趙 梅， 魏喜換， 王春娟， 董運(yùn)海， 李劍芳*， 鄔敏辰

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

β-甘露聚糖酶 （EC 3.2.1.78） 是內(nèi)切 β-1，4-甘露聚糖甘露糖苷水解酶的簡稱，能夠隨機(jī)催化甘露聚糖分子主鏈中β-1，4-D-甘露糖苷鍵的水解，是甘露聚糖降解酶系中最重要的組分，屬于半纖維素酶類[1-2]。它廣泛存在于多種生物體內(nèi)，在食品、醫(yī)藥、飼料、紡織、紙漿漂白及能源開發(fā)等眾多領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值[2]?；谝患?jí)結(jié)構(gòu)同源性比對(duì)和疏水簇分析，絕大多數(shù)β-甘露聚糖酶歸屬糖苷水解酶 （GH）第5或26家族[3-4]。 目前，已有許多關(guān)于GH5家族β-甘露聚糖酶的報(bào)道，但其對(duì)極端環(huán)境耐受性差和催化活性低等缺點(diǎn)極大地限制了其在各領(lǐng)域的應(yīng)用[5-6]，因此有關(guān)新型酶基因的開發(fā)和酶的分子改造[7-8]方面的研究逐年增多。隨著GH5家族β-甘露聚糖酶研究的成熟以及GH26家族β-甘露聚糖酶基因序列的公布，研究人員逐漸轉(zhuǎn)向?qū)H26家族β-甘露聚糖酶的研究。研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)糖苷水解酶家族的活性位點(diǎn)作用模式不盡相同[9]，許多報(bào)道也顯示GH26家族β-甘露聚糖酶具有不同于GH5家族的優(yōu)良特性[10-11]，這為GH26家族β-甘露聚糖酶的深入研究提供了有效的參考。

作者所在課題組在前期的研究中從Aspergillus usamii E001發(fā)酵產(chǎn)物中分離到了電泳純的β-甘露聚糖酶，之后克隆出了A.usamii E001 GH5家族β-甘露聚糖酶（AuMan5A）的編碼基因，并在畢赤酵母GS115中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)[8]。結(jié)果顯示，來源于A.usamii E001發(fā)酵產(chǎn)物的β-甘露聚糖酶的催化活性明顯高于重組酶的活性，推測(cè)電泳純的A.usamii的β-甘露聚糖酶可能由兩種或兩種以上表觀相對(duì)分子質(zhì)量相似的酶組成。對(duì)Aspergillus niger CBS 513.88的基因組序列分析[12]發(fā)現(xiàn)，A.niger中存在兩種β-甘露聚糖酶，分別屬于GH5家族和GH26家族，且兩種酶的氨基酸殘基數(shù)相近。另外，在前期的研究中作者發(fā)現(xiàn)，A.usamii和A.niger的GH5家族β-甘露聚糖酶序列具有高度的相似[1-8]。本研究基于NCBI上A.niger CBS 513.88菌株的基因組序列，參照推測(cè)出的黑曲霉GH26家族β-甘露聚糖酶序列，借助RT-PCR技術(shù)從A.usamii E001中克隆出AuMan26A的編碼基因，并在畢赤酵母GS115中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。同時(shí)，對(duì)重組酶reAuMan26A的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，其極好的熱穩(wěn)定性表明該酶具有較大的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

宇佐美曲霉A.usamii E001，大腸桿菌Escherichia coli JM109和DH5α，便于實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)天然N端表達(dá)的質(zhì)粒pPIC9KM，由作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏；克隆質(zhì)粒pUCm-T，購自上海Sangon公司；表達(dá)宿主菌畢赤酵母Pichia pastoris GS115，購自Invitrogen公司。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

各種限制性內(nèi)切酶，rTaq DNA聚合酶，T4DNA連接酶，250 bp DNA Ladder Marker，低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker和RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0，購自大連TaKaRa公司；胰蛋白胨，酵母提取物，Trizol，YNB，SDS，G418，UNIQ-10 柱 式 Trizol 總RNA抽提試劑盒和聚丙烯酰胺，購自上海Sangon公司；標(biāo)準(zhǔn)甘露糖和角豆膠，Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

