耿 越 ， 孫豐霞， 馬 玉， 鄧立剛， 呂建云， 李 騰， 王聰聰

（1. 山東省動物抗性生物學重點實驗室，山東師范大學生命科學學院，山東 濟南250014；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所，山東 濟南250100）

隨著國民經(jīng)濟水平的不斷發(fā)展，我國已經(jīng)進入老齡化社會階段，而作為老年男性的常見病——良性前列腺肥大（benign prostate hyperplasia，BPH）也已成為影響老齡男性生活質量的一個常見因素，但其發(fā)病機制迄今尚未完全闡明。目前針對BPH治療的化學藥物主要有兩種，一種是α-受體拮抗劑，包括多拉唑嗪、特拉唑嗪和鹽酸坦索羅辛；另一種是5α-還原酶抑制劑，如非那雄胺和度他雄胺［1］。對中國11 個不同城市的33 個醫(yī)療中心的調(diào)查顯示，60 歲以上男性良性前列腺肥大患者比例達47%，最常用的處方藥是非那雄胺，其次是坦索羅辛［2］。代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后發(fā)展起來的一種研究生物系統(tǒng)的組學方法，通過分析生物體液及組織中所有小分子物質以觀察有機體內(nèi)物質代謝狀況，研究生物體系的內(nèi)源性代謝物質種類、數(shù)量及其變化規(guī)律，探索生物整體、系統(tǒng)或器官的內(nèi)源性代謝物質與內(nèi)在或外在因素的相互作用［3］。近年來，關于前列腺癌的代謝組學研究較多［4-6］，而關于良性前列腺肥大疾病的代謝組學研究鮮有報道。本研究利用超高壓液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質譜技術（UPLC-QTOF-MS）檢測正常小鼠、良性前列腺肥大小鼠及非那雄胺干預的模型小鼠血清代謝物的變化，并結合模式識別分析，尋找潛在的生物標志物，有助于了解前列腺肥大的發(fā)生發(fā)展過程。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

丙酸睪酮注射液，上海通用藥業(yè)股份有限公司（L／N:121203）；非那雄胺（艾世列），杭州康恩貝制藥有限公司（L／N:20130201）；乙腈和甲酸，色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司；純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司；Acquity BEH C18 分析柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），Waters XEVO G2-S QTOF 質譜儀，美國Waters 公司；Centrifuge 5804R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；VORTEX QL-90 渦旋混合器，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 動物分組

4 周齡雄性昆明種小鼠（20 ±2）g，自由飲水攝食，適應性喂養(yǎng)一周。隨機分為3 組，分別為空白對照組（control，n ＝8）、丙酸睪酮組（BPH model，n＝7）和非那雄胺組（finasteride，n ＝8）。實驗動物自由飲水。第1 ～4 周丙酸睪酮組和非那雄胺組每日按5 mg／kg 劑量腹腔注射丙酸睪酮，空白對照組每日注射等體積生理鹽水。第4 ～6 周，非那雄胺組每日按0.8 mg／kg 劑量灌胃非那雄胺，其余兩組每日灌胃等體積生理鹽水。

1.3 樣品收集和制備

第6 周末，將小鼠用乙醚麻醉后摘除眼球取血，并于4 000 r／min 離心后取上清液；加入20 倍體積乙腈去除蛋白質，渦旋混勻，于10 000 r／min 下離心10 min；取上清液，0.22 μm 微膜過濾，供UPLCQTOF-MS 測定。解剖分離前列腺組織，立即稱重，計算前列腺指數(shù)（＝前列腺平均重量／平均體重，mg／10 g）。

1.4 色譜和質譜條件

色譜條件:流動相A 為0.1% （v／v）甲酸水溶液，B 為0.1% （v／v）甲酸乙腈溶液，采用梯度方式洗脫樣品。梯度程序:0 ～3 min，5% B ～70% B；3～8 min，90% B；8 ～9 min，100% B；9 ～10 min，5% B ～100% B；10 ～12 min，5% B。柱溫:35 ℃，流速:0.3 mL／min。自動進樣器溫度設定為15 ℃，進樣量:2 μL。

質譜條件:采用正離子模式；毛細管電壓3.0 kV；錐孔電壓40 V；脫溶劑氣溫度350 ℃；離子源溫度120 ℃；錐孔氣流量50 L／h；脫溶劑氣流量600 L／h；采集時間范圍0 ～12 min；掃描范圍m／z 100～1 000；掃描時間0.1 s；掃描間隔0.02 s；使用甲酸鈉對質譜儀器進行調(diào)諧，亮氨酸-腦啡肽實時精確校正質量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Markerlynx 軟件（Waters，USA）進行色譜峰自動識別和峰匹配，每個樣本的總峰面積歸一化至10 000。導出的峰表按照80% 原則去除零值［7］。將數(shù)據(jù)導入軟件SIMCA-P ＋12 （Umetrics，Umea，瑞典）進行偏最小二乘-判別分析（PLSDA）。采用Mann-Whitney U 檢驗分析生物標志物在各組間的差異。

