江 南 ， 譚曉風(fēng) ， 張 琳

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室 經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室，湖南長沙 410004；2.湖南工業(yè)大學(xué) 包裝與材料工程學(xué)院，湖南 株洲 412008）

磷脂酰肌醇（phosphatidyldinositol，PI）信號系統(tǒng)廣泛存在于生物體中，是與生物體內(nèi)Ca2+子信號途徑密切相關(guān)的一個信號網(wǎng)絡(luò)，既能夠影響基因表達(dá)，又參與細(xì)胞對外界環(huán)境變化的響應(yīng)[1]。所有生物都需要對它們賴以生存的外界環(huán)境中各種環(huán)境因子做出響應(yīng)而適應(yīng)環(huán)境得以生存，當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生改變時，胞外信號需要通過第二信使系統(tǒng)將信號傳遞到胞內(nèi)，從而引起細(xì)胞的相應(yīng)生理生化反應(yīng)，達(dá)到調(diào)節(jié)生物體的生理功能適應(yīng)環(huán)境生存的目的[2]。磷脂酰肌醇及其各種衍生物具有相應(yīng)的信號傳遞功能[1]。目前磷脂酰肌醇及其相關(guān)衍生物在動物及人體中的機能已有較為深入詳細(xì)的研究，對動物磷脂酰信號傳遞途徑（PI途徑）已經(jīng)建立了一個較為完整的模型。研究表明，動物細(xì)胞中的PI途徑對細(xì)胞間信號運輸、轉(zhuǎn)錄調(diào)控細(xì)胞功能、離子通道開閉和能量代謝都具有重要的作用[3-4]。植物中PI途徑的研究近年來也取得了一些進展，有研究表明，植物PI途徑與許多植物生理反應(yīng)關(guān)聯(lián)，例如滲透壓調(diào)節(jié)和植物防御反應(yīng)[5-6]，Perera和Fallon等重力刺激玉米實驗[7-8]和紅光處理小麥黃化苗原生質(zhì)體實驗[9]，證明了植物中三磷酸肌醇（IP3）信號被關(guān)聯(lián)到植物體中多個發(fā)育和生理途徑中。植物PI途徑中相關(guān)的基因PIS（磷脂酰肌醇合成酶基因）、PI4K（磷脂酰肌醇-4-激酶基因）、PIPK （二磷脂酰肌醇激酶基因）、PLC（磷脂酶 C 基因）、PLD（磷脂酶 D 基因）和5PTase（多磷酸肌醇-5-磷酸酶基因）等已經(jīng)被分離出來并進行了功能的研究[6，10-11]。

油茶（Camellia oleifera）是世界四大木本油料樹種之一，適應(yīng)性廣，耐干旱、耐霜凍、耐貧瘠土壤。其成熟種子所含油脂——茶油是一種優(yōu)質(zhì)保健的食用油，其色純味香，富含油酸和亞油酸，不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)85%～90%。茶油的營養(yǎng)價值、保健價值可與目前風(fēng)糜歐美的橄欖油相媲美，是名副其實的綠色食用植物油。油茶遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，基因組龐大，近年來我國科研工作者對油茶分子研究主要集中在油脂合成過程基因調(diào)控方面，而油茶對環(huán)境因素響應(yīng)的分子機理研究甚少，油茶PI途徑的研究的未見報道。作者所在實驗室對油茶信號傳導(dǎo)和逆境脅迫應(yīng)答進行了初步研究，主要以實驗室構(gòu)建的油茶cDNA文庫和EST文庫為材料，從油茶近成熟種子中分離克隆了油茶鈣調(diào)素基因 （Calm）、油茶親環(huán)素基因 （Cyc）、油茶酪氨酸蛋白磷酸酶基因（PTPase）、油茶熱激蛋白質(zhì)基因（HSP）和油茶水通道蛋白質(zhì)基因（Aquaporin）等相關(guān)的基因[12-13]。同時在油茶種子的轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)，油茶種子油脂合成過程存在PI信號系統(tǒng)。作者在油茶種子轉(zhuǎn)錄組和不同時期表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，對油茶種子PI信號系統(tǒng)關(guān)鍵基因的表達(dá)進行系統(tǒng)分析，以期為相關(guān)基因的分離克隆、油茶品種的遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

