江省寧波市、溫嶺市和杭州市疾病預(yù)防控制中心提供，15份微量肥達(dá)試驗(yàn)結(jié)果陰性的健康體檢者血清由浙江省新華醫(yī)院提供。

1.2ompN基因擴(kuò)增及測序 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Axygen)提取上述甲型副傷寒沙門菌基因組DNA，紫外分光光度法測定其濃度[13]。根據(jù)GenBank中甲型副傷寒沙門菌ATCC9150株ompN基因序列(accession No.：CP000026)及其限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)分析結(jié)果[14]，設(shè)計(jì)PCR引物并由上海Invitrogen公司合成。上游引物：CGC CAT ATG (Nde I) atg aaa aga aaa gta ttg gca-3′，下游引物：CGC CTC GAG (Xho I) gaa ctg gta aac cat acc cag-3′。以100 ng甲型副傷寒沙門菌DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增全長ompN基因片段，反應(yīng)參數(shù)：94 ℃5 min；94 ℃30 s、52 ℃30 s、72 ℃60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)溴乙錠預(yù)染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳法檢查后，采用T-A克隆試劑盒(TaKaRa)將其克隆入pMD-19-T中形成重組質(zhì)粒pMD-19-TompN，委托上海Invitrogen公司測序。采用BLAST軟件比對不同甲型副傷寒沙門菌株ompN基因核苷酸和氨基酸序列相似性。

1.3ompN基因原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建及鑒定 甲型副傷寒沙門菌50001株pMD-19-TompN與原核表達(dá)載體pET42a(Novagen)用Nde I和Xho I(TaKaRa)雙酶切，回收目的條帶后用紫外分光光度法測定其濃度[13]。300～500 ng的ompN基因片段與100 ng線性化 pET42a混合，在T4 DNA連接酶(TaKaRa)作用下形成重組表達(dá)載體pET42aompN。采用CaCl2法將pET42aompN轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌E.coliBL21DE3(Novagen)形成工程菌株E.coliBL21DE3pET42a-ompN [13]。該菌株接種于含50 μg/mL卡那霉素(Kan)LB平板(Oxoid)上37℃培養(yǎng)18 h，挑取白色菌落在Kan-LB培養(yǎng)液中37°C振蕩培養(yǎng)4～6 h增菌，用細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen)提取 pET42aompN后再次測序。

1.4 rOmpN表達(dá)與提純E.coliBL21DE3pET42a-ompN接種于Kan-LB培養(yǎng)液(Oxoid)中，37 ℃振蕩培養(yǎng) 2 h，加入0.5 mmol/L IPTG(Sigma)后30 ℃振蕩培養(yǎng)4～6 h，以誘導(dǎo)rOmpN表達(dá)。采用Ni-NTA 親和層析柱(BioColor)提取表達(dá)的rOmpN，BCA蛋白定量試劑盒(Beyotime Biotech)和SDS-PAGE分別檢測其濃度和純度[13]。

1．5 rOmpN抗血清制備 1 mg rOmpN與弗氏完全佐劑混合后皮內(nèi)多點(diǎn)免疫家兔4 次，每次間隔一周，末次免疫后兩周采集心血并分離血清，采用免疫擴(kuò)散法測定其效價(jià)。

1．6 OmpN膜結(jié)構(gòu)分析與定位 根據(jù)測序結(jié)果用TMHMM Server v. 2.0軟件分析ompN基因產(chǎn)物的膜結(jié)構(gòu)。采用1∶500稀釋的rOmpN兔抗血清為一抗、1∶2 000稀釋的Alexa-Fluor568標(biāo)記羊抗兔IgG(Invitrogen)為二抗，采用激光共聚焦顯微鏡法檢測甲型副傷寒沙門菌50001株OmpN的膜定位，實(shí)驗(yàn)中以正常兔血清為對照。

1．7 微量肥達(dá)試驗(yàn) 常規(guī)離心收集新鮮培養(yǎng)的甲型副傷寒沙門菌50001株及其126株臨床菌株并懸于0.01 mol/L PBS(pH7.4)中，用比濁法配制成1.5×108的細(xì)菌懸液。將0.25 mL細(xì)菌懸液與0.25 mL 1∶5、1∶25或1∶50稀釋的rOmpN兔抗血清混勻，37 ℃孵育過夜，若50%細(xì)菌被凝集判為陽性[15]。實(shí)驗(yàn)中采用正常兔血清作為對照。

