朱 怡,周孝錢,肖云彬,全海燕,駱竟妃,彭虹艷,秦旭平*

(1.南華大學附屬第二醫(yī)院骨外科,湖南衡陽421001;2.南華大學藥物藥理研究所;3.湖南省兒童醫(yī)院心血管內科)

Caveolae在CGRP保護人臍靜脈內皮細胞中的作用及機制

朱 怡1,周孝錢2,肖云彬3,全海燕2,駱竟妃2,彭虹艷2,秦旭平2*

(1.南華大學附屬第二醫(yī)院骨外科,湖南衡陽421001;2.南華大學藥物藥理研究所;3.湖南省兒童醫(yī)院心血管內科)

目的 探討Caveolae對降鈣素基因相關肽(CGRP)抑制過氧化氫(H2O2)誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)損傷作用的影響及其機制。 方法 體外培養(yǎng)HUVECs,分別用CGRP和/或H2O2處理細胞,光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)學和密度的變化;流式細胞術觀察細胞的增殖和周期分布;β-環(huán)糊精(β-CD)用于破壞caveolae結構;Western-blot檢測caveolin-1表達。 結果 與正常組比較,CGRP組細胞密度增加,S期細胞數明顯增多,H2O2組細胞密度降低,S期細胞數明顯減少;CGRP預孵育細胞能抵抗H2O2引起的細胞數目減少;β-CD剝奪膽固醇,破壞caveolae結構,HUVECs形態(tài)學發(fā)生改變,但CGRP誘導的細胞密度和細胞增殖進一步提升,恢復膽固醇后,該作用被取消。與對照組比較,CGRP組細胞caveolin-1表達水平降低(P＜0.05);H2O2組細胞caveolin-1水平上升(P＜0.05),給予CGRP預孵育后,能顯著逆轉H2O2誘導的caveolin-1表達(P＜0.05);β-CD破壞caveolae結構后,增強CGRP下調HUVECs caveolin-1表達的作用(P＜0.05),增加膽固醇Caveolae結構有所恢復且該作用被削弱。結論 Caveolae結構完整性對CGRP保護H2O2損傷HUVECs有一定影響,破壞caveolae結構能增強CGRP對H2O2損傷的HUVECs的增殖作用,其機制可能與增強CGRP下調氧化應激導致的caveolin-1的表達有關。

過氧化氫; 降鈣素基因相關肽; caveolae; caveolin-1; 內皮細胞

降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是由辣椒素敏感性感覺神經末梢釋放的神經肽,是目前發(fā)現的內源性最強的舒血管活性物質之一,有舒張血管和收縮心肌的作用,抑制血管平滑肌細胞增殖和內皮細胞凋亡[1]。Caveolae是細胞膜表面特異性內陷結構,是細胞內多數信號分子和轉導通路的整合器。caveolin-1是caveolae表面標記蛋白和結構蛋白,并通過其腳手架區(qū)域在caveolae區(qū)結合其他信號分子發(fā)揮負性調節(jié)的作用[2]。前期研究工作表明,CGRP能對抗H2O2引起的血管內皮細胞損傷,并上調caveolin-1的表達[3]。本研究以體外培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞株(HUVECs)為研究對象,采用H2O2誘導損傷建立血管內皮細胞氧化損傷模型,通過觀察HUVECs生長、細胞周期分布及caveolin-1蛋白的表達,研究CGRP對氧化損傷內皮細胞的保護作用,探討caveolae結構完整性對CGRP保護內皮細胞作用的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人臍靜脈內皮細胞細胞株(HUVECs,型號:C-003-5C)由本實驗室保存。 CGRP,β-cyclodextrin(β-CD)為Sigma公司產品,Cholesterol(USA Amresco,Inc.),胎牛血清購自杭州四季青公司。RPMI-1640的培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,抗體及顯色試劑購自武漢博士德生物有限公司。蛋白印跡所用試劑均為USA Amresco,Inc.公司產品。

