黃天志， 王世杰 ， 劉秀明， 劉 虹， 吳沿友， 羅緒強

（1. 中國科學院地球化學研究所，環(huán)境地球化學國家重點實驗室，貴州 貴陽550002；2. 中國科學院普定喀斯特生態(tài)系統(tǒng)觀測研究站，貴州 安順562100；3. 中國科學院大學，北京100049；4. 貴州師范學院，貴州 貴陽550018）

草酸是廣泛存在于植物體中的簡單二元羧酸，參與植物體內(nèi)多種生理代謝過程，主要以水溶態(tài)和不溶于水的結(jié)晶態(tài)形式存在，其中以結(jié)晶態(tài)存在的草酸可以固定植物體內(nèi)高達90% 的鈣［1，2］。研究表明，植物體內(nèi)草酸可能的來源包括乙醇酸、乙醛酸氧化、L-抗壞血酸裂解氧化、草酰乙酸裂解等途徑，但參與草酸鈣晶體形成的草酸具體來自于哪條途徑卻并不清楚［1，3，4］。因此，建立一種簡單高效的方法測定乙醇酸、乙醛酸等草酸合成前體及不同形態(tài)草酸的含量，對研究草酸合成途經(jīng)及其對應的生理功能具有重要的意義。

草酸等有機酸常用的分析方法有毛細管電泳法［5-7］、離子排斥色譜法［8］以及最常用的高效液相色譜法［9，10］。采用高效液相色譜法同時測定樣品（食品、飲料、發(fā)酵產(chǎn)品及植物組織等）中的草酸及其他多種有機酸的方法常有報道，但同時測定草酸、乙醇酸及乙醛酸的方法還鮮有報道。目前有機酸的測定方法中，針對同一樣品分形態(tài)提取并測定草酸等有機酸的研究還很少，僅側(cè)重于水溶性有機酸的提取測定［11，12］，或者用鹽酸、硝酸等無機酸提取測定不同形態(tài)有機酸的總含量［3，13］。在需要不同形態(tài)草酸等有機酸的含量時，往往需要建立兩種不同的色譜條件，分別測定酸溶態(tài)含量和水溶態(tài)含量，然后計算獲得所需形態(tài)有機酸含量，這種方法在準確性和操作簡便性方面都有待提高。此外，在同時測定草酸、酒石酸、乙醇酸、乙醛酸等的過程中，也存在一些需要解決的問題，例如以鹽酸和硝酸等無機酸作為提取介質(zhì)時，無機酸本身的吸收容易干擾測定的結(jié)果［13］；草酸、酒石酸獲得基線分離的難度較大［11］；乙醇酸、乙醛酸需要先衍生后測定［10，14］等。本方法首先以水為提取介質(zhì)，提取了水溶態(tài)草酸等8 種有機酸，而以草酸鈣結(jié)晶等形態(tài)存在的草酸不溶于水，保留在固態(tài)殘渣中；然后以稀鹽酸為提取介質(zhì)提取了酸溶性結(jié)晶態(tài)草酸。測定時采用磷酸二氫鉀水溶液作為流動相，通過控制不同測定時段流動相的流速，在5 min 內(nèi)完成了8 種有機酸的分離測定，并且在水溶態(tài)有機酸獲得基線分離的同時，相同色譜條件下測定酸溶態(tài)草酸，較好地去除了鹽酸對酸溶態(tài)草酸測定的干擾。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 UPLC 液相色譜系統(tǒng)，配備二元泵（G4220B）、高性能自動進樣器（G4226A）、柱溫箱（G1316C）、二極管陣列檢測器（G4212A）；pHS-3C型精密酸度計（上海雷磁）；超微量天平Cubis（德國Sartorius）；0.22 μm 有機系濾膜（美國Whatman公司）。

8 種有機酸標準品均為色譜純，草酸、乙酸、一水乙醛酸為Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品，乙醇酸、酒石酸、琥珀酸為Fluka 公司產(chǎn)品，蘋果酸、檸檬酸為Supelco 公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈為色譜純，Dikma 公司出品；磷酸為色譜純，磷酸二氫鉀、鹽酸、草酸鈣為優(yōu)級純，均為天津科密歐公司產(chǎn)品；實驗用水均為超純水（18.2 MΩ·cm，Millipore）。

1.2 實驗步驟

1.2.1 標準溶液制備

準確稱取一水乙醛酸124.4 mg，草酸、乙醇酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸、檸檬酸各100 mg，用超純水分別溶解并定容到50 mL；準確量取191 μL 乙酸，用超純水定容到100 mL。由此獲得2 g／L 的單一有機酸儲備液，4 ℃下避光保存。使用時根據(jù)所需濃度用超純水稀釋，或混合配制混合酸。另外，準確量取鹽酸4.106 mL，用超純水定容到100 mL，配制成0.5 mol／L（18.23 g／L）的鹽酸溶液備用。

