黃 丹， 梁 源， 左 勇， 毛 祥， 劉有晴， 葉光斌

（四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000）

醬油在中國(guó)烹飪中占有重要的地位，在呈香、呈味、呈色等方面具有其它調(diào)味品不可替代的功能。醬油釀造是以源自大豆和小麥的植物蛋白質(zhì)及碳水化合物為主要原料，生產(chǎn)涉及到多種有益微生物的聯(lián)合協(xié)同作用。其中最重要的是乳酸菌和酵母菌，它們的主要作用是發(fā)酵糖類產(chǎn)生小分子醇、醛、酸、酯、酚類等風(fēng)味物質(zhì)，這是醬油風(fēng)味產(chǎn)生的主要途徑[1]。其中乳酸菌是醬油發(fā)酵體系中的主要細(xì)菌，在發(fā)酵期間，耐鹽性乳酸菌代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等種類豐富的有機(jī)酸，從而使整個(gè)發(fā)酵體系的pH值開(kāi)始下降；當(dāng)發(fā)酵體系的pH值下降到適宜酵母菌生長(zhǎng)繁殖的時(shí)候，耐鹽酵母便開(kāi)始大量生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生以醇類為主的各種小分子物質(zhì)，賦予醬油特有的醇味，同時(shí)大量的醇類和部分有機(jī)酸發(fā)生酯化反應(yīng)后產(chǎn)生酯類等風(fēng)味物質(zhì)，賦予醬油特有的醬香、豉香和酯香[2]。同時(shí)，乳酸菌可將精氨酸分解成鳥(niǎo)氨酸，并產(chǎn)生對(duì)絲氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸等進(jìn)行特異性脫羰基的作用，從而左右著醬油的香氣[3]?？梢?jiàn)，乳酸菌的代謝活動(dòng)對(duì)醬油香氣和風(fēng)味形成起著重要作用。目前，對(duì)乳酸菌用于醬油后發(fā)酵以促進(jìn)醬油香氣和風(fēng)味形成的研究很活躍，崔瑞迎等將耐鹽乳酸菌用于高鹽稀態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)醬醪中2-甲基丁酸、2-甲基丁醇、乙酸異戊酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別較對(duì)照組高53.4%、337.3%、388.2%[4]。嚴(yán)留俊對(duì)乳酸菌增加醬油風(fēng)味進(jìn)行了探討性研究，確定了多菌種混合順序變溫發(fā)酵法進(jìn)行醬油發(fā)酵的可行性[1]。劉卓研究了添加耐鹽乳酸菌與醬醪中的酵母的協(xié)同作用，以及耐鹽乳酸菌對(duì)發(fā)酵工藝的控制和對(duì)醬油主要風(fēng)味的影響，研究結(jié)果表明，在醬醪發(fā)酵過(guò)程中，耐鹽乳酸菌的添加明顯促進(jìn)T酵母的生長(zhǎng)，而與S酵母存在著相互促進(jìn)的關(guān)系[5]。可見(jiàn)，對(duì)醬油生產(chǎn)中的耐鹽乳酸菌進(jìn)行分離篩選，研究其菌株特性，對(duì)于開(kāi)發(fā)醬油生產(chǎn)中的功能微生物、提高醬油品質(zhì)具有重要意義。

作者對(duì)醬油醬醅中的耐鹽乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定，并根據(jù)醬油后發(fā)酵環(huán)境條件對(duì)其菌株特性進(jìn)行了研究，其結(jié)果對(duì)耐鹽乳酸菌應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

醬醅，由百年老字號(hào)釀造企業(yè)提供；MRS培養(yǎng)基，參照文獻(xiàn)[6]中的方法制備。

主要設(shè)備：超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠制造；H752型紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司制造；PHS-3C精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠制造；1100型PLC，美國(guó)安捷倫公司制造；HITACHI CR22G高速離心機(jī)，日本HITACHI公司制造。

1.2 方法

1.2.1 NaCl梯度平板的制備 配制MRS培養(yǎng)基分兩份裝，在一份MRS培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度20 g/dL的NaCl標(biāo)記為A培養(yǎng)基，另一份標(biāo)記為B培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻至50℃時(shí)，先倒A培養(yǎng)基于平皿內(nèi)，斜置冷卻，等凝固后再倒入B培養(yǎng)基，平面放置冷卻。