國家審定油茶品種‘華碩’的膨大期果實和同年油脂合成高峰期果實，采自中南林業(yè)科技大學(xué)油茶種質(zhì)資源圃；果實采摘后需立即剝?nèi)》N仁，錫箔紙包好放入液氮保存，回實驗室后種仁置于-80℃超低溫冰箱中保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 油茶種仁總RNA提取及質(zhì)量檢測 在液氮中研磨‘華碩’果實膨大期和油脂合成高峰期種仁至均勻粉末，用Invitrogen公司總RNA提取試劑盒分別提取不同時期種仁總RNA。電泳檢測RNA的完整性，核酸/蛋白質(zhì)定量分光光度計測定RNA濃度；取完整性好（28S∶18S 大致為 2∶1）、OD260/280值在1.9至2.2之間，樣品質(zhì)量濃度≥200 ng/μL的RNA樣品，-80℃保存?zhèn)溆脺y序。

1.2.2 油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫構(gòu)建 分別取以上兩個時期RNA等比例混合至總量為1 mg左右的混合樣品，干冰保存送至華大基因公司采用Illumina技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序，組裝軟件SOAP denovo處理后獲得非冗余Unigene序列，構(gòu)建了油茶種子油脂合成調(diào)控過程中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。以Nr、SwissProt、KEGG和 COG等數(shù)據(jù)庫為參考，完成油茶種子轉(zhuǎn)錄組Unigene序列基因注釋，取evalue＜0.000 01的 Unigene視為已知基因[14]。

1.2.3 油茶種子表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫構(gòu)建 將上述兩個不同時期的RNA樣品各1mg左右分別用干冰保存，送至深圳華大基因公司采用Solexa技術(shù)進行數(shù)字化表達(dá)譜測序。構(gòu)建油茶種子不同時期的表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，并以已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為參考，對整理和去雜后的表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫Unigene序列進行基因注釋。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 從華大基因公司下載油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和表達(dá)譜測序數(shù)據(jù)，按轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中Pathway顯著富集對數(shù)據(jù)庫中的Unigenes按基因功能進行分類，綜合分析油茶種子油脂形成過程中各代謝通路關(guān)鍵酶基因的調(diào)控位點、不同時期的表達(dá)差異，并推測其在油茶種子發(fā)育過程中的功能及與油茶油脂合成的關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 油茶種子油脂合成過程中轉(zhuǎn)錄組和不同時期表達(dá)譜的基本信息

油茶果實膨大期和油脂合成高峰期RNA混合樣品進行Illumina雙末端測序（PE）及數(shù)據(jù)處理后最終獲得了69 798個非冗余Unigene片段。將油茶種子轉(zhuǎn)錄組非冗余Unigene序列比對到Swissport、Kegg、COG、Gene Ontology（GO）等數(shù)據(jù)庫，共有18 714條Unigene獲得基因注釋，歸并為124個代謝途徑，其中涉及PI號系統(tǒng)的Unigenes序列共212條，占全部注釋基因的1.13%。采用Solexa單端測序（SE），分別獲得油茶果實膨大期和油脂合成高峰期表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，對數(shù)據(jù)庫進行整理和去雜后，得到高質(zhì)量測序標(biāo)簽（Clean Tags）；大部分?jǐn)?shù)據(jù)能夠通過前期構(gòu)建的油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫得到注釋。為了方便分析兩個時期基因表達(dá)差異，表達(dá)譜中Unigene的表達(dá)量取標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)量TPM（Transcript Per Million clean tags）值，可直接用于比較不同樣品間的相應(yīng)基因表達(dá)差異[15]，取FDR（false discovery rate）≤0.001來最終決定差異檢驗的P值的閾值。本研究中，以FDR≤0.001且存在2倍以上表達(dá)差異作為判斷基因表達(dá)差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 油茶種子油脂合成過程中磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)及其相關(guān)基因