種子活化培養(yǎng)基（mg/mL）：玉米粉20，豆餅粉 30，KH2PO430，CaCl210，MgSO410； 誘導(dǎo)培養(yǎng)基（mg/mL）：NaNO39，KH2PO40.5，MgSO40.5， 酵母提取物 4，魔芋粉 5；LB，YPD，MD，BMGY 和 BMMY 培養(yǎng)基的配制，參照 Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen公司）操作手冊(cè)。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

基于宇佐美曲霉與黑曲霉基因序列的相似性，參照NCBI上公布的A.niger CBS 513.88菌株基因組中推測(cè)的Man26A的基因序列 （登錄號(hào)：XM_001397260.1），結(jié)合生物信息學(xué)分析手段，設(shè)計(jì)出一對(duì)擴(kuò)增編碼AuMan26A成熟肽cDNA的特異性上下游引物：

上游引物（AuMan26A-F）：5'-CTCGAGAAAAG AGCTTCCAACCAGACTCTGTCC-3'，含 XhoⅠ位點(diǎn)；

下游引物 （AuMan26A-R）：5'-GAATTCTTAAG CCCCCTCCCAGTTCAG-3'，含 EcoRⅠ位點(diǎn)。

1.4 AuMan26A成熟肽編碼基因的克隆

將A.usamii E001接種至種子活化培養(yǎng)基中，于30℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，以體積分?jǐn)?shù)3%的接種量轉(zhuǎn)至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于上述條件下振蕩培養(yǎng)24 h后收集菌體，用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取A.usamii的總RNA。以提取的A.usamii總RNA為模板，Oligo dT-Adaptor為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈。以所合成的鏈為模板，AuMan26A-F和M13 primer M4為引物，按如下條件進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性 30 s，52℃退火 30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10 min。以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，AuMan26A-F和AuMan26A-R為引物，按如下條件進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增AuMan26A成熟肽的編碼基因：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 90 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、割膠回收，與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，藍(lán)白斑篩選陽性轉(zhuǎn)化子，送上海Sangon公司測(cè)序。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pUCm-T-Auman26A經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，將目的基因克隆至能夠?qū)崿F(xiàn)天然N端表達(dá)的質(zhì)粒pPIC9KM，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，篩選重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM-Auman26A并進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.5 Auman26A基因在畢赤酵母中的表達(dá)

測(cè)序正確的pPIC9KM-Auman26A質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ線性化，電轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115感受態(tài)細(xì)胞。電轉(zhuǎn)化及多拷貝轉(zhuǎn)化子篩選方法參見Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen公司）操作手冊(cè)。重組畢赤酵母的鑒定及誘導(dǎo)表達(dá)參見文獻(xiàn) [1]，整合有pPIC9KM質(zhì)粒的GS115/9KM做陰性對(duì)照。將獲得的重組P.pastoris GS115在YPD平板上劃線傳代培養(yǎng)6次，每次挑選3個(gè)單菌落按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后測(cè)定發(fā)酵上清液中的β-甘露聚糖酶活性，研究重組P.pastoris GS115的遺傳穩(wěn)定性。

1.6 重組酶reAuMan26A的分離純化

將搖瓶發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，除去菌體即得粗酶液。取40 mL粗酶液，向其中加入硫酸銨至50%飽和度，4℃過夜放置后離心去除部分雜蛋白質(zhì)和色素。在上清液中繼續(xù)加入硫酸銨至80%飽和度，4℃過夜放置，離心收集沉淀。將所得沉淀溶于40 mL的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液（20 mmol/L、pH 5.5），經(jīng)透析，超濾濃縮（截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 kDa）至3 mL。上樣到預(yù)先用上述緩沖液平衡好的Sephadex G-75凝膠層析柱（Φ 1.6 cm×100 cm），然后同一緩沖液淋洗 （洗脫體積流量0.3 mL/min），收集有酶活力的組分。

1.7 β-甘露聚糖酶活性的測(cè)定

采用改良的DNS法測(cè)定β-甘露聚糖酶活性[1]。取2.4 mL 5 mg/mL角豆膠溶液 （pH 5.5的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制），于40℃預(yù)熱5 min后加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，40℃下準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，加入2.5 mL DNS試劑，沸水浴中顯色7 min，加入5 mL去離子水混勻后測(cè)定OD540。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖（以甘露糖計(jì)）所需的酶量定義為1個(gè)酶活性單位（U）。

