祝偉霞， 孫轉(zhuǎn)蓮， 袁 萍， 楊冀州 ， 劉亞風(fēng)， 孫武勇

（河南出入境檢驗(yàn)檢疫局，河南 鄭州450003）

罌粟殼中殘留約0.2% 的嗎啡和其他生物堿，該濃度含量的生物堿對吸毒者不起作用，但不法分子將其摻入火鍋料或調(diào)味品吸引消費(fèi)者，食客吃了這種食品易產(chǎn)生依賴性成癮。長期食用含有罌粟生物堿的食物會對人類的神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)造成危害。早在20 世紀(jì)90 年代，衛(wèi)生部、公安部、工商局聯(lián)合發(fā)布了〔91〕第32 號《關(guān)于查處在食品中使用罌粟殼（籽）等違法行為的通知》，組織各地依法查處罌粟殼火鍋。食品整治辦〔2008〕3 號公布《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》，將火鍋料中非法添加罌粟殼作為重點(diǎn)監(jiān)測項(xiàng)目（http:／／www.moh.gov.cn／sps／s7892／201406／38e5c8a53615486 888d93ed05ac9731a. shtml）。為了有效地監(jiān)督我國火鍋料的質(zhì)量安全，建立一種準(zhǔn)確可靠的罌粟生物堿確證分析方法非常必要。

近年來，為了監(jiān)控毒品交易，研究者在吸毒者毛發(fā)［1］、血液［2］、尿液［3］、唾液［4］等生物樣本中開展嗎啡、可卡因、可待因等違禁生物堿的篩查，常采用分子生物學(xué)方法［5］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［6］、液相色譜-熒光檢測法［7］、液相色譜-質(zhì)譜法［2-4，8］分析罌粟生物堿。鑒于我國食品安全的現(xiàn)狀，國內(nèi)研究者率先建立了液相色譜-質(zhì)譜法［9，10］測定火鍋中嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁等5 種違禁生物堿的分析方法，并發(fā)布1 項(xiàng)地方標(biāo)準(zhǔn)［11］。這些方法均是采用液相色譜-質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）技術(shù)分析食品中5 種違禁生物堿。但采用MRM 技術(shù)檢出的火鍋料陽性結(jié)果不能獲得其質(zhì)譜全掃描確證信息，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。本文將樣品在模擬食用模式下浸泡提取罌粟殼中5 種標(biāo)志性生物堿，陽離子混合模式固相萃取凈化，采用MRM 同步在線增強(qiáng)子離子全掃描技術(shù)（EPI），根據(jù)其質(zhì)譜信息實(shí)現(xiàn)了低濃度目標(biāo)物的定性鑒定，解決了火鍋料中5 種特征生物堿陽性確證難題；同時采用同位素內(nèi)標(biāo)跟蹤準(zhǔn)確定量，為執(zhí)法部門提供了可靠的技術(shù)保障。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀（美國Waters 公司），API 5500Q 液相色譜-質(zhì)譜儀（配QTrap 線性離子阱質(zhì)譜，美國Applied Biosystems 公司）；SA-31 振蕩器（日本大和公司）；CF15RXII 離心機(jī)（日本Hitachi 公司）；24 位固相萃取裝置（德國CNW 公司）；N-EVAP112 氮吹儀（美國Organomation Associates 公司）；Oasis MCX 柱（6 mL／150 mg，美國Waters 公司）；0.2 μm 有機(jī)相濾膜（天津津騰公司）；嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可丁、20 mg／L 嗎啡D3 和可待因D3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（中國食品藥品檢定研究院）；甲醇和乙酸乙酯（色譜純，美國Fisher 公司）；冰乙酸和乙酸銨（色譜純，美國Sigma-Aldrich 公司）；濃氨水、濃鹽酸均為市售分析純試劑；水為Millipore 純水系統(tǒng)制得的高純水（電阻率≥18 MΩ·cm）。