1.2.2 樣品前處理

所使用的植物樣品為溫室水培獲得的諸葛菜（十字花科諸葛菜屬，又名二月蘭，學名Orychophragmus violaceus）的葉片和根。將葉片和根鮮樣用超純水沖洗干凈，吸盡表面水分，各稱取1.00 g。加入5 mL 超純水研磨勻漿，將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管，30 ℃下振蕩提取15 min，提取液于12 000 r／min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集上清液。加入5 mL超純水沖洗離心管中殘渣，同條件提取并離心收集上清液，該過程重復3 次。用超純水將收集到的上清液定容到25 mL，此過程提取液為8 種水溶態(tài)有機酸樣品（提取液Ⅰ）。向上述提取殘渣中加入5 mL 0.5 mol／L HCl 溶液，80 ℃水浴振蕩提取1 h，12 000 r／min 離心10 min 后收集上清液。采用5 mL 0.5 mol／L HCl 溶液沖洗殘渣，同條件提取，重復3 次，用超純水定容提取液至25 mL，此提取液為不溶于水的草酸樣品（提取液Ⅱ）。分別取1.5 mL上述兩種提取液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，測定提取液Ⅰ中8 種可溶性有機酸的含量，在相同色譜條件下測定提取液Ⅱ中酸溶態(tài)草酸的含量。

1.3 實驗條件

Hypersil ODS （200 mm ×4.6 mm，5 μm）色譜柱，柱溫30 ℃；KH2PO4水溶液（5 mmol／L，用H3PO4調(diào)pH 為2.8）作為流動相；進樣量5 μL；檢測波長210 nm。流速控制:0 ～1.4 min，1.4 mL／min；1.4 ～1.9 min，0.5 mL／min；1.9 ～5.0 min，1.4 mL／min。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相組成

硫酸［15，16］和磷酸鹽緩沖體系［9-13，17-20］是有機酸分離常采用的流動相。因本實驗使用HCl 作為提取介質(zhì)，為避免其他無機酸的干擾，選擇磷酸鹽緩沖體系作為流動相，其中磷酸二氫鉀因其較高的分離效率和極低的本底吸光度而被廣泛采用。在采用KH2PO4溶液作為流動相分離有機酸時，其濃度從10 mmol／L 到36.7 mmol／L（0.5%）［9，11-13，17-19］均有報道，但用于分離草酸、乙醇酸和乙醛酸的KH2PO4溶液的濃度還少有報道。為尋找有效分離的最適KH2PO4溶液濃度，本實驗配制了0、3、5、7、10、15、20、30、40 mmol／L 的KH2PO4溶 液（用H3PO4調(diào) pH 為2.7）。色譜分離結(jié)果表明，KH2PO4溶液的濃度對蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸和乙酸的保留時間影響較小，在不同濃度的KH2PO4溶液條件下這4 種有機酸都能得到較好的分離。而草酸、鹽酸、乙醛酸、酒石酸、乙醇酸保留時間接近，當KH2PO4溶液濃度大于10 mmol／L 時，草酸、鹽酸、乙醛酸不能實現(xiàn)有效分離；當流動相中KH2PO4溶液濃度小于5 mmol／L 時，乙醇酸、酒石酸的分離效果受到鹽酸干擾；KH2PO4溶液濃度介于5 mmol／L至10 mmol／L 之間時，8 種有機酸能較好地實現(xiàn)分離且不受鹽酸干擾。從節(jié)約成本和環(huán)保的角度考慮，本實驗最終選擇5 mmol／L KH2PO4溶液作為流動相。

本實驗還考察了在磷酸鹽緩沖體系中加入有機相對分離效果和峰形的影響。結(jié)果表明，在5 mmol／L KH2PO4水溶液中加入甲醇會使草酸和HCl 的出峰時間延遲，當甲醇的體積比大于5% 時，草酸和乙醛酸不能有效分離，且甲醇的加入并沒有顯著地改善峰形，故本實驗使用的流動相僅為KH2PO4溶液。

2.1.2 流動相pH 的選擇

有機酸為弱酸，流動相pH 的大小直接影響其在磷酸鹽緩沖體系中的解離程度。本實驗測定以H3PO4調(diào)節(jié)流動相為不同pH 條件下的各有機酸保留時間（見圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各有機酸保留時間對流動相pH 變化非常敏感，pH ＜2.6 時酒石酸、乙醇酸、乙醛酸分離效果不理想；pH 2.8 時各有機酸獲得了最佳分離效果；pH ＞2.8 時乙醛酸、乙醇酸和酒石酸的分離度降低，且鹽酸的干擾不能去除。因此選擇pH 值為2.8 的KH2PO4溶液。