1.2 人臍靜脈內皮細胞培養(yǎng)

取凍存的HUVECs,解凍后置于50 mL無菌培養(yǎng)瓶中,加入適量含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長至80%左右時,用0.25%胰酶消化傳代。取長勢良好的3～10代細胞用于實驗。

1.3 實驗分組及處理因素

在前期實驗的基礎上[3],通過量效關系確定H2O2及CGRP作用于HUVECs的濃度。對照組為0.1%FBS培養(yǎng)的靜止期細胞;實驗組細胞分別用H2O2(0.5 mmol/L),CGRP(100 nmol/L),β-CD(5 mmol/L)膽固醇(Cholesterol 25μmol/L)按實驗目的和程序處理細胞(見結果)。采取細胞計數板和光鏡下肉眼觀察的方法分析細胞密度的變化。

1.4 Western Blot

各組細胞棄去細胞培養(yǎng)液,用冰PBS洗滌3次,加入預冷的RIPA裂解液臨用前加入0.1 mg/mL PMSF裂解細胞,置冰上10 min,用細胞刮匙刮取蛋白,再以超聲波粉碎細胞,4℃ 10 000 g離心15 min,取上清分裝后于-85℃超低溫冰箱凍存。BCA法測蛋白質含量后,每泳道上30μg總蛋白量進行SDSPAGE電泳分離,然后轉移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h,加入一抗(兔抗caveolin-1,1∶400;鼠抗β-actin,1∶300)4℃孵育過夜TBST洗膜8 min/次,洗3次,加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶1 000)或兔抗小鼠二抗(1∶1 000),室溫下搖床孵育2 h,常規(guī)洗膜,化學發(fā)光劑顯色,膠片顯影,掃描膠片用凝膠系統(tǒng)分析系統(tǒng)測光密度值。結果以各目的蛋白和β-actin的灰度比值表示。

1.5 PI單染流式細胞術觀察HUVECs細胞周期分布情況

取3～10代對數生長期的 HUVECs,以2×105個/mL接種于50 mL培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),0.1%FBS培養(yǎng)基同步化細胞24 h,按分組加入不同的處理因素繼續(xù)孵育后收集細胞。PBS液清洗3次,0.25%胰蛋白酶消化細胞,10%FBS的細胞培養(yǎng)液終止消化,吹打成細胞懸液后,4℃、75 g離心5 min,PBS液清洗3次,棄上清,用體積分數為75%的冰乙醇吹打成單細胞懸液,吸入到1.5 mL大的EP管,4℃固定過夜。檢測前,75 g離心10 min,棄上清,PBS液清洗3次,調整細胞濃度為1×106/L。加PI熒光染料,350目尼龍網濾膜過濾除去細胞團塊,于4℃避光染色30 min后,上流式細胞儀(FCM)檢測各期細胞DNA的含量。計算30 000個細胞,觀察細胞的增殖以及細胞周期情況。

一般情況下,細胞無增殖活動時皆停留于G0G1期,在某些因素激活下,啟動DNA合成進入S期(DNA合成期)及M期(DNA分裂期),使細胞增殖分化?？筛鶕毎芷诟鲿r相比例,計算增殖指數(proliferation index,PI),以衡量細胞的分裂增殖活動。PI的計算公式為:PI=(S+G2M/(G0G1+S+G2M),PI值越大表示細胞增殖越明顯。

1.6 統(tǒng)計學處理

所有數據均采用均數±標準差()表示。均采用SPSS14.0 for windows軟件進行分析,組間差異比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA)及t檢驗,用P＜0.05判斷統(tǒng)計差異有無顯著性。