油茶種子果實膨大期和油脂合成高峰期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)幾乎包含了與油茶油脂合成相關(guān)的所有基因的mRNA信息。轉(zhuǎn)錄組中Unigenes序列的基因注釋信息確定了油茶種子發(fā)育過程中相關(guān)基因參與的生理過程、調(diào)控位點及表達(dá)狀況。從油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析可知，PI信號系統(tǒng)Unigene序列共212條，綜合分析各Unigene序列的NR、Swissport、Pathway、COG和Gene Ontology（GO）基因注釋信息，并對Unigene序列按功能進行分類，可以確定212條Unigene序列編碼調(diào)控油茶種子磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)的關(guān)鍵酶有12種，分屬于12種基因，分別為：磷脂酰肌醇4-激酶（PI4K）；磷脂酰肌醇3-激酶 （PI3K）； 磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸-3-磷酸酶（PTEN）；磷脂酰肌醇合成酶（PIS）；磷脂酰肌醇（3）4-磷酸-5-激酶（PIP5K）；磷脂酶 C（PLC）、肌醇-三磷酸-激酶（ITPK）；肌醇單磷酸酶（IMP）；3'（2'），5'-二磷酸-核苷酶；二酰基甘油激酶（DGK）；磷脂酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶；鈣調(diào)蛋白質(zhì)（Calm）等基因。其中PLC、ITPK、PIP5K、DGK等表現(xiàn)出多基因家族特征。12種基因的油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫基本信息見表1?？煽闯觯筒璺N子PI信號傳遞過程關(guān)鍵基因中，ITPK基因在油茶種子發(fā)育過程中表達(dá)量最大，RPKM（Reads Per Kilobases per Millionreads） 值 最 大 達(dá)162.373 5，其次是Calm，RPKM最高值達(dá)156.316 9，1-磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶基因表達(dá)量最低，RPKM 僅為 7.955 2～35.400 2。

2.3 油茶種子磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)關(guān)鍵酶功能基因不同時期的表達(dá)

PI信號系統(tǒng)在生物的發(fā)育過程和細(xì)胞對環(huán)境的響應(yīng)過程中都起著重要的作用，分析油茶種子磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)的基因，特別是關(guān)鍵基因的表達(dá)模式，有助于探索其功能。油茶種子果實膨大期和油脂合成高峰期數(shù)字化表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫分析顯示，油茶種子磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)12種關(guān)鍵基因，在油茶種子不同的發(fā)育時期都具有表達(dá)特異性。各基因不同時期表達(dá)詳情見表2。

表2數(shù)據(jù)分析顯示，磷脂酰肌醇4-激酶（PI4K）、磷脂酰肌醇（3）4-磷酸-5-激酶（PIP5K）、肌醇-三磷酸-激酶（ITPK）和鈣調(diào)蛋白質(zhì)（Calm）等基因FDR≤0.001且存在2倍以上表達(dá)差異，屬于油茶種子發(fā)育過程中磷脂酰信號系統(tǒng)果實膨大期和油脂合成高峰期表達(dá)差異顯著基因，其中Calm基因在果實膨大期幾乎無表達(dá)，油脂合成高峰期表達(dá)量比果實膨大期上調(diào)11倍，和PIP5K、ITPK等同屬于表達(dá)明顯上調(diào)基因，PI4K相對于果實膨大期，油脂合成高峰期表達(dá)明顯下調(diào)。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷脂酶 C（PLC）、肌醇單磷酸酶（IMP），以及3'（2'），5'-二磷酸-核苷酶等基因，雖然油脂合成高峰期基因表達(dá)上調(diào)，但上調(diào)幅度不大；磷脂酰肌醇合成酶（PIS）、二?；视图っ福―GK）、磷脂酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶等基因油脂合成高峰期表達(dá)下調(diào)，下調(diào)幅度也不大。這些基因的表達(dá)方式不能歸為有顯著變化的基因表達(dá)模式。磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸-3-磷酸酶（PTEN）基因在不同時期表達(dá)無明顯變化。