1.2 溶液的配制

分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品10 mg 于100 mL 容量瓶中，加入甲醇-水（1∶1，v／v）溶解并定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為100 mg／L 的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于-18 ℃下冷凍保存，有效期為6 個月。取上述單標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇-水（1 ∶1，v／v）稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg／L 的混合工作溶液，放入冰箱中于2 ～4 ℃下儲存，有效期為1 個月?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:按照操作方法所述制得空白樣品提取液，使用前用其稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制成合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。同位素內(nèi)標(biāo)溶液:取適量嗎啡D3 和可待因D3 標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇-水（1∶1，v／v）配制成質(zhì)量濃度為0.8 mg／L工作溶液。0.125 mol／L 鹽酸溶液:將11.25 mL 濃鹽酸定容到1 000 mL 水中即得。5% 氨化乙酸乙酯-甲醇（1∶1，v／v）:取5 mL 氨水加入至95 mL 乙酸乙酯-甲醇（1∶1，v／v）混合液中即得。5 mmol／L乙酸銨甲醇:稱取0.385 g 乙酸銨加入1 mL 水溶解后，用1 L 甲醇稀釋即得。10 mmol／L 乙酸銨溶液（pH 3.6）:稱取0.77 g 乙酸銨加入700 水溶解，用冰乙酸調(diào)pH 3.6，用水定容至1 L 即得。

1.3 儀器條件

色譜柱:CAPCELL PAK ST （150 mm × 2.1 mm）；柱溫:35 ℃；流動相:5 mmol／L 乙酸銨甲醇（A）與10 mmol／L 乙酸銨溶液（pH 3.6）（B）；梯度洗脫程序:0 ～1.0 min，10% A；1.0 ～3.0 min，10% A ～90% A；3.0 ～6.0 min，90% A；6.0 ～6.1 min，90% A ～10% A；6.1 ～10.1 min，10% A。Vaclo 六通閥位置:0 ～1.0 min 至廢液，1.0 ～6.0 min進(jìn)質(zhì)譜；6.1 min 后至廢液。流速:0.3 mL／min；進(jìn)樣量:10 μL。

電噴霧離子源正離子電離（ESI ＋）MRM 模式；霧化氣壓力:413.7 kPa （60 psi）；氣簾氣壓力:172.4 kPa （25 psi）；噴霧電壓:5 000 V；去溶劑溫度:550 ℃；去溶劑氣壓力:344.8 kPa （50 psi）；碰撞氣壓力:69 kPa （10 psi）；每個離子對駐留時間:100 ms；去簇電壓（DP）:80 V；每種化合物的檢測離子對、碰撞室出口電壓（CXP）、射入電壓（EP）、碰撞能量（CE）等質(zhì)譜參數(shù)見表1。在線全掃描條件:每次選擇2 個最強(qiáng)峰，動態(tài)背景扣除，不排除前級掃描過的離子，掃描強(qiáng)度閥值為3 000 cps，EPI掃描范圍為m／z 50 ～450，在CE 為35 eV 下掃描，其他質(zhì)譜參數(shù)同MRM 模式，用標(biāo)準(zhǔn)溶液在MRMEPI 方法下獲得子離子掃描質(zhì)譜圖，并建立質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)圖庫，供5 種生物堿定性檢索用。

表1 5 種生物堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the five alkaloids

1.4 樣品前處理

稱取5.0 g 試樣于50 mL 具塞離心管中，加入50 μL 同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液，加入25 mL 0.125 mol／L 鹽酸溶液，渦旋1 min 后，于80 ℃水浴中加熱提取30 min，每隔10 min 渦旋混勻1 min，取出冷卻至50 ℃左右，緩慢加入10 mL 正己烷，渦旋混勻2 min，于4 000 r／min 下離心10 min，棄去上層溶液，待凈化。

MCX 柱依次用6 mL 甲醇、6 mL 水、6 mL 稀鹽酸溶液活化后，將10 mL 樣液上載至固相萃取柱中，待樣液全部流出后用6 mL 水、6 mL 甲醇淋洗，柱體保持抽干5 min，然后用5 mL 氨化乙酸乙酯-甲醇混合液洗脫，收集洗脫液并用氮?dú)饬鳚饪s至干，加入1 mL 5 mmol／L 乙酸銨甲醇-10 mmol／L 乙酸銨（pH 3.6）（1∶9，v／v）溶解殘?jiān)?，?jīng)濾膜過濾后進(jìn)行儀器測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 罌粟生物堿分析對象的選擇