2 結 果

2.1 Caveolae對CGRP保護HUVECs生長作用的影響

HUVECs分別給予CGRP(100 nmol/L)或H2O2(0.5 mmol/L)處理24 h后,光學顯微鏡下觀察發(fā)現:與對照組相比,CGRP能增加HUVECs的密度,形態(tài)與排列與對照組無差別(圖1B),而H2O2組形態(tài)變小變圓,排列不規(guī)則(圖1C)。CGRP預孵育細胞30 min能顯著改善H2O2對細胞的損傷作用(圖1D),胞漿變得飽滿。用 β-環(huán)糊精(β-CD)破壞caveolae結構后,光學顯微鏡下觀察,細胞密度增加,但形狀不規(guī)則(圖1F);預先加入膽固醇保護Caveolae結構,細胞多角形狀更不規(guī)則,與CGRP+H2O2組相比,細胞密度基本恢復,各組細胞數的變化如圖2所示。

圖1 HUVECs形態(tài)學圖( ×100). A:Control,B:CGRP,C:H2O2;D:CGRP+H2O2;E:β-CD+CGRP+H2O2;F:Cholesterol+β-CD+CGRP+H2O2

圖2 各組細胞數的變化

2.2 Caveolae對HUVECs周期分布的影響

對細胞周期圖統(tǒng)計分析發(fā)現,與對照組比較,單用CGRP能使S期細胞增多(圖3B);H2O2組S期細胞較正常組減少(圖3C);CGRP預孵育細胞30 min使H2O2組S期細胞明顯增多(圖3D),PI值較H2O2增大(P＜0.05)。說明CGRP能夠對抗H2O2引起的S期細胞的減少,促進正常和受損HUVECs的增殖。給予 β-CD,細胞 PI值增大,與CGRP+H2O2組相比,S期細胞數目增加;預先加入膽固醇,該作用被削弱(見表1,P＜0.05)。由此可見,caveolae在CGRP促進氧化損傷HUVECs S增殖過程中可能起負性調節(jié)的作用。

圖3 細胞周期分布的流式細胞儀代表圖

表1 Caveolae對HUVECs周期分布影響情況(n=3)_

表1 Caveolae對HUVECs周期分布影響情況(n=3)_

PI=(S+G2M/(G0G1+S+G2M),PI值越大表示細胞增殖越明顯;G0/G1:停留于G1/G0期(無增殖活動期)細胞;S:DNA合成期細胞;G2/M:DNA合成后期細胞;a:P＜0.05 vs Control(0.1%FBS);b:P＜0.05 vs H2O2;c:P＜0.05 vs CGRP+H2O2;d:P＜0.05 vsβ-CD+CGRP+H2O2

_Group G0/G1% S% G2/M%PI%________________Control(0.1%FBS)45.7±2.3 41.5±1.5 7.5±0.6 51.7±2.8 CGRP 43.6±3.1 50.1±2.6a 4.6±0.9 55.7±4.1a H2 O2 36.4±2.6 30.6±2.2a 1.4±0.8 45.7±3.4a CGRP+H2 O2 40.8±4.2 45.6±4.1b 10.0±1.2 57.8+5.8b β-CD+CGRP+H2 O2 27.4±4.9 54.2±3.7c 4.0±1.0 68.0±6.2c_Cholesterol+β-CD+CGRP+H2 O2_______________31.4±5.1_________________________39.9±3.3d 7.6±1.2 60.2±6.1d_______________

2.3 CGRP抑制H2O2處理的HUVECs caveolin-1的表達

單用CGRP能夠降低HUVECs caveolin-1的表達,而用0.5 mmol/L H2O2處理細胞4 h后,caveolin-1的表達增加,說明H2O2通過增加caveolin-1的表達得到抑制細胞增殖的作用。100 nmol/LCGRP預孵育30 min后,再給H2O2能夠降低caveolin-1的表達(P＜0.05)(圖4)。

