虞 佳,唐正午,楊曉燕,殷 杰,向 瓊,雷小勇*

(1.南華大學(xué)藥物藥理研究所,湖南衡陽421001;2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科)

MiRNA-122對(duì)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡的影響

虞 佳1,唐正午2,楊曉燕1,殷 杰1,向 瓊1,雷小勇1*

(1.南華大學(xué)藥物藥理研究所,湖南衡陽421001;2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科)

目的 探討微水RNA-122(miR-122)對(duì)5-氟尿嘧啶(5-FU)誘導(dǎo)BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡的影響。 方法構(gòu)建miR-122和陰性對(duì)照質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至BEL-7402/5-FU細(xì)胞;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況;Western blot檢測caspase-8,caspase-9和caspase-3蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 僅用miR-122處理BEL-7402/5-FU細(xì)胞時(shí),與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較,miRNA-122轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率增加,用10μmol/mL 5-FU作用BEL-7402/5-FU細(xì)胞24 h后,與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較,miR-122轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯增加;與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)染了miRNA-122的BEL-7402/5-FU細(xì)胞中caspase-8、caspase-9和caspase-3前體蛋白表達(dá)降低,活化的caspase-8、caspase-9和caspase-3蛋白表達(dá)升高。結(jié)論 miR-122能夠下調(diào)BEL-7402/5-FU細(xì)胞中caspase-8、caspase-9和caspase-3前體蛋白表達(dá),上調(diào)活化的caspase-8、caspase-9和caspase-3蛋白表達(dá),miR-122能促進(jìn)5-FU誘導(dǎo)的BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡。

微小RNA-122; BEL-7402/5-FU; 5-氟尿嘧啶; 細(xì)胞凋亡

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)生演化是一個(gè)多基因、多階段的過程[1],發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。目前,化療是治療肝癌重要手段之一。5-氟尿嘧啶(5-FU)作為抗代謝性腫瘤藥物,通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶,抑制DNA的生物合成而殺死腫瘤細(xì)胞[2]。然而,氟尿嘧啶類抗癌藥耐藥性問題是肝癌化療中的關(guān)鍵障礙,其耐藥機(jī)制包括增加了胸腺嘧啶核苷酸合成酶和多藥耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)等[3],因此基因治療與化學(xué)藥物相結(jié)合將為原發(fā)性肝癌的治療開辟新的前景。

MiR-122是肝臟中特異高表達(dá)的miRNA,近來的研究結(jié)果提示,miR-122表達(dá)下調(diào)是在肝癌發(fā)生過程中伴隨發(fā)生的事件,它也可能是肝癌的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志[4]。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspases)家族是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡中的起始者和執(zhí)行者。在正常細(xì)胞內(nèi),每一種caspase都以無活性的前體形式存在,死亡信號(hào)首先活化不同的caspase起始因子,再由起始因子激活下游的caspase效應(yīng)分子,最終由效應(yīng)分子特異地水解細(xì)胞中的一系列底物而導(dǎo)致細(xì)胞解體[5]。近年來研究表明,caspase-8、caspase-9和caspase-3表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生、分化和發(fā)展有密切關(guān)系[6-8],caspase前體的活化在腫瘤化療藥物耐藥中具有重要作用和應(yīng)用潛能。本文通過觀察miRNA-122對(duì)5-FU誘導(dǎo)BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡的影響,以期能為逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BEL-7402/5-FU細(xì)胞購于南京凱基生物發(fā)展有限公司,1640粉末培養(yǎng)基購于美國GIBCO公司,線性化PcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR表達(dá)載體攜有熒光報(bào)告基因購于上海吉瑪公司,Lipofectamin 2000購于Invitrogen公司,5-氟尿嘧啶為天津金耀氨基酸有限公司,小鼠抗人 caspase-8一抗、小鼠抗人caspase-9一抗和兔抗人caspase-3一抗購于Cell singaling公司。倒置熒光顯微鏡(日本 Olympus公司),流式細(xì)胞儀(FCM)(德國Beckman公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,置于37℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱,在BEL-7402/5-FU細(xì)胞培養(yǎng)液加入0.15μmol/mL 5-FU維持耐藥性培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)傳代和收集,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

1.3.1 質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建 將Pre-miR-122(TM)(miR-122)片段插入載體序列并進(jìn)行測序。PremiR-122(TM)轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞經(jīng)加工形成成熟miR-122。將與人源miRNA無同源性的線蟲miR-67插入載體序列,作為陰性對(duì)照。