1.8 reAuMan26A酶學(xué)性質(zhì)的分析

1.8.1 溫度對(duì)酶活性的影響 在不同溫度 （30～60℃）下，按1.7的方法測(cè)定reAuMan26A的活性。最適溫度Topt定義為最高酶活性 （以相對(duì)活性100%計(jì)）所對(duì)應(yīng)的溫度。將酶液置于不同溫度保溫0～60 min，按1.7中的方法測(cè)定殘余酶活性，未處理酶液（0 min）的酶活性以100%計(jì)。酶的半衰期t1/2定義為殘余酶活性為50%時(shí)的保溫時(shí)間。

1.8.2 pH對(duì)酶活性的影響 用不同pH值（pH 2.5～8.0）的100 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制5 mg/mL角豆膠溶液，按1.7中的方法測(cè)定reAuMan26A的活性。最適pH定義為最高酶活性所對(duì)應(yīng)的pH值。將酶液在不同pH值 （pH 2.5～8.0檸檬酸-Na2HPO4緩沖液）、40℃保溫60 min，按1.7中的方法測(cè)定殘余酶活性。酶的pH穩(wěn)定性定義為殘余酶活性在85%以上的pH范圍。

1.8.3 金屬離子和EDTA對(duì)酶活性的影響 將酶液與不同金屬離子或EDTA溶液（終濃度2.0 mmol/L）混勻后于40℃保溫1 h，按1.7中的方法測(cè)定殘余酶活性。以未加金屬離子和EDTA的酶活性計(jì)為100%。

1.8.4 reAuMan26A的底物譜及動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定用 100 mmol/L、pH 5.5檸檬酸-Na2HPO4緩沖液分別配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的角豆膠、瓜爾豆膠、魔芋粉、樺木木聚糖、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）和可溶性淀粉溶液，按照1.7中的方法測(cè)定reAuMan26A對(duì)不同底物的活性。以不同質(zhì)量濃度（1～10 mg/mL）的角豆膠溶液為底物，按照1.7的方法測(cè)定reAuMan26A的活性，采用Origin 8.0軟件進(jìn)行非線性擬合，計(jì)算出reAuMan26A的Km和Vmax值。

2 結(jié)果與討論

2.1 Auman26A基因的克隆

按1.4的方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)第一輪PCR產(chǎn)物，在1 200 bp處有一條明顯的條帶 （圖1泳道1），將目的產(chǎn)物割膠回收純化。以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物在1 000 bp處有一條特異性的條帶 （圖1泳道2），PCR產(chǎn)物長度與預(yù)期相符，割膠回收產(chǎn)物連接至pUCm-T，獲得重組質(zhì)粒pUCm-T-Auman26A，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌液PCR檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示獲得的基因片段為954 bp，編碼317個(gè)氨基酸，Blast分析表明該基因序列與 A.niger CBS 513.88（XM_00139760.1）、Aspergillus flavus NRRL3357 （XM_002377295.1）和Aspergillus oryzae RIB40（XM_001825696.2）序列同源性分別為 98%、84%和 83%。將 pUCm-TAuman26A和pPIC9KM經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切及回收純化后，相互連接得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM-Auman26A并進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果表明目的基因沒有發(fā)生突變，且讀碼框完全正確。

2.2 Auman26A基因在畢赤酵母中的表達(dá)

提取pPIC9KM-Auman26A質(zhì)粒，經(jīng)SalⅠ線性化后，電轉(zhuǎn)P.pastoris GS115感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)MD平板和含不同濃度G418的YPD平板篩選后獲得高拷貝的GS115/Auman26A。隨機(jī)挑選幾個(gè)高拷貝的GS115/Auman26A重組子用引物5'-AOX和3'-AOX進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示?？梢?，以GS115/Auman26A為模板的PCR反應(yīng)能擴(kuò)增出長度約為2 100 bp和1 500 bp的產(chǎn)物，2 100 bp的產(chǎn)物為P.pastoris GS115本身的AOX1基因，1 500 bp的產(chǎn)物包括約為1 000 bp的目的基因和500 bp pPIC9KM質(zhì)粒上5′-AOX和3′-AOX引物序列之間的片段。結(jié)果表明，Auman26A基因已成功整合入P.pastoris GS115基因組中。

圖1 Auman26A的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplifications for Auman26A