圖4 CGRP對H 2 O2處理HUVECs caveolin-1表達的影響

2.4 Caveolae結構對CGRP抗氧化損傷作用的影響

如圖5所示,用0.1%FBS同步化細胞24 h,換含5 mmol/Lβ-CD的細胞培養(yǎng)液孵育細胞0、0.17、0.5、1、4、8、16 h 提取細胞總蛋白。 Western-blot結果顯示,β-CD孵育細胞0.5 h后能夠下調HUVECs caveolin-1的表達,并且降低幅度最大。由此選定5 mmol/Lβ-CD孵育細胞0.5 h作為破壞caveolae結構的條件。

如圖6所示,同步化細胞按照處理因素分組,0.5 mmol/L H2O2處理細胞4 h后提取細胞總蛋白。Western-blot結果顯示:Caveolae結構破壞后,CGRP抑制H2O2引起HUVECs caveolin-1表達上調的作用更明顯(P＜0.05);預先加入膽固醇后,該抑制作用被削弱(P＜0.05)。

圖5 β-環(huán)糊精對人臍靜脈內皮細胞caveolin-1表達的影響

圖6 各處理因素下caveolin-1的表達情況 1:Control(0.1%

3 討 論

本研究顯示,caveolae結構完整性對CGRP保護內皮細胞有一定的影響,主要表現在,完整的caveolae結構可以通過促進caveolin-1的表達降低CGRP對內皮細胞的促增殖作用,破壞caveolae結構后,這種作用降低。有研究表明,CGRP還能刺激血管內皮細胞增殖,保護內皮祖細胞,修復和改善受損內皮的功能,沙坦類藥物的降壓和保護心血管作用與升高高血壓患者體內的CGRP水平有關[4]。

Caveolae是富含膽固醇和蛋白質,其膽固醇含量占細胞內游離膽固醇的90%以上,膽固醇在維持caveolae結構完整性扮演重要角色[5]。β-環(huán)糊精能夠結合膽固醇,導致caveolae在細胞膜上的形態(tài)發(fā)生變化,變得扁平,數目減少,從而影響其多數激酶活性抑制劑的生物學功能。本實驗用5 mmol/Lβ-CD孵育細胞30 min后,發(fā)現在該時間點左右caveolin-1表達下降幅度最大,可能與小凹結構的破壞以及小凹數目急劇減少有關。流失細胞儀也發(fā)現,給予β-CD,細胞PI值增大,與CGRP+H2O2組相比,S期細胞數目增加;預先加入膽固醇,該作用被削弱,說明caveolae在CGRP促進氧化損傷HUVECs S增殖過程中可能起負性調節(jié)的作用。值得注意的是有文獻[6]指出一定劑量的β-CD能夠使內皮細胞的活力下降,流式細胞術結果顯示,加用β-CD處理細胞,細胞凋亡率較其他處理因素組有所增加。因此,應用β-環(huán)糊精破壞小凹結構引起實驗結果的偏差,可能與β-CD處理細胞的時間和劑量是否有關,這還需進一步闡明。本實驗光鏡下顯示,β-CD處理細胞后,雖然細胞密度有所增加,但形態(tài)也發(fā)生變化?；謴湍懝檀技毎螒B(tài)也與正常細胞有所不同,推測破壞小凹結構對細胞的功能可能有影響。

Caveolin-1是組成caveolae結構和維持其完整性的所必需膜蛋白,并且前期工作證明caveolin-1參與負性調控細胞增殖的作用[7]。Caveolin-1已作為研究caveolae結構和功能以及caveolae/caveolin-1復雜的生物學功能的標志蛋白和工具。本實驗用5 mmol/Lβ-CD處理細胞30 min,caveolin-1表達顯著下降;能增強并放大CGRP對受損細胞的增殖作用;流式結果也表明CGRP預孵育細胞30 min使H2O2組S期細胞明顯增多,這一增強效應在caveolae結構被破壞后得到放大,可被膽固醇削弱。由此可見,CGRP可能是通過推進HUVECs的G1→S期進程,促進細胞分裂增殖。Western-Blot結果顯示同樣的效應:破壞caveolae后,CGRP下調氧化損傷HUVECs caveolin-1作用更明顯。說明內皮細胞膜表面caveolae結構或者數量表達的差異可能是調節(jié)CGRP受體信號轉導的影響因素。實驗對擬破壞小凹結構的內皮細胞加以膽固醇的供給,發(fā)現膽固醇逆轉了β-CD上述的放大效應,外源性膽固醇結合了β-CD,通過阻止β-CD結合細胞膜膽固醇破壞小凹結構,間接促進細胞膜膽固醇與caveolin-1相連形成caveolae,恢復其與各種受體結合的能力,而發(fā)揮caveolin-1對增殖信號通路的負性調節(jié)作用。值得提出的是雖然剝奪膽固醇破壞小凹結構可以增強內皮細胞的數目,但就內皮細胞的功能影響來說是否受到影響還需進一步研究。

