李 娜, 張玉婷, 劉 磊, 邵 輝, 李 輝, 李 晶, 郭永澤
(天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所,天津300381)
近幾年,隨著食品安全問題日益被重視,食品檢驗機構(gòu)面臨大量的檢測工作。實現(xiàn)多類獸藥同時檢測是許多獸藥殘留分析工作者努力的目標。金剛烷胺是禁用藥物,磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類獸藥是獸醫(yī)臨床上常用且容易被濫用的藥物,農(nóng)業(yè)部對上述獸藥也制定了最大殘留限量(MRLs)標準。因此,建立獸藥多殘留快速檢測方法非常有必要。
液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有高靈敏度和高選擇性的優(yōu)勢,已成為復(fù)雜的動物組織樣品中多類獸藥殘留同時檢測的主流方法[1-7]。這些方法有的同時檢測受體激動劑、喹諾酮和磺胺類獸藥[1],有的同時檢測四環(huán)素類與喹諾酮類獸藥[2],有的同時檢測β-內(nèi)酰胺、大環(huán)內(nèi)酯、磺胺類和氟喹諾酮類[3-6]。但是,四環(huán)素類獸藥理化性質(zhì)特殊,較難與其他多類獸藥同時提取、凈化,因此,文獻報道也較少[7-10]。
QuEChERS 方法快速、簡便、成本低廉、易于操作,已逐步被應(yīng)用于多類獸藥殘留檢測[8-16]。本研究采用改進的QuEChERS 方法提取、凈化樣品,解決了四環(huán)素類獸藥難與其他獸藥同時檢測的難題,結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測,建立了動物源食品中四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類和金剛烷胺4類29 種禁限用獸藥的同時快速檢測方法。與國標方法[17,18]和文獻報道方法[7-10]相比,本研究所建方法操作更簡單、快速,檢測成本更低,適用于各食品檢測機構(gòu)對雞肉、雞肝、豬肉、豬肝樣品中禁限用獸藥殘留的日常監(jiān)控。
AcquityTMUPLC 超高效液相色譜儀,Quattro Premier XE 三重四極桿質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)(美國Waters 公司);QL-901 旋渦混合器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司);H1650 臺式高速離心機(湘儀離心機儀器有限公司);Laborota 4000 efficient 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph);Milli-Q 超純水儀(美國Millipore 公司)。
29 種獸藥包括磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、金剛烷胺、磺胺甲基嘧啶、麻保沙星、磺胺二甲基嘧啶、四環(huán)素、氧氟沙星、土霉素、諾氟沙星、單諾沙星、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲噻二唑、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、金霉素、二氟沙星、沙拉沙星、磺胺氯噠嗪、磺胺甲惡唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺異惡唑、強力霉素、惡喹酸、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉和氟甲喹,標準品純度均不低于99%,購自德國Dr. Ehrenstorfer 公司;乙腈、甲酸為色譜純,購自美國Fisher 公司;氯化鈉為分析純,購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;水為超純水。吸附劑HLB 購自北京市廣普達科技有限公司,吸附劑C18、PSA、NH2購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司。
