武俊瑞， 岳喜慶， 石 璞， 烏日娜

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

酸菜是將新鮮白菜用鹽水在密閉容器中泡制一段時(shí)間后形成的發(fā)酵蔬菜制品。自然發(fā)酵酸菜由于其獨(dú)特的風(fēng)味，至今仍深受廣大北方地區(qū)居民的喜愛(ài)。自然發(fā)酵酸菜這種獨(dú)特的發(fā)酵方式?jīng)Q定了其中微生物區(qū)系的多樣性，研究表明，乳酸菌在酸菜自然發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)揮著重要的作用[1-5]。然而，由于對(duì)傳統(tǒng)的自然發(fā)酵酸菜中乳酸菌的多樣性及其所扮演的角色，仍然沒(méi)有較為客觀、準(zhǔn)確的界定，傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜以其獨(dú)特的風(fēng)味和口感，仍占據(jù)著酸菜消費(fèi)的主流，嚴(yán)重制約了其現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)。因此，研究自然發(fā)酵酸菜中乳酸菌的多樣性及其所扮演的角色，具有重要的科學(xué)意義。

而對(duì)復(fù)雜的乳酸菌等微生物區(qū)系進(jìn)行研究，采用傳統(tǒng)的分離﹑純化和鑒定方法，不僅繁雜耗時(shí)，而且受培養(yǎng)條件和主觀因素影響較大，不能反映出乳酸菌的多樣性的真實(shí)情況[6-8]。近年來(lái)，基于16S rDNA結(jié)合變性梯度凝膠電泳法 （denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)，為有效分析復(fù)雜微生物群落及其多樣性提供了一種先進(jìn)手段[9-11]。

作者采用PCR-DGGE指紋技術(shù)，試圖解析傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸菜中乳酸菌種群結(jié)構(gòu)，揭示酸菜自然發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌群組成，為明確自然酸菜發(fā)酵機(jī)制及其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TE 緩沖液 ，5×TBE 電 泳緩沖液，10%SDS，CTAB 溶液，3 mol/L NaAc，5 mol/L NaCl，酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），氯仿/異戊醇（24∶1），40%聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺∶甲叉=37.5∶1），10%過(guò)硫酸銨，20%AgNO3，異丙醇，蛋白酶 K，dNTP，10×PCR Buffer，Loading Buffer，r-Taq 酶，37%甲醛，NaOH，冰醋酸，乙醇，三蒸水，蒸餾水，液氮等試劑，實(shí)驗(yàn)中的引物及其它酶制劑全部由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

PL303/01電子天平，METTLER TOLEDO FE20型pH計(jì)，HIRAYAMA HA-300M全自動(dòng)高壓蒸汽火菌器，ADVANTEC SP-650全自動(dòng)高壓干熱火菌器，ZHJH-C1112C無(wú)菌操作臺(tái)，OLYMPUS BX50光學(xué)顯微鏡及OLYMPUS PM-2攝像系統(tǒng)，菲恰爾TDL-SA離心機(jī)，LRH-250生化培養(yǎng)箱，Eppendorf TGL-168高速臺(tái)式離心機(jī)，UVP GDS-8000凝膠成像儀，北京六一DYY-12電泳儀，Eppendorf 5810高速冷凍離心機(jī)，TATIEC電熱恒溫水浴鍋，ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)、Bio-Rad變性梯度凝膠電泳儀 （DCode Universal Mutation Detection System）、Applied biosytems公司的 PCR儀、MJ RESEARCH PTC-200梯度PCR擴(kuò)增儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集及預(yù)處理 供試樣品為5份采集自東北地區(qū)農(nóng)家利用傳統(tǒng)方法制作的自然發(fā)酵酸菜發(fā)酵液。在樣品中加入5 mL PBS緩沖液，渦旋振蕩 30 s，然后 350 g離心 5 min，收集上清液，12 000 g離心5 min后，棄上清液，在沉淀總加入800 μL TE緩沖液回溶，用于總DNA的提取。

1.3.2 樣品總DNA的快速提取 采用FastPrep結(jié)合CTAB法進(jìn)行總DNA的快速提取。具體步驟如下：取預(yù)處理的樣品于2 mL離心管中，加入0.5 g玻璃珠，置于FastPrep核酸快速提取儀中，6.0 m/s振蕩 30 s；加入 SDS裂解液 50 μL，冰浴 10 min后14 000 g 離心 10 min，取上清液，加入 80 μL NaCl/dL CTAB溶液，65℃水浴20 min，加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）混勻，靜置 2 min，12 000 g 離心10 min，取上清液，等體積加入氯仿/異戊醇混勻，靜置2 min，再次12 000 g離心10 min，取上清液，加入 500 μL 異戊醇和 50 μL 3 mol/L NaA，-20 ℃放置30 min，12 000 g離心10 min，沉淀用70%乙醇洗滌兩次后，加入50 μL TE緩沖液回溶，-20℃保存?zhèn)溆肹12]。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 以提取的總DNA為模板，采用16S rDNA基因V3區(qū)具有特異性的引物對(duì)：V3F+GC：（5’-CGCCC GCCGCGCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGGACTCC TACGG GAGGC AGCAG-3’） 和 V3R：（5’-ATTACC GCG GCT GCT GG-3’），進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)約 180 bp。 擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）包括：50 ng基 因 組 DNA 模 板 ；2 μL dNTP （2.5 mmol/L，TaKaRa）； 兩條引物終濃度均為 0.4 mol/L；0.5 μL DNA Taq 聚合酶 （1.5 U，TaKaRa）；5 μL 10×PCR Buffer。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán)，包括 94℃變性 30 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 40 s，最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用10 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[13-14]。