1.2.2 耐鹽乳酸菌的富集、分離及初篩 200 mL MRS液體培養(yǎng)基中添加10 g/dL NaCl，加入醬醅25 g，38℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。取富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，再吸取0.2 mL稀釋液涂布于NaCl梯度平板，38℃培養(yǎng)48 h。挑取處于高質(zhì)量濃度NaCl區(qū)域的菌落于含碳酸鈣的MRS固體平板上劃線純化。

1.2.3 分離菌株的形態(tài)學(xué)特征 對(duì)分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色及個(gè)體形態(tài)觀察，參見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。

1.2.4 分離菌株的16S rDNA寡核苷酸序列分析

1）菌體16S rDNA的提?。喝?.0 mL的培養(yǎng)菌液12 000 r/min離心1 min；沉淀物加入500 μL的TE緩沖液重懸，加入30 μL體積分?jǐn)?shù)10%的SDS 65℃溫浴1 h，再置于-80℃超低溫冰箱放置15 min，將離心管轉(zhuǎn)移到65℃水浴鍋放置15 min，如此重復(fù)3次，以促進(jìn)細(xì)胞破裂。再于4℃6 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液到2 mL的離心管中，加等體積酚-氯仿-異戊醇（體積比 25∶24∶1），劇烈振蕩5 min，靜止 10 min后，13 000 r/min離心 20 min。后將上層水相移入新的離心管中，加入0.6倍體積異丙醇，室溫沉淀 1 h，13 000 r/min，離心 20 min，棄上清液，可見(jiàn)黑褐色沉淀。去除殘余的異丙醇液體，加入1 000 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，并轉(zhuǎn)移至2 mL的離心管內(nèi)，靜置10 min，4℃，13 000 r/min離心15 min，棄上清液，去除殘余的乙醇液體，置于超凈臺(tái)吹風(fēng)10 min，除盡乙醇，再入100 μL無(wú)菌水，置65℃水浴鍋水浴1 h，促進(jìn)DNA的溶解。

2）16S rDNA的PCR擴(kuò)增及測(cè)序：取68 μL無(wú)菌 水 、 10 μL PCR buffer、 8 μL dNTPs、 6 μL MgCl2、2 μL 1492r 引物、 2 μL 8F 引物、 2 μL Taq酶、2 μL模板于EP管中，選定ygb1擴(kuò)增條件（94℃預(yù)變性 4 min，30個(gè)循環(huán)包括 94℃變性 1 min，55℃退火1 min，最后72℃延伸1 min，4℃保溫）擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物純化后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

3）16SrDNA序列測(cè)定及同源性比較：將測(cè)序結(jié)果輸入NCBI中與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的序列進(jìn)行比較分析。

1.2.5 分離菌株的產(chǎn)酸特性 將分離菌株在MRS培養(yǎng)基上于38℃培養(yǎng)24 h，并用無(wú)菌水稀釋至菌懸液在600 nm吸光度為1，按體積分?jǐn)?shù)10%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，固定10 g/dL NaCl于不同溫度培養(yǎng)，固定溫度添加不同質(zhì)量濃度NaCl，和固定前二者調(diào)不同pH的方法來(lái)進(jìn)行分離菌株產(chǎn)酸特性研究。產(chǎn)酸性能用產(chǎn)乳酸量表示。1.2.6 乳酸含量的測(cè)定

1）樣品的處理：取20 mL發(fā)酵液于10 000 r/min、4℃下離心10 min，去除菌體后得上清液用于分析。

2）HPLC法分析：取含有乳酸的發(fā)酵上清液稀釋50倍，取稀釋液5 mL，經(jīng)過(guò)0.45 μm孔徑的微濾膜過(guò)濾，得到的濾液用于HPLC分析。色譜條件：1100型PLC，色譜柱為DiamonsilTMC18；流動(dòng)相組成為0.1 mol/L的KH2PO4（5%體積分?jǐn)?shù)甲醇）；進(jìn)樣量10 μL；體積流量0.5 mL/min；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器（210 nm）；柱溫為室溫。