表1 油茶種子磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)主要表達(dá)基因Table 1 Unigenes and related enzyme functional genes regulating Phosphatidylinositol signaling system in transcriptome of Camellia oleifera seeds

表2 油茶種子PI信號系統(tǒng)關(guān)鍵基因不同時期表達(dá)差異分析Table 2 Expression difference analysis of key genes in PI signaling system of Camellia oleifera seeds with different stages and the peak stage

結(jié)合已有植物PI信號途徑研究，從基因功能分析，PI4K、PI3K和PIP5K是PI途徑中調(diào)控磷脂酰肌醇磷酸化的關(guān)鍵基因，其作用底物的磷酸化位點各不相同，PI4K、PI3K分別將PI在4位上和3位上磷酸化產(chǎn)生PI4P和PI3P，進一步在PIP5K的調(diào)控下形成磷脂酰肌醇-（3）4、5-二磷酸 （PtdIns（3/4，5）P2）。 PtdIns （4，5）P2是生物細(xì)胞內(nèi)重要的磷酯衍生物，能被PLC催化形成細(xì)胞內(nèi)兩種重要的第二信使分子，水溶性三磷酸肌醇（IP3）和脂溶性二?；视停―G）， 能夠啟動和激活細(xì)胞內(nèi)的鈣信號途徑[1，16]，Ca2+能充當(dāng)中間媒介介導(dǎo)細(xì)胞的多種反應(yīng)過程，通過與細(xì)胞內(nèi)多種酶或蛋自質(zhì)結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞多種重要生理功能，其中Calm是細(xì)胞內(nèi)主要Ca2+受體[20]，研究表明Calm參與了多種生理活動的調(diào)節(jié)，如植物對環(huán)境刺激的應(yīng)答所表現(xiàn)的抗性，推測油茶的抗干旱、抗霜凍的特性與油茶Calm基因的表達(dá)相關(guān)。

在擬南芥、水稻等模式植物中，PI4K和PIP5K表達(dá)模式和調(diào)控植物的發(fā)育過程和信號響應(yīng)等功能已有詳細(xì)研究[17-18]。ITPK可調(diào)控肌醇-三-磷酸（IP3）磷酸化成四磷酸肌醇（IP4）[21]，四磷酸肌醇可以使細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流而升高胞內(nèi)Ca2+濃度，調(diào)節(jié)細(xì)胞生理生化過程[22]。有報道表明，PI3K不但具有肌醇磷脂激酶活性，而且還具有蛋白激酶的活性，在細(xì)胞增殖、遷移和分泌等生物作用中起重要的作用[19]。很明顯 ITPK、PI4K、PI3K、PIP5K 和 PLC 等基因是調(diào)控油茶種子IP信號系統(tǒng)上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵基因。在油茶種子發(fā)育過程中，PI3K表達(dá)平穩(wěn)且不同時期表達(dá)量不大，PI4K基因盡管在油脂合成高峰期表達(dá)明顯下調(diào)，但其在油茶種子發(fā)育不同時期始終高豐度表達(dá)，PLC和PIP5K基因果實膨大期表達(dá)量較大且隨著油茶種子發(fā)育成熟表達(dá)上調(diào)，顯示與PI4K基因表達(dá)協(xié)同一致。與此相對應(yīng)，Calm基因和ITPK基因表達(dá)模式應(yīng)與PIP5K或PLC一致，這由表2數(shù)據(jù)可得到充分證明。Gillaspy等研究表明，以上過程形成的不同種類的磷脂酰肌醇-多磷酸可以作為植物體內(nèi)重要的信號分子參與調(diào)控植物不同的生理活動。從油茶種子果實膨大期（6月）到油脂合成高峰期（8、9月），油茶種子油脂積累處于逐漸上升趨勢。油茶種子發(fā)育過程中油脂成功積累過程需要植物細(xì)胞內(nèi)各生理過程協(xié)調(diào)作用，PI信號系統(tǒng)上游反應(yīng)過程中各基因的表達(dá)促使形成不同種類的磷脂酰肌醇-多磷酸，作為植物體內(nèi)重要的信號分子可以參與調(diào)控油茶種子發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答過程中各種生理活動，從而推動油脂積累過程順利進行，因此油茶種子PI信號系統(tǒng)上游反應(yīng)過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)上調(diào)或高豐度表達(dá)與油茶油脂的積累呈正相關(guān)。