2 結果與討論

2.1 前列腺指數(shù)

圖1 3 組小鼠的前列腺指數(shù)Fig.1 Prostate indexes of three groups of mice

圖1 為3 組小鼠的前列腺指數(shù)，與空白對照組相比較，丙酸睪酮組前列腺指數(shù)顯著增大（P ＜0.01），表明模型建立成功；與模型組相比，非那雄胺組前列腺指數(shù)顯著降低（P ＜0.01），表明非那雄胺治療前列腺肥大效果顯著。

2.2 血清代謝物譜差異分析

采用UPLC-QTOF-MS 進行血清樣品的分離和數(shù)據(jù)采集，圖2a、b 和c 分別為空白組、丙酸睪酮組和非那雄胺組小鼠血清樣品的離子流基峰色譜圖，可以觀察到存在差異。

對數(shù)據(jù)進行了偏最小二乘-判別分析，圖3a 和b 分別為空白組和模型組的得分圖和載荷圖。在得分圖中，空白組和模型組獲得了完全分離，其中95.8% 的樣本符合模型判別（R2Y ＝0.958），模型的預測能力為91.3% （Q2＝0.913），表明模型可靠。圖3c（截距R2＝0.316，Q2＝-0.301）也顯示出模型沒有過擬合。與空白組小鼠相比，丙酸睪酮組小鼠的血清代謝物譜發(fā)生了明顯變化，丙酸睪酮可能影響正常小鼠血清中代謝物，導致小鼠體內(nèi)代謝紊亂。載荷圖中，每個三角表示1 個化合物，離原點距離越遠就表示這個化合物對空白組和模型組小鼠分類的貢獻越大。結合變量權重重要性排序（VIP ＞1）及相關系數(shù)（Pcorr＞0.58）值共找出了對空白組和丙酸睪酮組分離貢獻最大的8 個變量，即潛在的生物標志物。

圖4a 為空白組、丙酸睪酮組和非那雄胺組的得分圖（R2Y ＝0.740，Q2＝0.690），這3 組能夠完全分離，其血清代謝物譜有明顯的區(qū)別，且非那雄胺組向空白對照組接近，說明藥物具有一定的治療效果，但未能使前列腺肥大模型小鼠完全恢復到健康的代謝水平。圖4b（截距R2＝0.031，Q2＝-0.304）顯示出模型沒有過擬合。

2.3 潛在生物標志物的鑒定分析

圖2 （a）空白組、（b）BPH 模型組和（c）非那雄胺組小鼠血清樣品的離子流基峰色譜圖Fig.2 Ion base peak intensity （BPI）chromatograms of serum samples of （a）control group，（b）BPH model group and （c）finasteride group mice

利用UPLC-QTOF-MS 測得準確的相對分子質量，推測其可能的分子式。同位素匹配度越好，質量偏差越小的化合物為正確化合物的可能性越大［8］。再根據(jù)相對分子質量和二級質譜數(shù)據(jù)結合METLIN、NIST、HMDB 等數(shù)據(jù)庫進行檢索，對潛在的生物標志物進行分析，鑒定出1-十六烷?；?SN-甘油基-3-磷酸膽堿（1-棕櫚酰溶血磷脂酰膽堿，LysoPC（16∶0））、1-O-十六烷基-2-O-乙酰基-SN-甘油基-3-磷酸膽堿（血小板活化因子，PAF C-16）和（Z）-13-二十二烯酰胺（芥酸酰胺，erucamide）共3 個生物標志物。圖5 反映了LysoPC（16∶0）、PAF C-16 與erucamide 在各組中的變化趨勢:與空白組相比，丙酸睪酮組小鼠血清中前兩種物質的含量均明顯上升（P ＜0.001），經(jīng)非那雄胺干預均有顯著的下降（P ＜0.001）；而芥酸酰胺在丙酸睪酮組小鼠血清中的含量明顯下降，經(jīng)非那雄胺干預后含量有顯著的升高（P ＜0.01），但是并未恢復到空白對照組的水平，且與空白對照組水平也有顯著的差異（P ＜0.01）。

圖3 空白組和BPH 模型組的（a）得分圖、（b）載荷圖及（c）20 次置換檢驗的交叉驗證結果Fig.3 （a）Score plots and （b）loading plots of control group and BPH model group and （c）the crossvalidation results with 20 times of permutation tests

