路海博 孫元元 湯海港 張?zhí)N薇

摘 要 蔗糖是植物中重要的代謝產(chǎn)物，它直接或間接參與多種生理生化反應(yīng)，研究其含量的變化規(guī)律對提高植物生物學(xué)產(chǎn)量和增強(qiáng)植物抗逆性具有重要的指導(dǎo)意義。蔗糖磷酸合成酶（SPS）是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一，它催化蔗糖代謝中的限速反應(yīng)，SPS基因在分子水平編碼調(diào)控SPS。研究SPS基因克隆與表達(dá)規(guī)律是從分子水平揭示蔗糖代謝的基礎(chǔ)。本文綜述了近年來SPS基因克隆和表達(dá)研究進(jìn)展，并展望了SPS基因的研究前景和應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 蔗糖 ；蔗糖磷酸合成酶基因 ；克隆 ；表達(dá)

分類號 Q943.2

蔗糖是高等植物光合作用的主要產(chǎn)物[1]，是碳運(yùn)輸?shù)闹饕问?，也是“庫”代謝的主要基質(zhì)，蔗糖轉(zhuǎn)移效率[2]直接決定植物生長快慢；蔗糖參與植物滲透調(diào)節(jié)，環(huán)境脅迫下植物會(huì)大量合成蔗糖，提高細(xì)胞液濃度，阻止細(xì)胞質(zhì)過度失水；蔗糖通過反饋?zhàn)饔谜{(diào)節(jié)一些酶的活性，也可作為信號因子誘導(dǎo)或阻礙某些基因的表達(dá)。與蔗糖代謝相關(guān)的酶[3-4]有蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthetase， SPS）、蔗糖合成酶（sucrose synthetase， SuSy）和轉(zhuǎn)化酶（invertase， INV）。在這3種蔗糖代謝酶中，SPS是最重要的限速酶，它直接調(diào)控植物中蔗糖和淀粉的合成與分配，是催化蔗糖合成的主要酶[5]。

植物體內(nèi)蔗糖的積累與SPS活性正相關(guān)。已有研究表明，蔗糖是甜高粱[6]莖稈中糖分積累的主要形式，約占總含糖量的85%。甜高粱莖稈蔗糖含量與葉SPS蛋白質(zhì)的表達(dá)相關(guān)系數(shù)為0.895，與莖稈SPS蛋白質(zhì)的表達(dá)相關(guān)系數(shù)為0.781。比較高梁和甜高粱，隨著高粱的生長發(fā)育，SPS-A在莖稈中的表達(dá)不斷增強(qiáng)，與蔗糖積累增加趨勢一致。在生長后期，甜高粱莖稈中SPS-A表達(dá)量明顯高于普通高粱，這可能就是甜高粱蔗糖豐富積累的關(guān)鍵，表明高粱莖稈蔗糖積累[7]與SPS-A在莖稈中的表達(dá)相關(guān)。

SPS蛋白水平研究相對成熟，結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、活性調(diào)控[8-9]都已有報(bào)道。SPS廣泛存在于植物光合組織和非光合組織中，是一種低豐度、可溶性、不穩(wěn)定蛋白，酶活最適pH值約為7.0，由分子量117～138 kD的亞基構(gòu)成為二聚體或四聚體。SPS在植物體內(nèi)催化UDPG和F-6-P（6-磷酸果糖）反應(yīng)生成G-6-P（6-磷酸葡萄糖）和UDP，G-6-P又在蔗糖-6-磷酸合成酶（SPP）作用下迅速降解為蔗糖和磷酸根離子，使得SPS催化的蔗糖合成反應(yīng)實(shí)際上是不可逆的[10]。6-磷酸葡糖共價(jià)調(diào)控SPS活性，無機(jī)磷抑制SPS活性。另外，光照和滲透壓變化因?yàn)楦淖冄趸姿峄稽c(diǎn)上的絲氨酸殘基也會(huì)影響SPS的活性[11]。

SPS基因在基因水平直接編碼調(diào)控SPS，SPS基因的分子生物學(xué)研究近年來取得了一系列進(jìn)展?？寺∨c表達(dá)分析一直是分子生物學(xué)的重要組分，本文對SPS基因的克隆與表達(dá)分析展開綜述，為對該基因的進(jìn)一步研究提供參考。