為了確定罌粟中主要的生物堿，本方法將粉碎后的罌粟殼0.1 g 加入10 mL 1% （v／v）乙酸提取后進(jìn)行儀器測定，測定結(jié)果經(jīng)歸一化計(jì)算，檢出嗎啡50.2%、可待因8.6%、罌粟堿5.0%、那可丁35.5%、蒂巴因0.5%、原阿片堿0.2%。因此本方法將含量較高的嗎啡、那可丁、可待因、罌粟堿、蒂巴因作為火鍋料中違禁添加罌粟殼的特征標(biāo)志物。

2.2 提取方法的選擇

火鍋料富含多種動植物油脂及辛辣物質(zhì)，樣品均勻性差。目前提取火鍋料主要采用有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸或弱酸緩沖液等方法。本方法將陰性火鍋料樣品添加罌粟殼后，分別試驗(yàn)了乙腈、稀鹽酸溶液、pH 5.2 的乙酸銨溶液的提取效果，結(jié)果表明稀鹽酸溶液的測定值最高（嗎啡135.2 μg／kg、可待因27.5 μg／kg、蒂巴因1.3 μg／kg、罌粟堿11.6 μg／kg、那可丁75.4 μg／kg）；乙腈提取時蒂巴因未檢出，嗎啡、可待因、罌粟堿和那可丁的測定結(jié)果均較稀鹽酸低35% 左右；乙酸銨溶液提取時嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁均低12% 左右。因此本方法選用稀鹽酸作為提取溶液。

因火鍋料食用方法特殊，研究又考察了稀鹽酸溶液在不同溫度下5 種生物堿的提取效果，結(jié)果表明溫度越高，生物堿提取效率越高，在80 ℃時達(dá)到最高，升溫至100 ℃，測定值不變。同時加熱時間延長，生物堿的測定值也呈線性增加，30 min 時最佳。因此本方法選擇于80 ℃下提取30 min。

2.3 凈化方法的優(yōu)化

火鍋料中罌粟生物堿的提取和凈化主要采用液液萃取、QuEChERS 和固相萃取等方法。液液萃取是在堿性條件下采用氯仿、乙醚或乙酸乙酯液液萃取，該方法操作復(fù)雜，主要用于常規(guī)含量樣品的分析。本實(shí)驗(yàn)考察了QuEChERS 法凈化5 種生物堿的效果。樣品經(jīng)乙腈提取后，經(jīng)硫酸鎂、C18、PSA填料凈化后直接測定。該方法操作簡單，但基質(zhì)干擾物多，凈化效果差，5 種生物堿回收率均在40% 左右。本實(shí)驗(yàn)還考察了3 種固相萃取柱的凈化效果:1.pH 8.5 的弱堿性溶液過親水-親脂平衡SPE 柱（HLB）；2.稀鹽酸溶液過強(qiáng)陽離子SPE 柱（MCX）；3.乙酸銨緩沖液過弱陽離子SPE 柱（WCX）。結(jié)果表明以上3 種SPE 方法對待測生物堿均有較好的富集，試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液過柱的洗脫回收率均大于90%；但受樣品基質(zhì)的影響，HLB 柱和WCX 柱對火鍋料中的目標(biāo)物回收率為44.1% ～72.5%，而MCX柱的回收率為73.8% ～94.3%。因此本方法選用MCX 柱作為SPE 凈化柱。在該SPE 方法中，5 種待測生物堿與固相萃取填料之間發(fā)生陽離子交換作用，反應(yīng)速度慢，因此在進(jìn)行固相萃取操作過程中，要控制樣液流速小于1 mL／min。

采用添加1.0 mg／kg 的陽性樣品試驗(yàn)了5% 氨化甲醇、5% 氨化乙酸乙酯、5% 氨化乙酸乙酯-甲醇（1∶1，v／v）等不同溶劑的洗脫效率。分析結(jié)果表明9 mL 5% 氨化甲醇、12 mL 5% 氨化乙酸乙酯、5 mL 5% 氨化乙酸乙酯-甲醇可完全洗脫5 種生物堿。最終本方法選擇5 mL 5% 氨化乙酸乙酯-甲醇作為凈化柱的洗脫溶劑。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性考察