圖1 流動相pH 對有機酸保留時間的影響Fig.1 Effect of pH value of mobile phase on the retention times of the organic acids

2.1.3 流速對分離效果的影響

流速直接影響各有機酸的保留時間。以5 mmol／L 的KH2PO4溶液（pH 2.8）為流動相，草酸、鹽酸、乙醛酸、酒石酸都能有效分離但保留時間較為接近，需要控制較低流速來獲得基線分離；而酒石酸、乙醇酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸和乙酸峰形很好且保留時間間隔較大，因此需要調(diào)節(jié)不同的流速使所有組分獲得基線分離的同時縮短分離時間。本實驗采用分段控制流速的方法實現(xiàn)。0 ～1.4 min，流速1.4 mL／min，此時沒有出峰；1.4 ～1.9 min，流速為0.5 mL／min，草酸、鹽酸、乙醛酸和酒石酸實現(xiàn)較好的分離；1.9 ～5 min，流速為1.4 mL／min，其余5種有機酸得到快速且完全的分離。結(jié)果表明采用分段控制流速的方法，5 min 內(nèi)能夠完成8 種有機酸的有效分離，同時有效去除了鹽酸對酸溶態(tài)草酸測定的干擾。有機酸標準樣品的色譜圖如圖2 所示。

2.1.4 檢測波長及柱溫、柱壓條件

圖2 有機酸標準樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of organic acid standard mixtures

采用二極管陣列檢測器掃描了各有機酸在190～400 nm 范圍內(nèi)的吸收，發(fā)現(xiàn)各有機酸在210 nm處有最大吸收，確定210 nm 為檢測波長。實驗測試了25、30、35 ℃3 個柱溫，發(fā)現(xiàn)柱溫對有機酸的分離沒有顯著影響，綜合考慮設定柱溫箱溫度為30℃。實驗過程中因為分時段控制流速，因此柱壓隨流速的變化而變化。在流速為1.4 mL／min 時，柱壓范圍為11 ～12 MPa；流速為0.5 mL／min 時，柱壓范圍為7 ～8 MPa。本實驗所用UPLC 色譜系統(tǒng)柱壓的高壓限值為40 MPa，實驗過程中柱壓均保持在低于限值的合理范圍內(nèi)。

2.2 方法的線性范圍和檢出限

在1 ～2 000 mg／L 之間設置了10 個標準樣品濃度梯度，重復進樣3 次，以峰高Y（mAU）對質(zhì)量濃度X（mg／L）進行線性回歸得出各有機酸的線性方程及線性范圍。選擇線性范圍下限濃度的有機酸標準樣品重復進樣7 次，并以信噪比為3（S／N ＝3）確定檢出限，以線性范圍下限濃度作為本實驗實測樣品的定量限。除乙醇酸、乙醛酸未能找到類似測定方法的檢出限數(shù)據(jù)進行比較外，其他各目標有機酸在本實驗所采用的色譜條件下的檢出限均有不同程度降低，其中乙酸和琥珀酸的檢出限水平略微高于文獻［9，12］可查的最低值，但仍然處于較低水平。具體結(jié)果見表1。

2.3 回收率和精密度

回收率試驗所用植物樣品為供鈣實驗中供鈣水平接近正常植物生境的一組樣品。取相同根和葉片樣品各3 份，其中一份作本底，測定各有機酸的含量和不同形態(tài)草酸的含量；另外兩份分別添加兩種水平的8 種有機酸標準溶液和1 mg 草酸鈣（用以計算以稀鹽酸為介質(zhì)提取的酸溶態(tài)草酸的回收率）。按照1.2.2 節(jié)所述提取方法進行前處理，每份樣品進行7 次平行測定。為了研究葉片和根可能存在的吸附效應的差異對回收率的影響，本實驗分別計算了葉片和根的加標回收率和RSD，結(jié)果見表2。

表1 8 種有機酸的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限Table 1 Regression equations，correlation coefficients （R2），linear ranges and LODs of the eight organic acids

表2 植物葉片與根中有機酸的回收率及精密度（n ＝7）Table 2 Recoveries and precisions of organic acids from plant leaves and roots （n ＝7）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

2.4 實際樣品測定

水培實驗設計了梯度供鈣水平，用以研究不同鈣營養(yǎng)水平對諸葛菜有機酸組成和分布特征的影響。因為鈣是植物生長的必需元素，所以本實驗并沒有設置鈣的空白對照，而是設置了正常土壤供鈣水平和極端高鈣土壤的供鈣水平，分別對應低供鈣水平（5 mmol／L）和高供鈣水平（50 mmol／L）。