1 SPS基因克隆研究進(jìn)展

1.1 SPS基因克隆方法

植物基因克隆方法相對成熟，主要有功能克隆，PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)座子或T-DNA標(biāo)簽，定位克隆，差別雜交和減法雜交，mRNA差異顯示和人工合成克隆[12]等多種方法。目前，獲得SPS基因克隆最常用的、報(bào)道最多的方法是PCR擴(kuò)增克隆法[13]。通過參考已知基因序列，從GenBank中下載保守序列，設(shè)計(jì)特異引物或簡并引物，以RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，在DNA聚合酶的作用下獲得特定DNA片段。這是一種快速簡便基因克隆方法。

Guangming Sun[14]等使用PCR擴(kuò)增法從菠蘿中克隆了一個(gè)1 132 bp的SPS基因片段AC-SPS1。AC-SPS1基因?qū)儆贏家族，編碼377個(gè)氨基酸殘基，含有兩個(gè)絲氨酸特征殘基。除了設(shè)計(jì)特異性引物，還可以利用保守氨基酸序列設(shè)計(jì)簡并引物。通過設(shè)計(jì)簡并引物，獲得了菠蘿[15]中1 131 bp的不同家族SPS基因片段，其編碼的氨基酸序列與水稻、翠竹、高粱、小麥的SPS氨基酸序列同源性分別達(dá)到了85%、84%、82%和81%。

1.2 SPS基因克隆進(jìn)展

SPS基因序列具有多樣性。Castleden[16]等人對已知的SPS基因序列進(jìn)行分析，界定了植物SPS基因的4個(gè)大家族（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ或者A、B、C、D）。依據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，單子葉和雙子葉植物中廣泛存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個(gè)基因家族，而Ⅳ家族（包括Ⅳ1和Ⅳ2）基因家族到目前為止只在禾本科植物中發(fā)現(xiàn)。在模式植物擬南芥中有4個(gè)SPS基因。其中2個(gè)基因位于5號染色體上，屬于家族A。1個(gè)基因位于1號染色體上，屬于家族B。1個(gè)基因位于4號染色體上，屬于家族C。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的D家族SPS基因比較特殊，它編碼的SPS蛋白N末端和C末端的氨基酸殘基數(shù)要比A、B、C家族少80～90個(gè)。

不同SPS基因家族在不同的器官組織中相對含量是不盡相同的，它們所發(fā)揮的功能也存在差異。通過RNA干擾抑制煙草葉片SPS-A基因和SPS-C基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在缺乏SPS-C的情況下，淀粉不能被有效動(dòng)員降解而合成蔗糖，說明SPS-C與淀粉降解后蔗糖的合成密切相關(guān)，SPS-A存在于所有組織，抑制SPS-A沒有觀察到明顯的表型變化[17]。所以克隆不同植物不同家族的SPS基因具有重要意義。

SPS基因首先在玉米中得以克隆[18]，之后在菠菜、甜菜、柑桔、蠶豆、水稻、甘蔗等多種作物中相繼克隆出來[19-21]。截止目前，在NCBI中檢索SPS基因，可以獲得83條核酸序列。其中可可樹SPS核酸序列GenBank中收錄最多，有7條。GenBank收錄SPS基因序列物種分布情況如圖1所示。

基因克隆是分子生物學(xué)的重要組成，是物種中存在特定基因的重要證據(jù)，是基因功能研究的基礎(chǔ)。不同植物中SPS基因數(shù)目不同。甘蔗屬于禾本科的單子葉植物，所以甘蔗基因組中至少有5個(gè)分別屬于5個(gè)不同家族的SPS基因。目前在甘蔗[22-23]中，已鑒定了3個(gè)SPS基因（GenBank登錄號分別為：AB001337、EU269038和AB001338），其中2個(gè)已獲得全長氨基酸序列（EU269038和AB001338），分別屬于A家族D家族。何文錦等2007年從甘蔗葉片中克隆了SOSPS2，cDNA長 3 013 bp，其中第59-2 953位是該基因的開放閱讀框，編碼964個(gè)氨基酸。葉冰瑩[24]等2011年通過反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)分離克隆了SPS基因cDNA片段，序列分析表明，該cDNA片段包含1個(gè)3 183 bp的開放閱讀框，可編碼1 060個(gè)氨基酸。已克隆的甘蔗SPSⅢ基因有2個(gè)等位變異類型SPSⅢ-1和SPSⅢ-2，同源性達(dá)99%。親緣關(guān)系較近的，高粱屬的甜高粱——同為莖稈含糖量較高的物種，已克隆出全長DNA序列SPS3-1[25]。