3）乳酸的定量：將測(cè)試樣色譜圖和相同條件下的標(biāo)準(zhǔn)樣色譜圖作對(duì)比，觀察相同保留時(shí)間下乳酸特征吸收峰。根據(jù)樣品色譜圖中特征峰與標(biāo)準(zhǔn)樣吸收峰的峰面積比，求出樣品中的乳酸含量。

1.2.7 pH的測(cè)定 以無(wú)菌操作吸取少量（約5 mL）已搖勻的菌液于小燒杯中，再經(jīng)校準(zhǔn)過(guò)的精密pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 目的菌株的分離篩選

通過(guò)富集培養(yǎng)及NaCl梯度平板涂布分離，將處于高質(zhì)量濃度NaCl區(qū)域的菌落于含碳酸鈣的MRS固體平板上劃線純化，根據(jù)溶鈣圈獲得產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株。

2.2 分離菌株的形態(tài)學(xué)特征

分離菌株菌落呈乳白色、凸起、邊緣整齊、較濕潤(rùn)。革蘭氏染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，桿菌。

2.3 分離菌株16S rDNA的同源序列分析

純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，其16SrDNA序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明其與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus bulgaricus）的16SrDNA序列具有99%相似性。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，可以判斷為同種。菌株的16S rRNA序列有1 313 bp。序列分析結(jié)果：

2.4 分離菌株的產(chǎn)酸特性

2.4.1 不同發(fā)酵溫度對(duì)分離菌株產(chǎn)酸能力的影響將分離菌株菌懸液接入同一批含10 g/dL NaCl的MRS 液體培養(yǎng)基中， 分別置于 28、33、38、45、48 ℃條件下，靜置培養(yǎng)3 d。將培養(yǎng)液采用HPLC來(lái)檢測(cè)分離菌株在不同發(fā)酵溫度下的乳酸產(chǎn)量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)分離菌株產(chǎn)酸能力的影響Fig.1 Effects of temperature on the lactic acid titer by the isolated strain

溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸有明顯的影響，隨著溫度的升高，乳酸產(chǎn)量隨之增加，38℃時(shí)達(dá)到最高，發(fā)酵液乳酸質(zhì)量濃度超過(guò)3 g/dL，溫度升高超過(guò)45℃時(shí)，乳酸量開(kāi)始明顯下降。因此，乳酸菌的適宜培養(yǎng)溫度應(yīng)為38℃?？梢?jiàn)該菌種能耐一定的高溫，在合適的溫度下產(chǎn)酸較快，可較好地應(yīng)用于醬油的高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝和某些低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝。

2.4.2 不同NaCl質(zhì)量濃度對(duì)分離菌株產(chǎn)酸能力的影響 在同一批MRS液體培養(yǎng)基中分別添加NaCl，使其質(zhì)量濃度為 0、4、8、12、16、18 g/dL，接入分離菌株菌懸液，38℃培養(yǎng)3 d，采用HPLC測(cè)定發(fā)酵液乳酸質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)圖2?？芍S著環(huán)境中NaCl質(zhì)量濃度增加，分離菌株產(chǎn)酸能力受到抑制，但在不同NaCl質(zhì)量濃度下，篩選菌株代謝產(chǎn)生乳酸的能力相差不明顯，發(fā)酵液中乳酸質(zhì)量濃度均可達(dá)到2 g/dL以上。在不同質(zhì)量濃度NaCl環(huán)境中能否生長(zhǎng)是鑒別乳酸菌是否適合醬油發(fā)酵的重要指征，此菌株能夠在高鹽環(huán)境中正常產(chǎn)酸的性質(zhì)，說(shuō)明該菌適合應(yīng)用于所有醬油的發(fā)酵工藝，是一株比較優(yōu)良的醬油風(fēng)味發(fā)酵乳酸菌。

圖2 NaCl質(zhì)量濃度對(duì)分離菌株產(chǎn)酸能力的影響Fig.2 Effects of NaCl concentration on the lactic acid titer by the isolated strain

2.4.3 不同環(huán)境pH值對(duì)分離菌株產(chǎn)酸能力的影響在同一批含10 g/dL NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，添加 HCl或 NaOH 使其 pH 調(diào)至 5.2、5.8、6.4、7.0、7.6、8.2，38℃培養(yǎng)3 d，結(jié)果見(jiàn)圖3?？芍蚿H值環(huán)境不利于分離菌株乳酸的生產(chǎn)，在中性及偏堿性條件下都能較好地合成乳酸。