1．8 ELISA 96孔酶標(biāo)板中每孔加入0.01 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.3)配制的10 μg/mL rOmpN溶液0.1 mL，4 ℃包被過夜。次日吸棄各孔液體，用0.5% Tween 20-PBS洗板3次，加入10%小牛血清-PBS 37 ℃封閉1 h，按上法再次洗板。分別以1∶100或1∶500稀釋的甲型副傷寒恢復(fù)期病人血清為一抗、1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗人IgG(Invitrogen)為二抗、OPD為底物，顯色后用酶標(biāo)儀(Bio-Rad)檢測各孔OD450值。實(shí)驗(yàn)中以相同稀釋度的15份微量肥達(dá)試驗(yàn)結(jié)果陰性健康體檢者血清OD450均值+3SD為cut-off值，病人血清標(biāo)本OD450值大于cut-off值者判為陽性[15]。

1．9 小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn) 將體重(19±1)g清潔級BALB/c小鼠分為5 組，每組10只，分別腹腔注射不同濃度甲型副傷寒桿菌50001株懸液0.5 mL，觀察7 d，以獲得100%最低致死量(MLD)。將BALB/c小鼠分為3組，每組15只，頸背部皮下分別注射100或200 μg rOmpN與1 mg氫氧化鋁佐劑(Sigma)混合物(試驗(yàn)組)或200 μg牛血清白蛋白(BSA，Sigma)與1 mg氫氧化鋁混合物(對照組)，間隔一周后按上法再次免疫[1,16]。末次免疫后2周，每只小鼠腹腔注射2倍100%MLD甲型副傷寒桿菌50001株進(jìn)行攻擊，觀察并記錄7 d內(nèi)動物死亡情況。

2 結(jié) 果

2．1ompN基因攜帶率及其序列分析結(jié)果 甲型副傷寒沙門菌50001株及其126株臨床菌株DNA中均能擴(kuò)增出全長ompN基因片段(圖1)，各菌株ompN基因核苷酸和氨基酸序列相似性分別高達(dá)98.6%～99.9%和98.7%～100%。

2．2 rOmpN表達(dá)及提純效果 在0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下，E.coliBL21DE3pET42a-ompN能有效表達(dá)rOmpN，Ni-NTA 親和層析法提取的rOmpN在分離膠中顯示為單一的蛋白條帶(圖2)。

2.3 OmpN膜定位 膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，OmpN為跨膜蛋白，除N端約25個(gè)氨基酸殘基序列分別位于甲型副傷寒沙門菌膜內(nèi)或跨膜外，其余均位于膜外(圖3)。激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示，OmpN定位于甲型副傷寒沙門菌表面(圖4)。

2.4 rOmpN免疫原性及OmpN表達(dá)率 rOmpN免疫家兔后能產(chǎn)生高效價(jià)血清抗體，該抗血清與rOmpN免疫擴(kuò)散效價(jià)高達(dá)1∶16。ELISA檢測結(jié)果顯示，1∶100(cut-off值0.225)或1∶500(cut-off值0.156)稀釋的甲副傷寒病人血清標(biāo)本rOmpN-IgG陽性率分別為98.2%(55/56)和92.8%(55/56)。

M：DNA marker；1：空白對照；2-6：分別為甲型副傷寒沙門菌50001參考標(biāo)準(zhǔn)株和4株甲型副傷寒沙門菌臨床代表株ompN基因擴(kuò)增條帶

Lane M: DNA marker; Lane 1: blank control; Lanes 2-6: the amplification fragments ofompNgene from reference standard strain 50001 and four representative clinical strains ofS.paratyphiA.

圖1 甲型副傷寒沙門菌ompN基因PCR檢測結(jié)果

Fig.1 PCR detection result ofompNgene inS.paratyphiA strains

M：蛋白 marker；1：野生型pET42a空白對照；2和3：分別為表達(dá)和提純的rOmpN

Lane M: protein marker; Lane 1: blank control of wild-type pET42a; Lanes 2 and 3: expressed and extracted rOmpN, respectively.