采集不同供鈣處理的樣品，按1.2.2 節(jié)方法完成前處理，進樣5 μL 測試分析，樣品測定色譜圖見圖3，測定結(jié)果見表3。

表3 實際樣品中有機酸的含量Table 3 Contents of organic acids in real samples

結(jié)果表明:（1）葉片中水溶態(tài)有機酸含量與供鈣水平有良好的響應關(guān)系；根組織中除乙醛酸和草酸外，其他水溶態(tài)有機酸含量對供鈣水平不敏感；（2）不同組織中不同形態(tài)草酸的含量均與供鈣水平具有良好的響應關(guān)系。

3 結(jié)論

本文建立了逐級提取、一步測定的方法，快速準確地提取測定了植物組織中不同形態(tài)的草酸以及和草酸合成相關(guān)的8 種有機酸?；厥章试囼灪蛯嶋H樣品測定結(jié)果表明，本方法準確可靠，顯著降低了目標有機酸測定的最低檢出限，提高了方法的靈敏度，可以應用到草酸等有機酸的相關(guān)研究中。本方法避免了不同介質(zhì)提取、不同色譜條件測定帶來的誤差，有效去除了無機酸對測定的干擾，5 min 內(nèi)完成測定，提高了測定效率。同時，本方法測定酸溶態(tài)有機酸時，考慮到以無機酸作為提取介質(zhì)所提取的成分較以水為提取介質(zhì)提取的成分更為復雜，可能會干擾在本實驗所采用的色譜條件下除草酸外的其他目標有機酸的測定，因此本方法只使用草酸數(shù)據(jù)，不使用其他有機酸的數(shù)據(jù)。在今后的工作中，隨著測定儀器的不斷升級，有機酸的測定方法仍然需要不斷地改進和完善，需發(fā)展更加靈敏準確、方便快捷的分析測定方法。

［1］ Franceschi V R，Nakata P A. Annu Rev Plant Biol，2005，56:41

［2］ Chen Z，Geng H C，Wang S S，et al. Molecular Plant Breeding （陳崢，耿華春，王沙沙，等. 分子植物育種），2007，5（6（S））:105

［3］ Xu H W，Ji X M，He Z H，et al. J Exp Bot，2006，57（9）:1899

［4］ Yu L，Jiang J Z，Zhang C，et al. J Exp Bot，2010，61（6）:1625

［5］ Tuma P，Samcova E，Stulik K. Anal Chim Acta，2011，685（1）:84

［6］ Han H F，Wang Q，Liu X，et al. Chinese Journal of Chromatography （韓海峰，王慶，劉霞，等. 色譜），2012，30（5）:538

［7］ Guan J，Wang H Z，Ren L Y，et al. Chinese Journal of Chromatography （關(guān)瑾，王慧澤，任麗艷，等. 色譜），2012，30（1）:107

［8］ Lin X J，Wei W，He Z G，et al. Chinese Journal of Chromatography （林曉婕，魏巍，何志剛，等. 色譜），2014，32（3）:304

［9］ Gao H Y，Liao X J，Wang S G，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry （高海燕，廖小軍，王善廣，等. 分析化學），2004，32（12）:1645

［10］ Ji X M，Yang C，Yang J，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry （籍秀梅，楊崇，楊軍，等. 分析化學），2005，33（4）:527

［11］ Guo Y，Xiao Z P，Wang H，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry （郭瑛，肖朝萍，王紅，等. 分析化學），2004，32（12）:1624

［12］ Jin G W，Zhang F F，Xue X Y，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry （金高娃，章飛芳，薛興亞，等. 分析化學），2006，34（7）:987

［13］ Yu L，Peng X X，Yang C，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry （俞樂，彭新湘，楊崇，等. 分析化學），2002，30（9）:1119

［14］ Keates S E，Tarlyn N M，Loewus F A，et al. Phytochemistry，2000，53（4）:433

［15］ Ma R，Ouyang J，Li X，et al. Chinese Journal of Chromatography （馬瑞，歐陽嘉，李鑫，等. 色譜），2012，30（1）:62

［16］ Guo Y，Liang J，Li M M，et al. Food Science（郭燕，梁俊，李敏敏，等. 食品科學），2012，33（2）:227

［17］ Lu M，Zhang S Y，Zhang W N，et at. Food Science （陸敏，張紹巖，張文娜，等. 食品科學），2012，33（14）:235

［18］ Cawthray G R. J Chromatogr A，2003，1011（1／2）:233

［19］ Zotou A，Loukou Z，Karava O. Chromatographia，2004，60:39

［20］ Lin L C. Applied Chemical Industry （林靈超. 應用化工），2013，42（4）:756