圖2 重組畢赤酵母GS115/Auman26A的PCR檢測(cè)Fig.2 PCR detections of recombinant P.pastoris GS115/Auman26A

挑取幾個(gè)高拷貝的重組子按照Multi-Copy Pichia Expression Kit手冊(cè)中的方法誘導(dǎo)表達(dá)，篩選到一個(gè)產(chǎn)酶活性最高的GS115/Auman26A重組子，其發(fā)酵上清液的酶活為281.9 U/mL，而GS115/9KM的發(fā)酵上清液中未檢測(cè)到β-甘露聚糖酶的活性。SDS-PAGE的結(jié)果顯示，reAuMan26A的表觀相對(duì)分子質(zhì)量約為48.3 kDa（圖 3）；而 GS115/9KM的發(fā)酵上清液在48.3 kDa處無特異性條帶，與酶活性測(cè)定結(jié)果一致。遺傳穩(wěn)定性研究試驗(yàn)表明，P.pastoris GS115/Auman26A具有良好的遺傳穩(wěn)定性，經(jīng)6次傳代后表達(dá)水平無明顯改變。

將A.usamii菌株誘導(dǎo)表達(dá)上清液分別經(jīng)（NH4）2SO4鹽析、透析、超濾和 Sephadex G-75 凝膠進(jìn)行分離純化。SDS-PAGE電泳分析顯示，純化后的酶呈現(xiàn)單一條帶（圖3），測(cè)得比酶活為2281.7U/mg。

圖3 重組畢赤酵母表達(dá)上清液的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expressed supernatant of the recombinant P.Pastoris

2.3 reAuMan26A的酶學(xué)性質(zhì)

按照1.7中的方法測(cè)定reAuMan26A的最適反應(yīng)溫度Topt，結(jié)果如圖4（a）所示。由圖可見，reAuMan26A在35～45℃范圍內(nèi)有較高的催化活性，其 Topt為 40℃。由圖 4（b）可知，reAuMan26A 具有很好的熱穩(wěn)定性，80℃保溫60 min可保留60%的酶活性；在90℃的半衰期t1/290為10 min，保溫60 min仍可保留33%的酶活性?？梢?，該重組酶在高溫下可長時(shí)間保存，恢復(fù)到40℃時(shí)仍可保留較高活性。不同來源的β-甘露聚糖酶在溫度特性方面有著顯著的差異，如源自海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）β-甘露聚糖酶的最適溫度為95℃，85℃處理后酶活力保留50%以上[13]；Songsiriritthigul等人[11]所研究的地衣芽胞桿菌 （Bacillus licheniformis）GH26 β-甘露聚糖酶重組酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，50℃半衰期為80 h。而本研究中的reAuMan26A在溫度特性上表現(xiàn)出不同于其它酶的特點(diǎn)，其最適反應(yīng)溫度為40℃，低于已報(bào)道過的β-甘露聚糖酶的值，而熱穩(wěn)定性卻明顯高于其它酶[1-7]。據(jù)報(bào)道，酶在一定溫度范圍內(nèi)升溫時(shí)的失活是可逆的，溫度降低后酶活性就恢復(fù)正常。大多數(shù)酶在40℃以上催化活力趨于下降，60～70℃呈現(xiàn)可逆失活，70～80℃出現(xiàn)不可逆變性[14]。由圖4可知，reAuMan26A在50℃時(shí)就開始出現(xiàn)可逆變性，90℃熱處理1 h冷卻后仍保留較高酶活性，可推測(cè)該酶經(jīng)過90℃熱處理恢復(fù)到40℃時(shí)發(fā)生了復(fù)性。從側(cè)面說明，reAuMan26A的酶分子結(jié)構(gòu)不同于之前報(bào)道過的其它酶，這為進(jìn)一步探討reAuMan26A的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)提供了線索。

圖4 reAuMan26A的最適溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.4 Optimal temperature （a） and thermostability （b）of reAuMan26A

reAuMan26A的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性的研究結(jié)果如圖5所示?？芍?，reAuMan26A在pH 3.5～5.5的范圍內(nèi)催化活性較高，其中最適pH為5.5；當(dāng)pH低于3.5和高于5.5時(shí)，reAuMan26A的催化活性迅速下降。如圖所見，reAuMan26A在pH 5.0～7.0的范圍內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性；當(dāng)pH低于4.0時(shí)，酶活性喪失較快。細(xì)菌來源的甘露聚糖酶最適反應(yīng)pH 多為 5.5～7.0，真菌來源的多為 3.0～5.5[2]，該酶的最適pH與已有文獻(xiàn)報(bào)道一致。