圖2 甲型副傷寒沙門菌rOmpN表達(dá)及提取效果

Fig.2 Effects of rOmpN expression and extraction ofS.paratyphiA

圖3 甲型副傷寒沙門菌OmpN膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

Fig.3 Analytic result of membrane structure in OmpN ofS.paratyphiA

A：rOmpN兔抗血清為一抗時(shí)OmpN膜定位；B：正常兔血清為一抗的陰性對照

A: The location of OmpN in membrane using rabbit anti-rOmpN serum as the primary antibody;B: The negative control using normal rabbit serum as the primary antibody.

圖4 甲型副傷寒沙門菌OmpN膜定位(×1500)

Fig.4 Location of OmpN in membrane ofS.paratyphiA

微量肥達(dá)試驗(yàn)結(jié)果顯示，99.2%(125/126)、80.1%(101/126)和68.3%(86/126)甲型副傷寒沙門菌臨床菌株分別能與1∶10、1∶50和1∶100稀釋的rOmpN兔抗血清發(fā)生凝集反應(yīng)。

2．5 小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 BSA免疫小鼠腹腔感染2倍100% MLD甲型副傷寒桿菌50001株(1×107)后7 d內(nèi)均死亡。60.0%(9/15)100 μg rOmpN免疫小鼠、73.3%(11/15)200 μg rOmpN免疫小鼠經(jīng)2倍100% MLD甲型副傷寒桿菌50001株攻擊后仍存活P<0.05,表1。

2 討 論

新發(fā)傳染病(emerging infection disease)和再發(fā)傳染病(re-emerging infection disease)是威脅人類健康和生命安全的重大疾病。傷寒和副傷寒又稱腸熱癥，前者為傷寒沙門菌(Salmonellatyphi)感染所致，后者分為甲、乙、丙副傷寒，分別為甲型副傷寒沙門菌、肖氏沙門菌(S.schottmuelleri)和希氏沙門菌(S.hirschfeldii)感染所致。以往我國及東南亞地區(qū)主要流行傷寒，歐美地區(qū)傷寒和副傷寒病例極為少見[2-9]。如前所述，甲型副傷寒沙門菌不產(chǎn)生多糖莢膜，故傷寒沙門菌莢膜多糖為抗原的Vi疫苗免疫篩選作用以及甲型副傷寒沙門菌耐藥性日益增強(qiáng)，被認(rèn)為是目前甲副傷寒全球性流行的主要原因[17]。因此，甲副傷寒被認(rèn)為是一種新發(fā)或再發(fā)傳染病[18]。

表1 rOmpN對甲型副傷寒桿菌感染小鼠的免疫保護(hù)作用

傷寒尤其是副傷寒存在無癥狀帶菌者，部分傷寒或副傷寒病人呈慢性感染，但均可通過糞便排菌感染他人，故傷寒或副傷寒是典型的人與人之間傳播性傳染病，故接種疫苗被認(rèn)為是預(yù)防和控制傷寒或副傷寒流行最為有效的措施[10]。早年傷寒、甲與乙副傷寒三聯(lián)全菌死疫苗因其脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)毒副作用嚴(yán)重而被不含LPS的Vi疫苗所替代[19]。沙門菌是革蘭陰性菌，其外膜蛋白可作為基因工程疫苗抗原[20]。因此，研發(fā)以甲型副傷寒沙門菌外膜蛋白為抗原的多價(jià)基因工程疫苗是預(yù)防和控制目前甲副傷寒流行的有效途徑。

作為細(xì)菌基因工程疫苗的蛋白抗原，必須表達(dá)于細(xì)菌表面、序列保守、分布廣泛且有較強(qiáng)的免疫原性[20]。外膜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甲型副傷寒沙門菌OmpN是位于菌體表面的跨膜蛋白，所有126株甲型副傷寒沙門菌臨床菌株均攜帶ompN基因且有很高的核苷酸和氨基酸序列相似性(98.6%～100%)。甲型副傷寒沙門菌ompN基因重組表達(dá)產(chǎn)物rOmpN免疫家兔獲得的抗血清，其免疫擴(kuò)散效價(jià)可達(dá)1∶16；甲副傷寒病人血清標(biāo)本1∶100稀釋時(shí)，高達(dá)98.2%(55/56)的標(biāo)本可檢出rOmpN-IgG。肥達(dá)試驗(yàn)的本質(zhì)是傷寒或副傷寒抗體血清與菌體表面抗原結(jié)合的免疫凝集反應(yīng)。我們的微量肥達(dá)試驗(yàn)結(jié)果顯示，1∶10稀釋的rOmpN兔抗血清能凝集99.2%(125/126)甲型副傷寒沙門菌臨床菌株，提示這些菌株均表達(dá)OmpN。因此，甲型副傷寒沙門菌ompN是分布廣泛且序列保守的外膜蛋白基因，OmpN是高表達(dá)且有較強(qiáng)免疫原性的外膜蛋白抗原。