磷脂酰肌醇-多磷酸在不同的磷酸酶的作用下還可以去磷酸化，以實現(xiàn)不同種類磷脂酰肌醇-多磷酸之間的轉(zhuǎn)化和含量的控制[23]，或最終將磷脂酰肌醇-多磷酸去磷酸化重新生成自由肌醇[24]。與此同時IP信號系統(tǒng)第二信使分子DG在IP信號系統(tǒng)下游反應(yīng)過程中還可被DGK和磷脂酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶調(diào)控形成CDP-二酰基甘油（CDP-DG），和磷脂酰肌醇-多磷酸去磷酸化生成的自由肌醇在PIS調(diào)控下可重新合成磷脂酰肌醇，參與下一輪信號傳導(dǎo)過程[25]。

從表2數(shù)據(jù)分析可發(fā)現(xiàn)，油茶種子PI途徑中含PTEN和IMP兩種磷酸酶基因、DGK基因和PIS基因，且各基因在油茶種子發(fā)育過程不同時期表達(dá)穩(wěn)定，可推測油茶種子發(fā)育過程PI信號系統(tǒng)下游反應(yīng)過程中存在磷脂酰肌醇再生循環(huán)利用過程，這一生理過程保證了PI信號系統(tǒng)的最初底物供應(yīng)，為油茶種子正常發(fā)育和油脂的積累提供了保障。

目前PTEN、IMP和PIS在擬南芥中均發(fā)現(xiàn)多種基因，各基因均表現(xiàn)不同的生理功能[17]。DGK在多種動植物中均已有研究，且表現(xiàn)為多基因特征，例如擬南芥基因組中有7個，哺乳動物有9個[26]。油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，油茶種子DGK基因也表現(xiàn)出多基因家族特征。

3 結(jié)語

高通量測序技術(shù)獲得油茶種子轉(zhuǎn)錄組和果實膨大期及油脂合成高峰期表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，為油茶的分子生物學(xué)研究提供了數(shù)字化信息平臺。要想獲得其中的信息，需要進行大量的分析、試驗驗證工作。生物體內(nèi)PI信號途徑既能調(diào)控生物細(xì)胞基因表達(dá)，又能調(diào)控生物體對環(huán)境因素的響應(yīng)，對生物的生存十分重要。目前植物PI信號途徑研究報道不多，油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，油茶種子油脂積累過程中存在PI信號途徑，且PI途徑中關(guān)鍵基因在油茶果實膨大期和油脂合成高峰期存在不同表達(dá)模式。從整體上看，油茶種子PI信號途徑各基因的表達(dá)協(xié)調(diào)進行，這有助于油茶種子發(fā)育過程油脂的平穩(wěn)積累，但各環(huán)節(jié)的基因調(diào)控和生理變化，以及與油脂合成及積累的關(guān)系，有待實驗進一步驗證和深入研究。

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