1.3.2 質(zhì)粒提取與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將已構(gòu)建好的miR-122質(zhì)粒表達(dá)載體和miRNA陰性對(duì)照表達(dá)載體(載體上含大觀霉素耐藥基因),轉(zhuǎn)化進(jìn)入JM109菌株進(jìn)行擴(kuò)增,質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,-20℃保存?zhèn)溆?。?xì)胞轉(zhuǎn)染按脂質(zhì)體Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板,每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞生長至占培養(yǎng)孔80～85%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染率,取細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 Q-RT-PCR檢測細(xì)胞中miR-122表達(dá)水平采用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)流程按RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測

將BEL-7402/5-FU細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染組)、轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞以及miR-122轉(zhuǎn)染組細(xì)胞分別用0和10μmol/mL 5-FU處理24小時(shí),將所有細(xì)胞收集于1.5 mL離心管中,PBS緩沖液洗滌細(xì)胞,加70%乙醇1 mL在4℃固定過夜。離心去上層液,PBS緩沖液洗一遍,加200μL RNA酶消化細(xì)胞,37℃孵育30分鐘。加PI 800μL印跡細(xì)胞,室溫孵育30分鐘,流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 Western blot檢測細(xì)胞蛋白的水平

待各組細(xì)胞完全長滿75 mL培養(yǎng)瓶時(shí),棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌3次,晾干后加入細(xì)胞裂解液90μL裂解,并加入蛋白酶抑制劑10μL,置冰上10分鐘讓其充分裂解,細(xì)胞刮子收集細(xì)胞,超聲進(jìn)一步裂解,4℃離心13 000 rpm18分鐘,吸取上清液,紫外分光光度計(jì)法進(jìn)行蛋白定量,每組40μg蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1小時(shí),1%脫脂牛奶稀釋孵育一抗4℃過夜(1∶500),稀釋孵育二抗37℃1小時(shí)(1∶1 000),暗室顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié) 果

2.1 MiR-122聯(lián)合5-FU對(duì)BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡的影響

僅用miR-122處理BEL-7402/5-FU細(xì)胞時(shí),與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較,miRNA-122轉(zhuǎn)染組的凋亡率明顯增加(8.14±0.66%vs 1.24±0.45%,1.93±0.49%);用10μmol/ml 5-FU處理各組細(xì)胞24小時(shí)后,與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較,miR-122轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯增加(48.7±1.85%vs 22.5±0.91%,25.8±1.12%)(圖1),miR-122能促進(jìn)5-FU誘導(dǎo)BEL-7402/5-FU細(xì)胞的凋亡。

圖1 miR-122聯(lián)合5-FU對(duì)BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡的影響

2.2 MiR-122對(duì)BEL-7402/5-FU細(xì)胞中caspase-8、caspase-9、caspase-3蛋白表達(dá)的影響

與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染miR-122的BEL-7402/5-FU細(xì)胞中caspase-8前體蛋白表達(dá)降低,而活化的caspase-8蛋白表達(dá)增加(圖2)。轉(zhuǎn)染miR-122的BEL-7402/5-FU細(xì)胞中caspase-9前體蛋白表達(dá)降低,而活化的caspase-9蛋白表達(dá)增加(圖3)。轉(zhuǎn)染 miR-122的 BEL-7402/5-FU細(xì)胞中caspase-3前體蛋白表達(dá)降低,而活化的caspase-3蛋白表達(dá)增加(圖4)。

圖2 miR-122對(duì)BEL-7402/5-FU細(xì)胞caspase-8蛋白表達(dá)的影響

圖3 miR-122對(duì)BEL-7402/5-FU細(xì)胞caspase-9蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物產(chǎn)生耐藥是腫瘤化療失敗的主要原因之一。在臨床應(yīng)用中,多數(shù)患者經(jīng)化療緩解后,腫瘤細(xì)胞對(duì)5-FU產(chǎn)生了耐藥,使得化療效果明顯降低。為逆轉(zhuǎn)5-FU的耐藥性,人們進(jìn)行過廣泛的探討,但至今尚未發(fā)現(xiàn)一種在體內(nèi)有良好逆轉(zhuǎn)5-FU耐藥性的藥物。有研究表明,耐藥株不出現(xiàn)凋亡增加及細(xì)胞周期改變;耐藥株凋亡相關(guān)因子表達(dá)也異于一般的腫瘤細(xì)胞。人肝癌BEL-7402/5-FU耐藥株的多藥耐藥性可能和凋亡減少有關(guān)[9]。

