張偉國， 郭燕風

（江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

支鏈氨基酸包括L-纈氨酸 （L-valine）、L-亮氨酸（L-leuine）和 L-異亮氨酸（L-isoleuine），因其疏水脂質(zhì)鏈都具有分支的甲基集團，又稱之為分支鏈氨基酸[1]。支鏈氨基酸作為人體必需氨基酸，不僅是蛋白質(zhì)的合成原料，而且還具有特殊的生理和生物學功能，亦可作為生物體能源[2]。目前，支鏈氨基酸廣泛應用于氨基酸輸液、營養(yǎng)強化劑等醫(yī)藥行業(yè)[3]、洗滌劑[4]、以及除草劑領域[5-7]。由于支鏈氨基酸具有廣泛的用途，其需求量逐年增高。L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸的需求量分別為4 000、1 000、2 500 t/年，并且都以15%～20%的速率快速遞增。支鏈氨基酸可以通過蛋白水解提取法和酶催化法獲得，但是由于提取工藝復雜，污染嚴重以及與異構(gòu)體拆分困難等缺點，導致目前生產(chǎn)支鏈氨基酸的方法主要為微生物發(fā)酵法[8]。支鏈氨基酸生產(chǎn)菌種主要為谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum （包括其亞種黃色短桿菌Brevibacterium flavum和乳糖發(fā)酵短桿菌Brevibacterium lactofermentum等）[9-10]和大腸桿菌Escherichia coli[11]?，F(xiàn)在大多數(shù)企業(yè)所采用的生產(chǎn)菌種主要是通過常規(guī)誘變選育的，其遺傳背景不清晰，很難再提高產(chǎn)量[11]。作者主要介紹Corynebacterium glutamicum中支鏈氨基酸的生物合成途徑及其代謝調(diào)控，并對支鏈氨基酸代謝工程育種情況進行了綜述。

1 支鏈氨基酸生物合成途徑及其酶活性調(diào)節(jié)

支鏈氨基酸生物合成途徑見圖1[12]。三種支鏈氨基酸的生物合成途徑是緊密相連的，其中，L-異亮氨酸和L-纈氨酸經(jīng)由同一平行途徑，由相同的酶催化合成的，而L-亮氨酸是從L-纈氨酸前體物質(zhì)α-酮基異戊酸分支，并由一系列特殊的酶催化合成。支鏈氨基酸生物合成途徑中有4個公共酶系（分別為：乙酰羥酸合成酶AHAS、乙酰羥酸異構(gòu)還原酶AHAIR、二羥酸脫水酶DHAD和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶TAs）以及各自獨特的合成酶系，但正是因為生物合成途徑中的這些公共酶系，導致三種支鏈氨基酸在生物合成過程中相互作用，從而使某一支鏈氨基酸生產(chǎn)中常常副生另外兩種支鏈氨基酸，進而導致產(chǎn)酸水平下降和提取精制困難；而且由于三種氨基酸分子結(jié)構(gòu)相似，只是合成途徑中各種酶對底物親和性的不同，酶與底物存在著一種模糊的識別關系，從而導致三種支鏈氨基酸的代謝拮抗作用。

圖1 谷氨酸棒桿菌中支鏈氨基酸生物合成途徑及其反饋調(diào)節(jié)機制Fig.1 Biosynthetic pathway of branched-chain amino acids and regulation in Corynebacterium glutamicum

1.1 蘇氨酸脫水酶

蘇氨酸脫水酶（threonine dehydratase，TD）是 L-異亮氨酸合成的第一個關鍵酶，由ilvA基因編碼，利用5-磷酸吡哆醛（PLP）為輔因子，催化L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化為2-酮丁酸（2-ketobutyrate）。在C.glutamicum中，TD由4個完全一樣47 000大小的亞基組成，與Nocardia屬TD有較高的相似性，但與E.coli屬TD的相似度就比較低[13]。TD的活性在一定程度上決定了L-異亮氨酸和L-纈氨酸、L-亮氨酸的生物合成的分布流向，因為2-酮丁酸存在時，乙酰羥酸合酶優(yōu)先催化1分子丙酮酸和1分子2-酮丁酸脫羧合成1分子乙酰羥基丁酸而非催化2分子丙酮酸脫羧合成1分子乙酰乳酸[14]。因此，TD特異性地催化L-異亮氨酸的合成。在C.glutamicum和E.coli中，其最終產(chǎn)物L-異亮氨酸作為異構(gòu)效應物抑制TD活性。對于L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸，TD的 K0.5分別為 21、78、12 mmol/L。對 TD C-端調(diào)節(jié)區(qū)域266-349進行定點突變可以解除這些反饋抑制[15]。