在原核生物藍(lán)藻中存在光合作用，光合產(chǎn)物以蔗糖的形式轉(zhuǎn)運(yùn)。John E. Lunn[26]等在藍(lán)藻中克隆到一個(gè)SPS基因，包含2 163 bp的ORF序列，將該基因編碼的氨基酸序列和高等植物的SPS氨基酸序列進(jìn)行比對，表現(xiàn)出了35%～39%的同源性。表1列出了幾種重要植物中獲得的SPS基因序列信息以及它們和不同物種同源性比對結(jié)果。

2 SPS基因表達(dá)研究進(jìn)展

2.1 SPS基因表達(dá)研究方法

植物的生長、發(fā)育是基因差異表達(dá)的結(jié)果，研究基因表達(dá)有實(shí)時(shí)熒光定量PCR、半熒光定量PCR、印記雜交、原位雜交等方法。關(guān)于SPS基因表達(dá)研究的文獻(xiàn)報(bào)道中，使用最多的是實(shí)時(shí)熒光定量PCR和印記雜交技術(shù)。

2.1.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR 反應(yīng)進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法為實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)[33]。該方法具有簡便、快速、高效等特點(diǎn)，在基因表達(dá)研究中廣泛應(yīng)用。

在水稻[34]中，Naohiro Aokia等實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究了5個(gè)SPS同源基因的表達(dá)特性。SPS1基因在源組織中大量表達(dá)，而SPS2、SPS6和SPS8基因在源、庫組織中等量表達(dá)。5個(gè)同源基因SPS1、SPS2、SPS6、SPS8和SPS11的差異表達(dá)決定了水稻在萌發(fā)期、苗期、抽穗期的發(fā)育特征。C P L Grof使用相同方法測定了5種SPS基因家族在甘蔗[35]中的表達(dá)規(guī)律，SPS基因B、C家族在未成熟葉和成熟葉中均大量表達(dá)，D1、D2家族在莖、葉等量表達(dá)，A家族在葉中表達(dá)水平較低。陳由強(qiáng)等研究了甘蔗中SPSⅡ基因在糖分積累不同時(shí)期表達(dá)量的變化規(guī)律。在糖分積累初期，SPSⅡ基因在莖中大量表達(dá)；在糖分積累中期，SPSⅡ基因在葉中大量表達(dá)。枸杞是茄科多年生灌木，蔗糖含量對其品質(zhì)起重要作用。王麗娟等[36]用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究了枸杞中SPS基因的表達(dá)規(guī)律，在枸杞花和果實(shí)中SPS基因表達(dá)量高，而在根和葉中表達(dá)量低。文心蘭在開花過程中SPS基因會(huì)大量表達(dá)，甜瓜根中SPS基因表達(dá)量低，枸杞花、根中SPS基因表達(dá)研究結(jié)果和文心蘭、甜瓜相關(guān)研究結(jié)果一致。采用熒光定量PCR技術(shù)分析巴西橡膠樹[37]中SPS基因的表達(dá)模式，膠乳中表達(dá)量最高，樹皮、葉、花、種子、根中表達(dá)均較低。

2.1.2 印記雜交技術(shù)

在基因操作中，把DNA或RNA、蛋白質(zhì)等在薄膜濾器上經(jīng)浸潤、固定后，于薄膜濾器上進(jìn)行雜交，生成雜種分子的過程稱為印記雜交[38]。分析RNA的Northern blot、分析DNA的Southern blot、分析蛋白的Western blot技術(shù)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR普及之前都廣泛用于基因表達(dá)分析。

Chengchao Zheng 利用Northern blot技術(shù)分析了CmSPS1基因在甜瓜中的表達(dá)情況：在葉、莖、成熟果實(shí)中都有CmSPS1基因表達(dá)，但是在根和花中沒有檢測到mRNA。對菠菜[39]根、葉柄葉片進(jìn)行Western blot和 Northern blot 分析，發(fā)現(xiàn)SPS基因主要在葉中表達(dá)，在葉片快速生長的初期大量積累。Southern blot分析柑橘[40]CitSPS1基因，發(fā)現(xiàn)它一個(gè)低拷貝基因。暗處理玉米[41]12 h后，Northern blot 分析表明SPS基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。

2.2 SPS基因表達(dá)的空間特異性和時(shí)間特異性

空間特異性也稱組織特異性或細(xì)胞特異性，在植物生長發(fā)育過程中，SPS基因表達(dá)按照不同組織空間順序出現(xiàn)，并且在不同組織中呈現(xiàn)不同的規(guī)律。時(shí)間特異性是指在植物不同功能需求的生長發(fā)育各個(gè)階段，SPS基因表達(dá)按特定的時(shí)間順序發(fā)生，基因表達(dá)量也隨時(shí)間順序發(fā)生變化?；虮磉_(dá)空間特異性和時(shí)間特異性均是不可逆的。