在細(xì)胞凋亡的過程中caspase家族起著關(guān)鍵性的作用,caspase可自我活化并能相互激活,凋亡過程一旦觸發(fā),即呈級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)[10]。在凋亡執(zhí)行階段由下游caspase對(duì)特定的底物進(jìn)行切割,激活核行層蛋白、肌動(dòng)蛋白等的蛋白酶及核酸內(nèi)切酶等,抑制DNA修復(fù)酶從而破壞細(xì)胞骨架蛋白和核蛋白,使染色體斷裂成小片斷,這些不可逆轉(zhuǎn)的改變導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。盡管半胱天冬酶不是參與凋亡的唯一酶系,但它們的作用是必需的。腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性是異常增殖和永生化,常常表現(xiàn)為凋亡不足,怎樣通過激活caspase酶系統(tǒng)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡是值得研究的問題。另外,caspase在腫瘤化療藥物的抗藥性中具有重要作用和應(yīng)用潛能。在活細(xì)胞中caspase前體已經(jīng)存在,但其只在發(fā)生細(xì)胞凋亡時(shí)才被快速活化,因而,以誘導(dǎo)凋亡為目標(biāo)的腫瘤治療方法主要是通過各種因子對(duì)caspase前體進(jìn)行活化而進(jìn)行的。

越來越多的研究證實(shí)miRNA突變或者異常表達(dá)與多種人類癌癥發(fā)生相關(guān),miRNA的表征有望成為腫瘤診斷和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記。此外,miRNA特異性調(diào)控靶基因的作用方式,可能為抗腫瘤治療提供新的方法[11]。因此,我們將研究目標(biāo)鎖定在與化療耐藥相關(guān)的miRNA上,從新的層面來揭示化療耐藥的分子機(jī)制。前期研究發(fā)現(xiàn),miR-122能降低抗凋亡基因家族成員 Bcl-xL、Bcl-2的 mRNA表達(dá)量[12-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn),miR-122瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后,5-FU誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加,提示miR-122能促進(jìn)BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡。Western blot檢測miR-122轉(zhuǎn)染后BEL-7402/5-FU細(xì)胞的caspases-8,caspases-9和caspases-3活化形式表達(dá)上調(diào),提示miR-122可能通過靶向作用Bcl-2基因家族成員抗凋亡減少,激活細(xì)胞凋亡下游通路,促使caspase-8、caspases-9和caspases-3活化,從而引發(fā)caspases級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),使得細(xì)胞凋亡增加。miR-122很可能是抗腫瘤治療的一個(gè)有效靶點(diǎn),尤其是在針對(duì)腫瘤耐藥治療方面,能夠有效的逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞化療耐藥,促進(jìn)癌細(xì)胞調(diào)亡,為肝癌的基因治療提供了新的思路。

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Effects of miRNA-122 on BEL-7402/5-FU cell apoptosis induced by 5-fluracil

YU Jia,TANG Zhengwu,YANG Xiaoyan,et al
(Institute of Pharmacy and Pharmacology,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

Objective This study deals with the effects of miRNA-122 on BEL-7402/5-FU cell apoptosis induced by 5-fluracil. Method MiR-122 and control miRNA expression vectors were transient transfected into BEL-7402/5-FU cells.Cell apoptotic percentage was detected by flow cytometry.Western blot was used to detect the caspase-8,caspase-9 and caspase-3 protein expression. Result Flow cytometry results demonstrated that miR-122 transfected cells had a higher apoptosis rate than BEL-7402/5-FU cells or control group.Moreover,miR-122 transfected cells had significant move value than BEL-7402/5-FU cells or control group by 10μmol/ml 5-FU for 24 hours.Western bolt results showed that the expression level of pro-caspase-8,pro-caspase-9 and pro-caspase-3 in miR-122 transfected cells were obviously decreased,while the expression level of active caspase-8,caspase-9 and caspase-3 were obviously increased compared with BEL-7402/5-FU cells or control group. Conclusion miR-122 down-regulate pro-caspase-8,pro-caspase-9 and pro-caspase-3 expressions and up-regulate active caspase-8,caspase-9 and caspase-3 expressions in BEL-7402/5-FU cells.MiR-122 increased the cell apoptosis induced by 5-fluracil.

miR-122; BEL-7402/5-FU; 5-FU; cell apoptosis

R735.7

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.02.004

2014-11-26;

2015-2-17

湖南省教育廳一般課題(13C832).

*通訊作者,E-mail:lei_xiaoyong@aliyun.com.

(此文編輯:秦旭平)