圖5 reAuMan26A的最適pH及pH穩(wěn)定性Fig.5 Optimal pH and stability of reAuMan26A

金屬離子和EDTA對(duì)reAuMan26A酶活性的影響如圖6所示。可見，不同的金屬離子和EDTA對(duì)酶活性影響不明顯，只有EDTA對(duì)reAuMan26A酶活性有輕微激活作用；而其他金屬離子對(duì)reAuMan26A酶活性有一定的抑制作用，其中Fe2+和Fe3+的抑制作用比較明顯。

圖6 金屬離子和EDTA對(duì)reAuMan26A酶活性的影響Fig.6 Effects of metal ions and EDTA on the activity of reAuMan26A

reAuMan26A底物譜分析的結(jié)果顯示，reAuMan26A對(duì)角豆膠的催化活性最高，將其對(duì)角豆膠的催化活性定為100%；而對(duì)魔芋粉和瓜爾豆膠的催化活性較低，相對(duì)酶活性分別為56.4%和28.5%。另外，reAuMan26A對(duì)可溶性淀粉、樺木木聚糖和羧甲基纖維素鈉沒有催化活性。由以上數(shù)據(jù)可知，該酶僅識(shí)別并催化水解含有甘露糖結(jié)構(gòu)的多聚糖，更加表明其傾向于專一性水解主鏈中的β-1，4-糖苷鍵，側(cè)鏈較多的瓜爾豆膠不易被催化水解。reAuMan26A對(duì)于角豆膠的Km和Vmax值分別為15.25 mg/mL和 7 841.9 U/mg。

3 結(jié)語

近年來，關(guān)于β-甘露聚糖酶的研究報(bào)道逐年增多。相對(duì)于GH5家族β-甘露聚糖酶，有關(guān)GH26家族β-甘露聚糖酶的研究較少。在少數(shù)的關(guān)于GH26家族β-甘露聚糖酶研究的報(bào)道中，均顯示出其優(yōu)良的酶學(xué)特性[10-11]。作者在前期研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)A.usamii與A.niger基因序列的相似性，通過生物信息學(xué)和基因組學(xué)分析，成功實(shí)現(xiàn)了AuMan26A編碼基因的克隆表達(dá)。傳統(tǒng)的通過基因或cDNA文庫開發(fā)新基因的方法工作量較大，而且不易操作[15]。隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，挖掘新基因的手段也越來越多[16]。自然界微生物中具有豐富的酶資源，利用生物信息學(xué)和基因組學(xué)相結(jié)合的方法從微生物中挖掘具有優(yōu)良性狀的新型酶是一條獲取優(yōu)良酶的有效途徑。

本研究中采用RT-PCR技術(shù)成功克隆了AuMan26A的編碼基因并在畢赤酵母GS115中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，重組β-甘露聚糖酶 （reAuMan26A）的發(fā)酵上清液對(duì)角豆膠的酶活性為281.9 U/mL，表達(dá)水平明顯高于GH5家族的A.usamii和A.niger LW-1 β-甘露聚糖酶 AnMan5A[1]和 AuMan5A[17]。 初步的酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶的最適反應(yīng)溫度Topt為40℃；在80℃處理60 min后殘留酶活性為60%；90℃時(shí)的半衰期t1/290為10 min，處理60 min后殘留酶活性為33%；其最適pH為5.5，在pH 5.0～7.0的范圍內(nèi)較穩(wěn)定；Fe2+和Fe3+對(duì)其有明顯的抑制作用，其它所測(cè)金屬離子和EDTA對(duì)其沒有明顯的影響；所測(cè)酶的最適底物為角豆膠，其對(duì)角豆膠的Km和Vmax值分別為15.25 mg/mL和 7 841.9 U/mg。本研究成果為GH26家族β-甘露聚糖酶的深入研究奠定了理論基礎(chǔ)，也為其它新酶基因的開發(fā)和進(jìn)一步應(yīng)用提供了新的思路和策略。

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