分別稱取各標準品適量,磺胺類獸藥用乙腈溶解并定容,四環(huán)素類獸藥用甲醇溶解并定容,金剛烷胺用1% 甲酸乙腈溶解并定容,喹諾酮類獸藥用0.03 mol/L 氫氧化鈉溶液溶解,甲醇定容,配制成質(zhì)量濃度均為100 mg/L 的標準儲備液,于4 ℃條件下保存。分別吸取29 種獸藥標準儲備液0.25 mL 于25 mL 容量瓶,用乙腈稀釋并定容,配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L 的混合標準工作液Ⅰ;吸取金剛烷胺標準儲備液0.1 mL,分別吸取四環(huán)素類獸藥標準儲備液各0.5 mL,分別吸取磺胺類和喹諾酮類獸藥標準儲備液各1 mL,于100 mL 容量瓶,用乙腈稀釋并定容,配制混合標準工作液Ⅱ,其中金剛烷胺質(zhì)量濃度為0.1 mg/L,四環(huán)素類獸藥質(zhì)量濃度為0.5 mg/L,其他獸藥質(zhì)量濃度為1.0 mg/L。于4 ℃條件下保存,可使用一個月。
0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine 緩沖溶液(pH值4.0)的配制:準確稱取12.9 g 檸檬酸(C6H8O7·H2O)、10.9 g 磷酸氫二鈉(Na2HPO3·12H2O)、37.2 g Na2EDTA·2H2O,加超純水900 mL 溶解,用1 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至4.0,加超純水稀釋至1 000 mL。
準確稱取試樣2.00 g(精確至0.01 g)于50 mL聚丙烯塑料離心管中,加入2 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine 緩沖溶液和3 mL 乙腈,于旋渦混合器上渦旋2 min,4 000 r/min 離心5 min,收集上清液于另一個50 mL 離心管中;殘渣中加入5 mL 乙腈,于旋渦混合器上渦旋2 min,4 000 r/min離心5 min;合并上清液于上述50 mL 離心管中。于上清液中依次加入200 μL 乙酸、1 g 氯化鈉,于旋渦混合器上渦旋1 min,4 000 r/min 離心5 min,取乙腈相(上層)2 mL 于10 mL 聚丙烯塑料離心管中,加入C18 和NH2吸附劑各100 mg,渦旋1 min,4 000 r/min 離心5 min,取上清液,氮氣吹干。殘渣中加入1 mL 甲醇-0.1% 甲酸水(10∶90,v/v)定容,過0.22 μm 有機濾膜。
色譜柱:AcquityTMBEH RP18 柱(100 mm ×2.1 mm,1.7 μm);流動相:A 相,0.1% (v/v,下同)甲酸甲醇;B 相:0.1% 甲酸水;梯度洗脫程序:0~3 min,5% A ~20% A;3 ~7 min,20% A ~40%A;7 ~10 min,40% A;10 ~11 min,40% A ~90%A;11 ~12 min,90% A;12.1 min,5% A;12.1 ~14 min,5% A。進樣量:10 μL;柱溫:30 ℃。
電離模式:電噴霧正離子(ESI (+));毛細管電壓:3.0 kV;離子源溫度:110 ℃;脫溶劑氣溫度:380 ℃;脫溶劑氣流量:550 L/h;錐孔反吹氣流量:50 L/h;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式(MRM);質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。
表1 29 種獸藥的保留時間、質(zhì)譜檢測條件、基質(zhì)匹配線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限和定量限Table 1 Retention times,mass spectrometric conditions,matrix-matched linear equations,correlation coefficients (r),LODs and LOQs for the twenty-nine veterinary drugs
2.1.1 質(zhì)譜條件
在電噴霧正離子模式下分別對1 mg/L 的單個標準溶液進行全掃描,得到每種獸藥的分子離子,然后對分子離子進行二級質(zhì)譜全掃描,選擇信號強度較大的兩個碎片離子為特征子離子,并優(yōu)化得到每種獸藥的母離子和子離子所需的最佳錐孔電壓和碰撞能量,最后以多反應(yīng)監(jiān)測模式進行掃描。優(yōu)化得到的質(zhì)譜參數(shù)見表1。
2.1.2 梯度洗脫條件的優(yōu)化
本研究分別以乙腈-0.1% 甲酸水和甲醇-0.1%甲酸水作為流動相,比較二者的分離效果。結(jié)果表明,甲醇-0.1% 甲酸水作為流動相時,29 種獸藥的分離效果更好。