為了考察標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性，在1 年時間內(nèi)測定了標(biāo)準(zhǔn)儲備液的穩(wěn)定性（見圖1）。結(jié)果表明，180天內(nèi)5 種生物堿測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.05%；嗎啡和可待因240 天、那可丁和罌粟堿300天時開始降解；蒂巴因在360 天內(nèi)穩(wěn)定，測定值的RSD 為0.04%。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液在不同貯存時間的測定結(jié)果Fig.1 Determination results of standard stock solution at different storage times

2.5 定量方法的優(yōu)化

質(zhì)譜的電噴霧電離模式易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。為了考察本方法的基質(zhì)效應(yīng)，分別制得試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 種生物堿均有基質(zhì)抑制現(xiàn)象，嗎啡和罌粟堿的信號響應(yīng)降低1／2，可待因、那可丁和蒂巴因均降低約4／5。由于每種火鍋底料基質(zhì)是唯一的，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液很難制得，因此采用外標(biāo)法定量時準(zhǔn)確度差。為了彌補(bǔ)基質(zhì)的電離抑制效應(yīng)，本方法采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

2.6 色譜條件的選擇

5 種生物堿屬極性到中等極性化合物，由于嗎啡、可待因的兩性電荷特征，2 種分析物在普通C18柱中易出現(xiàn)雙峰，在高比例水相和有機(jī)相中均可被洗脫。方法試驗(yàn)了極性酰胺基柱（Amide）分離5 種生物堿的效果，5 種分析物在該體系中的保留行為與反相柱相反，水作為強(qiáng)洗脫液，增加其比例可使化合物的保留時間縮短，那可丁和罌粟堿峰形對稱，但蒂巴因峰形拖尾，嗎啡和可待因色譜峰寬達(dá)2 min，調(diào)節(jié)流動相的pH 為3.5 ～6.0 時，色譜峰未改善。采用CAPCELL PAK ST 柱分析5 種生物堿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5種分析物均獲得對稱的峰形，在梯度洗脫條件下，待測化合物保留時間主要在2.0 ～3.5 min 之間。

2.7 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

采用1 mg／L 單標(biāo)準(zhǔn)溶液以流動注射的方式分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定化合物的分子離子。該類化合物的結(jié)構(gòu)使其在正離子模式下易產(chǎn)生強(qiáng)信號［M ＋H］＋峰。再分別以待測物的準(zhǔn)分子離子峰為母離子進(jìn)行子離子全掃描。由子離子質(zhì)譜圖可以看到，嗎啡和可待因具有相同的裂解模式，其子離子碎片均是以不穩(wěn)定多環(huán)中間體C13H11O的中性丟失、電子重排獲得；罌粟堿、那可丁、蒂巴因的特征碎片均以失去甲基或甲氧基為主要裂解方式［12］。方法選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的兩對子離子作為定性與定量離子，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)時發(fā)現(xiàn)，DP 對5 種待測物影響小，在1 ～100 V 之間時響應(yīng)強(qiáng)度相同，其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.8 假陽性結(jié)果的確證

受火鍋料基質(zhì)的影響，在MRM 模式下分析時，嗎啡常檢出“陽性”，雖保留時間有差異，但樣品中嗎啡兩個定性離子同時出現(xiàn)，仍然為定性造成困難。為了提高質(zhì)譜測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本方法采用線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（Q-Ttrap MS）的在線EPI 全掃描技術(shù)，可同時獲得其子離子質(zhì)譜圖進(jìn)行對照分析。方法優(yōu)化了非動態(tài)排除干擾進(jìn)行掃描時的結(jié)果，表明該模式下質(zhì)譜掃描選擇性差；采用動態(tài)排除干擾后對最強(qiáng)峰進(jìn)行掃描，以3 000 cps 作為信號閥值，子離子掃描目標(biāo)性強(qiáng)，5 種生物堿含量在LOQ 水平時均可獲得子離子掃描質(zhì)譜圖。將獲得的子離子全掃描質(zhì)譜圖建立相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)圖庫，樣品分析完成時可自動檢索定性，因此本方法減少了單一MRM 模式下的假陽性幾率（見圖2）。