2.2.1 SPS基因表達(dá)的空間特異性

提取復(fù)活草根、葉組織的RNA，和特異性基因探針雜交，發(fā)現(xiàn)CpSPS2只在葉中表達(dá)，而CpSPS1在根、葉中都有表達(dá)，且CpSPS1轉(zhuǎn)錄豐度明顯高于CpSPS2。在溫州蜜桔所有器官中都有CitSPS1基因的轉(zhuǎn)錄，但是在幼葉、花和未成熟的果實(shí)中轉(zhuǎn)錄水平很低，在老葉和成熟果實(shí)中轉(zhuǎn)錄水平很高。甘蔗中基因表達(dá)分析表明，不同部位SPS基因表達(dá)量有差異，莖組織中SPSⅡ表達(dá)量占SPS基因轉(zhuǎn)錄總量的40%。甜菜[42]中，BvSPS1基因是一個(gè)低拷貝基因，主根中BvSPS1基因的轉(zhuǎn)錄水平高于葉中。SoSPS1基因在甘蔗[43]葉中大量表達(dá)，SoSPS2基因不僅在葉中還在根中表達(dá)，且轉(zhuǎn)錄水平相近。水稻[44]SPS1基因只在葉中表達(dá)，而不在根中表達(dá)。Champa Sengupta-Gopalan等研究了苜蓿[45]葉片和根中3個(gè)SPS基因的表達(dá)規(guī)律，一個(gè)屬于A家族（MsSPSA），2個(gè)屬于B家族（MsSPSB和MsSPSB3），MsSPSA基因在節(jié)間表達(dá)增強(qiáng)，MsSPSB基因和MsSPSB3基因在葉中表達(dá)增強(qiáng)。

從以上報(bào)道中可以發(fā)現(xiàn)，大部分植物根中SPS基因表達(dá)水平較低，這可能是因?yàn)楦胁话l(fā)生光合反應(yīng)，沒有光合產(chǎn)物在根中合成蔗糖造成的；而在含糖量高的植物器官中，SPS基因表達(dá)水平較高，如巴西橡膠樹膠乳、溫州蜜橘果實(shí)、甘蔗莖桿中等等。

2.2.2 SPS基因表達(dá)的時(shí)間特異性

菠蘿成熟過程中SPS酶活不斷增強(qiáng)，在SPS催化下，蔗糖含量不斷增加，單糖含量不斷下降。在果實(shí)發(fā)育早期，SPS基因的表達(dá)量很低，授粉后20 d表達(dá)量開始增加，并在授粉后70 d達(dá)到頂峰，轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢和酶活力變化趨勢相同。SPS酶活和蔗糖含量在授粉后80 d達(dá)到最大，比SPS基因轉(zhuǎn)錄峰值晚10 d左右。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SPS基因的轉(zhuǎn)錄水平和SPS酶活確實(shí)存在一定相關(guān)性。甜瓜授粉25 d后檢測到CmSPS1基因表達(dá)，果實(shí)成熟時(shí)基因表達(dá)量達(dá)到峰值。甜瓜授粉30 d后SPS酶活開始增加，蔗糖積累開始增加。SPS基因表達(dá)和甜瓜SPS酶活力變化也存在一定相關(guān)性。在溫州蜜桔果實(shí)中3個(gè)SPS基因CitSPS1，CitSPS2和CitSPS3獨(dú)立表達(dá)調(diào)控。CitSPS1基因在果實(shí)發(fā)育全程都會(huì)表達(dá)，果實(shí)成熟階段（開花后223 d）表達(dá)量達(dá)到峰值，開花后178 d CitSPS2基因開始表達(dá)，CitSPS3基因在果實(shí)發(fā)育過程中都不表達(dá)。這些報(bào)道表明，在植物蔗糖含量大量增加的生長發(fā)育階段，SPS基因大量表達(dá)，且基因表達(dá)量峰值出現(xiàn)的時(shí)間早于蔗糖含量峰值出現(xiàn)的時(shí)間。這可能是因?yàn)镾PS基因需要一定時(shí)間轉(zhuǎn)錄mRNA并翻譯成SPS才能發(fā)揮作用并影響植物的生理、生化過程。