甲醇與0.1% 甲酸甲醇的比較:由于采用梯度洗脫,本研究嘗試在流動相甲醇中也加入0.1% 甲酸,以確認是否有助于化合物的電離。結(jié)果表明,加入甲酸后獸藥的響應(yīng)信號果然更強,重復(fù)性更好。因此,本研究最終采用0.1% 甲酸甲醇-0.1% 甲酸水作為流動相。
梯度洗脫條件的優(yōu)化:經(jīng)過反復(fù)試驗,改變不同時間段流動相中有機相與水相的比例,最終確定了最佳梯度洗脫條件,獲得了29 種獸藥的最佳分離效果,29 種獸藥的總離子流色譜圖見圖1。
圖1 29 種獸藥的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of the 29 veterinary drugs
用UPLC-MS/MS 檢測時,目標物的色譜峰形、分離度及響應(yīng)值受定容溶液的影響較大。
根據(jù)經(jīng)驗,本研究對以下5 種定容溶液進行比較。(1)比較甲醇-水(10∶90,v/v)和甲醇-0.1% 甲酸(10∶90,v/v)的溶解效果。結(jié)果表明:0.1% 甲酸作為水相溶解效果更好,色譜分離度更好,響應(yīng)信號更高,色譜峰對稱,尖銳。(2)乙腈和甲醇的比較:比較乙腈-0.1% 甲酸(10∶90,v/v)和甲醇-0.1% 甲酸(10∶90,v/v/v)的溶解效果。結(jié)果表明,二者無明顯差異,分離效果都很好,所得色譜峰尖銳、對稱。(3)甲醇-0.1% 甲酸不同比例的比較:根據(jù)經(jīng)驗,選取10∶90、20∶80 和50∶50(v/v)3 種比例進行比較。結(jié)果表明,比例為10∶90 時效果最好,比例為50∶50時效果最差。甲醇的比例越高,色譜峰前延現(xiàn)象越明顯,分離度也越差,這種影響在磺胺醋酰和磺胺嘧啶兩種化合物上體現(xiàn)得最明顯。因此,鑒于流動相使用甲醇,本研究最終采用甲醇-0.1% 甲酸水(10∶90,v/v)作為定容溶液。
2.3.1 提取溶劑的選擇
提取溶劑的選擇是本研究的難點。四環(huán)素類獸藥很難與磺胺類、喹諾酮類獸藥同時提取。參照文獻,本研究先后采用乙腈[1,6,8]、5% 醋酸乙腈[4,14-16]、0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine 緩沖液[2,16]、5% 三氯乙酸[5]和0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine 緩沖液-乙腈混合溶液[7]5 種溶液進行提取。結(jié)果表明,乙腈提取時金剛烷胺、喹諾酮類和四環(huán)素獸藥的回收率都較低;5% 醋酸乙腈提取時四環(huán)素類獸藥回收率僅20% ~30%;0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine緩沖液可以很好地提取四環(huán)素類和喹諾酮類獸藥,但磺胺類的回收率僅50% 左右;0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine 緩沖液-乙腈混合溶液提取時,4 類獸藥的回收率都能夠滿足要求;5% 三氯乙酸提取,沉淀蛋白的同時,也能很好地提取4 類獸藥。因此,最終選擇0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine 緩沖液-乙腈或者5% 三氯乙酸作為提取液。
經(jīng)過反復(fù)試驗摸索,本研究最終確定稱樣2.00 g 時,加0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine 緩沖液的體積以2 mL 為宜,提取兩次,第一次用2 mL McIlvaine 緩沖液和3 mL 乙腈提取,第二次用5 mL 乙腈提取。
2.3.2 凈化方法的確定
本研究設(shè)計了兩種試驗方案。方案一:采用0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine 緩 沖 溶 液-乙 腈 提取,鹽析,取2 mL 乙腈相,C18、PSA 或NH2分散固相萃取凈化(吸附雜質(zhì)),上清液氮氣吹干,1 mL 甲醇-0.1% 甲酸(10∶90,v/v)定容。方案二:采用5%三氯乙酸提取,取2 mL 提取液,HLB 分散固相萃取凈化(吸附目標獸藥),用甲醇洗脫,收集洗脫液,氮氣吹干,1 mL 甲醇-0.1% 甲酸(10∶90,v/v)定容。結(jié)果表明:方案一的凈化效果好,4 類獸藥的回收率結(jié)果都能滿足要求。方案二凈化效果雖好,但4 類獸藥的回收率均小于60%。因此,選擇方案一的方法凈化。