圖2 （a）嗎啡標(biāo)準(zhǔn)溶液與（b）嗎啡陰性樣品質(zhì)譜圖Fig.2 Comparison of mass spectra of （a）morphine standard solution and （b）negative morphine sample

2.9 方法檢出限、定量限、線性范圍、添加回收率和精密度

將S／N ≥3 定義為LOD，S／N ≥10 定義為LOQ，本方法的LOD、LOQ、線性范圍、線性方程（其中X 為分析物含量（μg／kg），Y 為分析物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比）分別為:嗎啡的LOD 和LOQ 分別為0.5 μg／kg 和2 μg／kg，線性范圍為1 ～200 μg／kg，線性方程為Y ＝0.051 7X ＋0.012 8（R ＝0.999 9）；可待因的LOD 和LOQ 分別為0.2 μg／kg 和1 μg／kg，線性范圍為0.5 ～200 μg／kg，線性方程為Y＝0.054 9 X ＋0.002 29（R ＝0.999 9）；蒂巴因的LOD 和LOQ 分別為0.05 μg／kg 和0.2 μg／kg，線性范圍為0.1 ～200 μg／kg，線性方程為Y ＝0.265X-0.012 7（R ＝0.999 9）；那可丁的LOD 和LOQ 分別為0.05 μg／kg 和0.2 μg／kg，線性范圍為0.1 ～200 μg／kg，線性方程為Y ＝0.286X ＋0.12（R ＝0.999 5）；罌粟堿的LOD 和LOQ 分別為0.05 μg／kg 和0.2 μg／kg，線性范圍為0.1 ～200 μg／kg，線性方程為Y ＝0.050 5X ＋0.124（R ＝0.999 7）。

在陰性麻辣火鍋湯液、火鍋底料、火鍋調(diào)味料、火鍋肉湯等樣品中，分別添加LOQ、2 倍LOQ、4 倍LOQ 3 個水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平平行測定10次，內(nèi)標(biāo)法定量，由表2 可見回收率范圍為64.2% ～110.6%，RSD 為4.2% ～12.5%。

表2 陰性樣品中5 種生物堿的加標(biāo)回收率和精密度Table 2 Recoveries and precisions of the five alkaloids spiked in blank samples

2.10 實(shí)際樣品測定

采用該方法對691 個火鍋料實(shí)際樣品進(jìn)行了檢測，共檢出9 個陽性樣品，測定結(jié)果見表3；陽性樣品均采用MRM 同步在線子離子掃描質(zhì)譜方法確證，質(zhì)譜圖經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫檢索，匹配度達(dá)90% 以上，其特征碎片、離子豐度比、保留時間相同，可確認(rèn)為陽性。圖3 為其中1 個樣品的MRM 色譜圖和EPI質(zhì)譜圖。

表3 9 個陽性樣品的檢測結(jié)果Table 3 Results of nine positive samples

圖3 陽性火鍋樣品的MRM 色譜圖和EPI 質(zhì)譜圖Fig.3 MRM chromatograms and EPI mass spectra of a positive hot pot sample

3 結(jié)論

本研究在著重解決火鍋底料中罌粟殼成分陽性確證問題的基礎(chǔ)上，提出了酸溶液加熱提取-固相萃取濃縮與凈化的前處理方法，結(jié)合MRM-EPI 技術(shù)進(jìn)行定性，同位素內(nèi)標(biāo)法定量，完成了罌粟殼中5 種特征生物堿的準(zhǔn)確測定。該方法快捷可靠，可直接用于分析基質(zhì)復(fù)雜的火鍋料、調(diào)味品、肉湯等樣品中的生物堿成分，并已成功應(yīng)用于餐飲市場抽查樣品的檢測，為火鍋料中違禁罌粟殼的監(jiān)督提供了可靠的技術(shù)基礎(chǔ)。鑒于目前仍然存在一些不法商家添加罌粟殼至食品中的現(xiàn)象，準(zhǔn)確有效地檢測火鍋底料中禁用罌粟殼成分具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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