1.3.4 DGGE及圖譜分析 采用Bio-Rad公司DcodTM的基因突變檢測(cè)系統(tǒng) （DCode Univeral Detection System Instrument）對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離。變性劑質(zhì)量濃度為27～52 g/dL，在150 V電壓下，60℃電泳6.5 h。電泳完畢后，利用銀染法對(duì)凝膠進(jìn)行染色。將銀染好的凝膠用掃描儀成像，得到PCR-DGGE圖譜，對(duì)上述掃描后的圖片進(jìn)行分析，標(biāo)記特異性條帶，并回收條帶[15]，由上海桑尼生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)鑒定。

2 結(jié)果與分析

采用CTAB-SDS-液氮凍融法提取酸菜樣品細(xì)菌總 DNA，并特異擴(kuò)增了細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)，其PCR-DGGE圖譜見(jiàn)圖1。

由圖1可知，酸菜樣品細(xì)菌DNA的PCRDGGE圖譜上共找到14條特異性條帶，對(duì)其編號(hào)、切割、回收、測(cè)序，并登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast同 源 性 對(duì) 比 分 析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表 1。

圖1 酸菜樣品細(xì)菌總DNA的PCR-DGGE圖譜Fig.1 DGGE profiles of PCR-amplified DNA from the bacterial population in each suan-cai sample

由表1可知，條帶a的比對(duì)結(jié)果為植物乳桿菌，5份樣品均檢測(cè)出該條帶；條帶b的比對(duì)結(jié)果為Hammesii乳桿菌，只有樣品2檢測(cè)出該條帶；條帶c的比對(duì)結(jié)果為乳桿菌屬種，樣品2檢測(cè)出了該條帶，樣品3也有較模糊的對(duì)應(yīng)條帶；條帶 e的比對(duì)結(jié)果為短乳桿菌，5份樣品均檢測(cè)出了該條帶，但樣品2、4條帶較弱；條帶f的比對(duì)結(jié)果為清酒乳桿菌，5份樣品均檢測(cè)出了該條帶，但樣品2、3、4的條帶較弱；條帶g、h的比對(duì)結(jié)果為彎曲乳桿菌，其中，5份樣品均檢測(cè)出了g條帶，但只有樣品2檢測(cè)出了h條帶；條帶 k的比對(duì)結(jié)果是乳酸乳球菌，樣品1、2、3、5中均檢測(cè)出了該條帶，而樣品4中沒(méi)有檢測(cè)出該條帶；條帶l的比對(duì)結(jié)果為Odoratitofui乳桿菌，只有樣品4檢測(cè)出了該條帶；條帶n的比對(duì)結(jié)果為非培養(yǎng)片球菌屬種，樣品2和5檢測(cè)出了該條帶；而條帶 d，i，j，m 在 GenBank現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有比對(duì)出結(jié)果，可能是不可培養(yǎng)微生物種類，還要做進(jìn)一步的研究才能對(duì)鑒定其屬種，樣品2檢測(cè)出了d條帶，樣品2檢測(cè)出了i條帶，樣品3檢測(cè)出了j條帶，樣品5檢測(cè)出了m條帶。

表1 酸菜樣品中細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE特異性條帶比對(duì)結(jié)果Table 1 Identification of the bands obtained by PCRDGGE of suan-cai bacterial communities 16S rDNA based on BLAST comparison in GenBank

由上述結(jié)果可知，通過(guò)PCR-DGGE圖譜分析、條帶測(cè)序和Blast同源性比對(duì)，5份傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜樣品共鑒定出了9個(gè)乳酸菌種，呈現(xiàn)出了較為豐富的乳酸菌多樣性。5份傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜樣品中的乳酸菌分布既有共性，又存在著一定的差異。在本試驗(yàn)的PCR-DGGE圖譜中，所有樣品均檢測(cè)出來(lái)了a、e、f和g四條條帶，為5份酸菜樣品中的共有條帶，其對(duì)應(yīng)的比對(duì)結(jié)果為植物乳桿菌、短乳桿菌、清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌，由此可以推斷，植物乳桿菌、短乳桿菌、清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌四種菌為傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中的優(yōu)勢(shì)菌群。同時(shí)，5份酸菜樣品在本試驗(yàn)中呈現(xiàn)較大差異性，得到的條帶數(shù)量和清晰程度均有所不同，其中，樣品2中檢測(cè)出了11條清晰的條帶，呈現(xiàn)出較為豐富的乳酸菌多樣性。此外，Hammesii乳桿菌和Odoratitofui乳桿菌在此前文獻(xiàn)中利用傳統(tǒng)方法并未分離到。

3 結(jié)語(yǔ)

東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中蘊(yùn)藏著豐富的乳酸菌資源，并且呈現(xiàn)出豐富的多樣性。應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)方法對(duì)東北自然發(fā)酵酸菜中乳酸菌多樣性進(jìn)行研究，可較為客觀地反應(yīng)傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中的乳酸菌等微生物區(qū)系，對(duì)于揭示酸菜自然發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌群組成，具有較高的參考價(jià)值。今后可用于其他具有復(fù)雜微生物體系的發(fā)酵食品研究中。

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