圖3 pH值對(duì)分離菌株產(chǎn)酸能力的影響Fig.3 Effects of pH value on the lactic acid titer by the isolated strain

而在醬油發(fā)酵過(guò)程中，醬油發(fā)酵的醬醪或醬醅初始pH接近中性，很符合該乳酸菌菌株的生長(zhǎng)特性。且該菌株在低pH條件下乳酸代謝受到抑制，防止了在醬油發(fā)酵過(guò)程中過(guò)度地消耗還原糖等原材料造成醬油的過(guò)度酸化。該pH又接近醬油發(fā)酵中產(chǎn)風(fēng)味酵母菌的最適生長(zhǎng)pH，有利于下一步耐鹽酵母產(chǎn)醇產(chǎn)酯發(fā)酵的進(jìn)行，比較適合醬油的發(fā)酵生產(chǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)富集培養(yǎng)和NaCl梯度平板法，從醬油醬醅中分離篩選出一株耐鹽乳酸菌，經(jīng)16s rRNA同源序列分析并結(jié)合其形態(tài)學(xué)、生理生化特征，鑒定為德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus bulgaricus），對(duì)其進(jìn)行合成乳酸特性研究，表明該菌株在NaCl 10 g/dL條件下，38℃產(chǎn)乳酸量可達(dá)33.68 g/L，且該菌株可耐受NaCl 18 g/dL的環(huán)境條件，在此條件下，產(chǎn)乳酸量仍可達(dá)22.68 g/L。同時(shí)，在中性及偏堿性條件下都能較好地合成乳酸?？梢?jiàn)，該菌株對(duì)環(huán)境溫度、NaCl質(zhì)量濃度以及pH值的耐受性均良好，表明其可較好地應(yīng)用于醬油生產(chǎn)，對(duì)進(jìn)一步提高醬油品質(zhì)有重要的應(yīng)用前景。不過(guò)，對(duì)于該乳酸菌菌株對(duì)醬油生產(chǎn)中原料蛋白質(zhì)的利用率、發(fā)酵過(guò)程中各酶系的作用，以及和產(chǎn)香酵母菌之間的相互影響等，還有待進(jìn)一步研究探討。

在醬油釀造過(guò)程中添加耐鹽乳酸菌有利于醬油風(fēng)味物質(zhì)的形成，提高產(chǎn)品品質(zhì)，這已經(jīng)成為行業(yè)共識(shí)。目前，應(yīng)用于醬油生產(chǎn)的耐鹽乳酸菌主要是嗜鹽四聯(lián)球菌，而對(duì)于植物乳桿菌的研究報(bào)道還較少，所以對(duì)耐鹽植物乳桿菌進(jìn)行深入研究具有重要意義。

[1]嚴(yán)留俊.改善醬油風(fēng)味的微生物及工藝研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2008.

[2]陳伯林.耐鹽乳酸菌在醬油發(fā)酵中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代食品科技，2011，27（11）：1340-1343.CHEN Bolin.Application of lactic acid bacteria with high salt tolerance in the soy sauce fermentation[J].Modern Food Science and Technology，2011，27（11）：1340-1343.（in Chiness）

[3]Ashenafi M，Busse M.Growth of Bacillus cereus in fermenting tempth made from various beans and its inhibition by Lacobacillus plantarum[J].J Appl Bacteriol，1991，70（4）：329-333.

[4]崔瑞迎，鄭佳，梁如，等.耐鹽乳酸菌和酵母菌對(duì)高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響[J].食品工業(yè)科技，2013，34（6）：197-201.CUI Ruiying，ZHEN Jia，LIANG Ru，et al.Effect of halophilic LAB and yeasts on the quality of high-salt dilute-state soy sauce[J].Science and Technology of Food Industry，2013，34（6）：197-201.（in Chiness）

[5]劉卓.耐鹽乳酸菌對(duì)醬油風(fēng)味的影響[D].天津：天津科技大學(xué)，2009.

[6]黃秀梨，辛明秀.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，施普林格出版社，1999.