動物保護(hù)試驗(yàn)是確定任一蛋白能否作為基因工程疫苗候選抗原的關(guān)鍵。我們的小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，100或200 μg rOmpN免疫的小鼠能抵抗甲型副傷寒桿菌50001株致死性攻擊而存活，但通常疫苗免疫保護(hù)率達(dá)到90%以上才能令人滿意。目前認(rèn)為，與抗原構(gòu)造較為簡單的病毒不同，細(xì)菌是抗原構(gòu)造復(fù)雜多樣的原核細(xì)胞型微生物，單一細(xì)菌蛋白抗原的抗體作用靶點(diǎn)極為有限，難以獲得理想的免疫保護(hù)效果，必須同時(shí)采用多種細(xì)菌表面蛋白同時(shí)作為免疫原，才有可能獲得良好的免疫保護(hù)效果[20]。因此，rOmpN可作為甲型副傷寒桿菌有效抗原之一，與我們以往證實(shí)的rSpaO和rH1a抗原聯(lián)合應(yīng)用[1,11]，從而研制出高效多價(jià)甲副傷寒基因工程疫苗。

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Lin Xü-ai; Email: lxai122@163.com

Construction ofompNgene prokaryotic expression system ofSalmonellaparatyphiA and immunoprotection of its expressed product

JIN Lei1,SUN Ai-hua2，HU Wei-lin1,GE Yu-mei1,LIN Xü-ai1

(1.DepartmentofMedicalMicrobiologyandParasitology,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China;2.FacultyofBasicMedicine,ZhejiangMedicalCollege,Hangzhou310053,China)

The aim of this study is to detect theompNgene carrying rates inSalmonellaparatyphiA strains and to determine the antigenicity and immunoprotection of its recombinant expression product. Briefly, PCR was used to amplify theompNgene in the reference standard strain 50001 and 126 isolates ofS.paratyphiA, and then the amplified products were sequenced. AnompNgene prokaryotic expression system was generated and the target recombinant protein rOmpN was extracted by Ni-NTA affinity chromatography. The antigenicity of rOmpN was detected by rabbit immunization and ELISA. Micro-Widal’s test and laser confocal microscopy were applied to determine the expression rate of OmpN in theS.paratyphiA strains and its membrane location, respectively. A mouse infection model was used to investigate the immunoprotection of rOmpN in mice challenged by lethal dose ofS.paratyphiA. Results demonstrated that the entireompNgene fragment could be amplified from all theS.paratyphiA strains. The nucleotide and amino acid sequence identities of theompNgenes were as high as 98.6%-99.9% and 98.7%-100%, respectively. OmpN is a transmembrane protein ofS.paratyphiA. TheompNgene expression system could express rOmpN and the rOmpN-immunized rabbits produced high-titer antiserum. The 98.2% (55/56) of the paratyphoid A patients’ serum samples were positive for rOmpN-IgG and the rabbit anti-rOmpN serum could efficiently agglutinate theS.paratyphiA strains. The immunoprotective rate of 100 or 200 μg rOmpN-immunized mice were 60.0% (9/15) or 73.3% (11/15). All the data indicated thatompNgene ofS.paratyphiA has an extensive distribution and a high sequence conservation and its recombinant expression product rOmpN has powerful immunogenicity and immunoprotection.

SalmonellaparatyphiA;ompNgene; recombinant expression; antigenicity; immunoprotection

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.005

林旭璦，Email:lxai122@163.com

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，杭州 310058； 2.浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，杭州 310053

Supported by the Zhejiang Provincial Program for the Cultivation of High-level Innovative Health Talents (No. [2012]241)

R378

A

1002-2694(2015)08-0709-05

2015-01-03；

2015-03-16

浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才項(xiàng)目基金(No.[2012]241)資助