2.4 BPH 小鼠血清代謝物譜反映的代謝機制

圖4 空白組、BPH 模型組和非那雄胺組的（a）得分圖和（b）20 次置換檢驗的交叉驗證結果Fig.4 （a）Score plots of control group，BPH model group and finasteride group and （b）the cross-validation results with 20 times of permutation tests

圖5 3 個生物標志物在每組中的相對含量Fig.5 Relative contents of the three potential biomarkers in each group

在前列腺肥大模型小鼠血清中PAF C-16 與LysoPC （16∶0）含量顯著升高。兩者均與磷脂合成途徑有關，且兩者在脂質代謝中起信號傳導的作用。首先血小板活化因子（PAF）可以促進腫瘤壞死因子的產(chǎn)生；調(diào)節(jié)白介素、金屬蛋白酶組織抑制因子-1、基質金屬蛋白酶-1 等的分泌加重炎癥反應［9］。其次PAF 還可作用于花生四烯酸（AA），增加前列腺素（PGs）的釋放，PGs 的增加會加重前列腺肥大。Murphy 等［10］曾發(fā)現(xiàn)，利用非甾體類抗炎藥抑制催化AA 轉化為PGs 的重要限速酶環(huán)氧化酶干擾PGs的合成，可以緩解BPH 合并前列腺炎患者的疼痛癥狀。并且PAF 受體與G 蛋白偶聯(lián)后，磷酸酯酶C被激活，它作用于4，5-二磷酸磷脂酰肌醇，使其分解產(chǎn)生第二信使三磷酸肌醇和二?；视?，前者可誘導細胞Ca2＋濃度的升高，后者可激活蛋白激酶C［11］。這與α1 腎上腺素受體介導的膀胱平滑肌收縮信號轉導途徑相同［12］。平滑肌的收縮會導致BPH 患者尿道壓力的閉合性增強，引起尿流梗阻及膀胱刺激癥狀。近年來，對PAF 在動物疾病模型及人的內(nèi)臟中的作用研究較多，均發(fā)現(xiàn)其在疾病個體中水平升高，起到負調(diào)節(jié)的作用［13-15］。

溶血磷脂酰膽堿（LPC）在前列腺癌和乳腺癌研究中均有報道［16-19］。在人體內(nèi)，LPC 會在溶血磷脂酶D 的作用下轉變成溶血磷脂酸（LPA）［20］，LPA 是一種細胞膜脂類衍生物，它可以促進細胞增殖［21］。有研究發(fā)現(xiàn)LPC 可以通過巨噬細胞上的PAF 受體轉移Ca2＋，影響Ca2＋在胞漿中的水平［22］。本實驗觀察到非那雄胺可以降低PAF C-16與LysoPC （16∶0）水平，提示其在體內(nèi)調(diào)節(jié)BPH 過程中涉及磷脂代謝。眾所周知，非那雄胺是一種5α-還原酶抑制劑，主要通過抑制前列腺內(nèi)睪酮向雙氫睪酮的轉化來治療BPH［23］。但藍儒竹等［24］也曾發(fā)現(xiàn)非那雄胺可以通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長和凋亡因子來抑制BPH，說明其在人體內(nèi)調(diào)節(jié)BPH 的方式是多樣的。芥酸酰胺是脂肪酸酰胺，通常以受體介導的方式調(diào)節(jié)各種生理功能。Hamberger 等［25］在對腹瀉的研究中從血漿中也發(fā)現(xiàn)了芥酸酰胺，其有調(diào)節(jié)水分平衡的作用。但芥酸酰胺確切的生物學功能尚未確定，且報道較少，與前列腺肥大疾病的關系仍需進一步探究。

BPH 的發(fā)病機制復雜，除了研究比較成熟的5α-還原酶和α1 腎上腺素受體外，磷酸二酯酶5、糖酵解酶、芳香化酶、生長因子、內(nèi)皮素等也成為藥物抗BPH 的潛在靶點［26-29］。這些發(fā)現(xiàn)有助于設計并篩選出選擇性更高、毒性更小的新型抗BPH 藥物，也是目前探索前列腺肥大治療的一個重要方向。

3 結論

本實驗運用UPLC-QTOF-MS 對前列腺肥大小鼠進行血清代謝組學研究，發(fā)現(xiàn)了3 個潛在的生物標志物，分別為1-棕櫚酰溶血磷脂酰膽堿、1-O-十六烷基-2-O-乙?；?SN-甘油基-3-磷酸膽堿和（Z）-13-二十二烯酰胺。其中涉及的PAF 受體有可能是藥物抗BPH 的潛在靶點之一，有利于為前列腺肥大診斷及醫(yī)學治療開辟新途徑。

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