2.3 非生物因素對SPS基因表達(dá)的影響

在特定環(huán)境下，非生物因素會(huì)對植物生長造成影響。SPS不僅是植物蔗糖代謝中的關(guān)鍵酶，還在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著多方面生物學(xué)功能，如參與植物的抗逆生理。已有研究發(fā)現(xiàn)SPS在抗寒、抗旱等生理過程中起重要作用[46]。在非生物因素處理下SPS基因的表達(dá)也會(huì)發(fā)生變化，且這種變化是可逆的（表2）。

Dorothea Bartels干旱處理復(fù)活草葉片，發(fā)現(xiàn)新鮮葉片脫水初期SPS基因的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)增加，隨著干燥程度增加，SPS基因會(huì)降低到一個(gè)極低的轉(zhuǎn)錄水平，SPS基因轉(zhuǎn)錄水平會(huì)在葉片復(fù)水后24 h內(nèi)逐漸恢復(fù)。Dibyendu N. Sengupta研究了3個(gè)香蕉[47]品種Cavendish，Kanthali和 Monthan成熟過程中乙烯處理對SPS基因表達(dá)的影響。不同品種對乙烯的敏感程度不同。乙烯處理Cavendish后，SPS基因的轉(zhuǎn)錄水平大量上調(diào)，Kanthali乙烯處理后，SPS基因轉(zhuǎn)錄水平溫和上調(diào)，而Monthan品種整個(gè)成熟過程中SPS基因轉(zhuǎn)錄都維持在一個(gè)較低的水平，且乙烯處理也沒有刺激SPS基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)。2008年Dibyendu N. Sengupta又報(bào)道了香蕉[48]在生長素、傷害、低溫處理下SPS基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。生長素和低溫處理輕微增加了SPS基因的轉(zhuǎn)錄水平，而傷害處理降低了其轉(zhuǎn)錄水平。

非生物因素對SPS基因表達(dá)的影響主要表現(xiàn)在2個(gè)方面：當(dāng)非生物因素變化使植物蔗糖合成增加時(shí)，SPS基因表達(dá)會(huì)上調(diào)。如增強(qiáng)植物光合作用或者提高培養(yǎng)基葡萄糖含量，在干旱、低溫等脅迫處理下蔗糖合成也會(huì)增加，蔗糖會(huì)作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子傳遞脅迫信號并誘導(dǎo)植物發(fā)生特定生理生化過程來適應(yīng)環(huán)境變化；另一方面，當(dāng)脅迫壓力持續(xù)過大影響到植物正常代謝活動(dòng)時(shí)，SPS基因表達(dá)就會(huì)迅速降低。

3 展望

3.1 SPS基因在蔗糖代謝中的研究前景

盡管許多研究都表明SPS基因確實(shí)參與了植物蔗糖代謝，但是蔗糖代謝過程極其復(fù)雜，中間涉及多種基因的相互作用。在桃中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)6種非同源基因[49]參與了蔗糖代謝，在這些基因中，SPS基因研究最深入，未來將會(huì)更精確的定位其在植物蔗糖代謝通路中發(fā)揮的作用。SPS基因被認(rèn)為是最有發(fā)展前景的蔗糖代謝相關(guān)基因之一。

蔗糖含量、蔗糖代謝酶活性、蔗糖代謝基因轉(zhuǎn)錄水平三者之間的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律一直是研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)在很多植物中都有了報(bào)道，但還缺乏系統(tǒng)認(rèn)識，仍然需要在更多的植物中開展相關(guān)研究。SPS是重要的蔗糖代謝酶，過去SPS研究多集中在蛋白水平，未來將會(huì)更深入研究SPS基因，探索SPS基因的表達(dá)規(guī)律并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對其進(jìn)行功能驗(yàn)證。

3.2 SPS基因的應(yīng)用前景

全球能源危機(jī)也日趨嚴(yán)重，清潔可再生的生物質(zhì)能源應(yīng)用前景廣闊，但是一直受到原料轉(zhuǎn)化率低的限制。提高生物質(zhì)能源原料中蔗糖含量無疑是提高原料轉(zhuǎn)化率有效且可行的辦法之一。SPS基因是植物蔗糖代謝中的一個(gè)重要基因[50]，可能是提高植物中蔗糖含量的關(guān)鍵基因。對SPS基因進(jìn)行更深入研究并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高生物質(zhì)能源原料中蔗糖含量可以突破原料轉(zhuǎn)化率低這一限制生物質(zhì)能源利用的瓶頸，SPS基因應(yīng)用前景非常廣闊。

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