吸附劑的選擇及用量:比較了C18、PSA 和NH23 種吸附劑的凈化效果。結(jié)果表明,PSA 吸附磺胺類獸藥,C18 和NH2協(xié)同凈化效果較好。在2 mL提取液中分別加入C18 和NH2各50 mg、100 mg、150 mg 進行比較。結(jié)果顯示,用量150 mg 時,少量獸藥被吸附,用量100 mg 時比50 mg 凈化效果好,且不會吸附獸藥。因此,本研究確定C18 和NH2的用量為100 mg。
鹽析前加乙酸調(diào)pH 值的必要性:加乙酸200 μL,調(diào)pH 值至3.5,目的是為了降低四環(huán)素類獸藥在緩沖液中的溶解性,使其更易分配至乙腈相中,以提高回收率。
為了消除基質(zhì)效應(yīng),本實驗用基質(zhì)匹配標準工作溶液繪制標準曲線。以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標,色譜峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,線性方程和相關(guān)系數(shù)見表1。29 種獸藥在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.993 ~0.999。以信噪比為3 計算方法的檢出限,以信噪比大于等于10 確定方法的定量限,29種獸藥的檢出限在0.3 ~3.0 μg/kg 之間。金剛烷胺的定量限為1.0 μg/kg,四環(huán)素、土霉素、金霉素和強力霉素的定量限均為10.0 μg/kg,其他獸藥的定量限均為5.0 μg/kg。
在29 種獸藥的LOQ 水平、20 μg/kg 和50 μg/kg 3 個水平做加標回收率試驗,每個水平做5個平行樣品。稱取2 g 空白雞肉、雞肝、豬肉和豬肝樣品,添加適量混合標準溶液,渦旋混合1 min,混勻后靜置15 min,按照1.2 節(jié)所述的前處理方法進行提取、凈化后,進行UPLC-MS/MS 測定。為了消除基質(zhì)效應(yīng),用空白樣品基質(zhì)加標作為標準品。根據(jù)添加樣品與標準品中各組分的峰面積計算回收率。29 種獸藥在4 種組織中的平均回收率和相對標準偏差(RSD)均列于表2 中。由表2 可以看出,29 種獸藥在雞肉、雞肝、豬肉和豬肝4 種動物組織中的平均回收率在71.5% 和93.2% 之間,相對標準偏差在0.8% 和7.7% 之間,符合多殘留分析的要求。
表2 雞肉、雞肝、豬肉和豬肝樣品中29 種獸藥的加標回收率及RSD(n =5)Table 2 Average recoveries and the RSDs of the 29 veterinary drugs in chicken muscle,chicken liver,porcine muscle,and porcine liver samples (n =5)
表2 (續(xù))Table 2 (Continued)
表2 (續(xù))Table 2 (Continued)
從天津市各超市和農(nóng)貿(mào)市場購買8 份雞肉、3份雞肝、5 份豬肉和4 份豬肝樣品,采用本研究建立的多殘留方法進行測定。檢測結(jié)果顯示,1 份雞肉樣品檢出磺胺醋酰和磺胺嘧啶,殘留量分別為10.6 μg/kg 和13.5 μg/kg,1 份雞肝樣品檢出恩諾沙星,殘留量為24.7 μg/kg。其他樣品中均無獸藥檢出。
本研究解決了四環(huán)素類藥物難與其他多類獸藥同時提取、凈化的難題,建立了動物源食品中四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類和金剛烷胺4 類共29 種獸藥的QuEChERS-UPLC-MS/MS 快速檢測方法。分別對液相色譜條件、質(zhì)譜條件、提取溶劑、凈化方法、吸附劑的選擇及用量等樣品前處理條件進行了優(yōu)化研究,采用改進的QuEChERS 方法處理樣品,發(fā)揮了其快速、簡便的優(yōu)勢,與國標方法和現(xiàn)有文獻方法相比,該方法大大縮短了檢測周期,節(jié)約了檢測成本。本研究方法操作簡便、快速、凈化效果好,靈敏度、準確度和精密度均符合多殘留檢測技術(shù)的要求,為各食品檢測機構(gòu)提供了簡單快速的篩選方法,有助于食品檢測機構(gòu)應(yīng)對大批量的雞肉、雞肝、豬肉、豬肝樣品中禁限用獸藥的日常監(jiān)控。
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[17] No. 1025 Bulletin of the Ministry of Agriculture-12-2008 (農(nóng)業(yè)部1025 號公告-12-2008)
[18] GB/T 21317-2007