[1]鄧水秀,秦旭平.降鈣素基因相關肽的血管生物學功能多樣性[J].國際病理科學與臨床雜志,2006,26(3):246-249.

[2]Santibanez JF,Blanco FJ,Garrido-Martin EM,et al.Caveolin-1 interacts and cooperates with the transforming growth factor-βtype 1 receptor ALK-1 in endothelial caveolae[J].Cardiovasc Res,2008,77(3):791-799.

[3]周孝錢,許俊,唐江瓊,等.CGRP對氧化損傷人臍靜脈內皮細胞的保護作用及Caveolin-1表達的影響[J].中南醫(yī)學科學雜志,2011,39(2):131-134.

[4]CalòLA1,Dal Maso L,Pagnin E,et al.Effect of olmesartan medoxomil on number and survival of circulating endothelial progenitor cells and calcitonin gene related peptide in hypertensive patients[J].J Hypertens,2014,32(1):193-199.

[5]Suetsugu S,Kurisu S,Takenawa T.Dynamic shaping of cellular membranes by phospholipids and membrane-deforming proteins[J].Physiol Rev,2014,94(4):1219-1248.

[6]Kline MA,O'Connor Butler ES,Hinzey A,et al.A simple method for effective and safe removal of membrane cholesterol from lipid rafts in vascular endothelial cells:implications in oxidant-mediated lipid signaling.Methods Mol Biol.2010;610:201-211.

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Role of Caveolae in the Protection of CGRP on the HUVECs Injury Induced by Oxidative

ZHU Yi,ZHOU Xiaoqiang,XIAO Yunbin,et al
(Department of Orthopaedic Surgery,the Second Affiliating Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

Objective To study the role of caveolae on the protective effect of cacitonin gene-related peptide(CGRP)on human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)injury induced by oxidative stress. Methods HUVECs were cultured in vitro,and treated with CGRPor/and hydrogen peroxide(H2O2),the distribution of cell cycles and proliferation of cells were observed by flow cytometry.The density and morphology of cells were observed by optical microscope,β-cyclodextrin(β-CD)was used to injured the structure of caveolae,expression of caveolin-1 was measured by Western blot. Rethods Compared with control group,treatment of CGRPincreased proliferation index(PI)and the number of S phase cells which were inhibited by H2O2;Destruction of caveolae structure could increase the density of cells and change the cells shape;The expression of caveolin-1 was down-regulated by CGRPbut up-regulated by H2O2,respectively.Pretreatment with CGRP,the up-regulation of caveolin-1 induced by H2O2was significantly reverted(P＜0.05).Pretreatment ofβcyclodextrin with cells,the expression of caveolin-1 induced by CGRP was furtherly decressed. Conclusions the destruction of caveolae could increased the proliferative effect of CGRPon HUVECs induced by H2O2,the mechanism involvein change of the expression of caveolin-1.

H2O2; CGRP; caveolin-1; caveolae; endothelial cells

R331.36

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.02.003

2014-11-02;

2014-12-25

國家自然科學基金(30572192),湖南省青年科學基金課題(13JJ4121).

*通訊作者,E-mail:qinxp333@hotmail.com.

(此文編輯:秦旭平)