1.2 乙酰羥酸合酶

乙 酰 羥 酸 合 酶 （acetohydroxyacid synthase，AHAS），也叫乙酰乳酸合酶，由ilvBN編碼，是支鏈氨基酸合成途徑上的第一個共用酶也是關鍵酶，既可以催化2分子丙酮酸脫羧合成1分子乙酰乳酸（acetolactate），即L-纈氨酸和L-亮氨酸的前體；也可以催化1分子丙酮酸和1分子2-酮丁酸脫羧合成1分子乙酰羥基丁酸 （acetohydroxy butyrate），即L-異亮氨酸的前體[11]。AHAS由兩個亞基組成，大亞基由ilvB編碼，具有催化功能；小亞基由ilvN編碼，具有調(diào)節(jié)功能，突變小亞基上的三個連續(xù)氨基酸可以解除三種支鏈氨基酸的反饋抑制[10]。同樣，E.coli中同工酶AHAS II、III對2-酮丁酸的親和性遠高于丙酮酸。在2-酮丁酸存在時，優(yōu)先合成L-異亮氨酸，此時L-纈氨酸和L-亮氨酸的合成減弱，高濃度的2-酮丁酸（100 mmol/L）會導致L-纈氨酸和L-亮氨酸匱乏。

1.3 乙酰羥酸異構(gòu)還原酶

乙酰羥酸異構(gòu)還原酶（Acetohydroxyacid Isomeroreductase，AHAIR）是支鏈氨基酸合成途徑上的第二個公共酶，該酶由ilvC基因編碼[16]。在L-纈氨酸和L-亮氨酸合成途徑中，催化乙酰乳酸生成2，3-二羥基異戊酸（dihydroxyisovalerate）；在 L-異亮氨酸合成途徑中，催化乙酰羥基丁酸生成2，3-二羥基-3-甲基戊酸（dihydroxymethyl valerate）。 反應包括烷基的異構(gòu)和還原，同時該反應還需要Mg2+（激活劑）和NADPH（氫供體）進行輔助。在E.coli中活躍的乙酰羥酸異構(gòu)還原酶是由相同的4個亞基所組成的四聚體，而在C.glutamicum中ilvC基因編碼的產(chǎn)物一直還未被描述。在C.glutamicum中，AHAIR被L-纈氨酸和L-亮氨酸所抑制。對于L-纈氨酸和L-亮氨酸，其IC50值都為7 mmol/L[16]。

1.4 二羥酸脫水酶

二 羥 酸 脫 水 酶 （dihydroxyacid dehydratase，DHAD）是支鏈氨基酸合成途徑上的第三個共用酶，該酶由ilvD基因編碼。在L-纈氨酸和L-亮氨酸合成途徑中，催化2，3-二羥基異戊酸生成2-酮異戊酸（ketoisovalerate）；在 L-異亮氨酸合成途徑中，催化2，3-二羥基-3-甲基戊酸生成2-酮-3-甲基戊酸（ketomethyl valerate）。 在 E.coli中 DHAD 蛋白質(zhì)分子是二聚物，由兩個66 000的亞基組成，而在C.glutamicum中，該酶是由611個氨基酸殘基組成的多肽鏈組成，相對分子質(zhì)量大約為65 000。C.glutamicum中，L-纈氨酸和L-亮氨酸對DHAD的抑制作用比較微弱，其IC50值分別為170、120 mmol/L。不過，在三種支鏈氨基酸都存在的條件下，并沒有發(fā)現(xiàn)對該酶的協(xié)同抑制作用。

1.5 轉(zhuǎn)氨酶

支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（transaminases，TAs）是支鏈氨基酸合成途徑上的最后一個共用酶。支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶主要包括轉(zhuǎn)氨酶B、轉(zhuǎn)氨酶C和芳香族轉(zhuǎn)氨酶，分別由基因ilvE、avtA和tyrB編碼。這三種轉(zhuǎn)氨酶在支鏈氨基酸的合成中都具有催化活性，但主要由轉(zhuǎn)氨酶B催化三種支鏈氨基酸合成的最后一步反應。轉(zhuǎn)氨酶B將來自脂肪族氨基酸中的α-氨基催化形成L-纈氨酸或者α-酮基谷氨酸。在C.glutamicum中ilvE基因編碼形成由367個氨基酸殘基組成的多肽鏈，相對分子質(zhì)量約為40 000[17]。

1.6 異丙基蘋果酸合成酶

在L-亮氨酸生物合成中，第二個關鍵酶為異丙基蘋果酸合成酶（isopropylmalate synthetase，IPMS），IPMS由leuA基因編碼，催化2-酮異戊酸生成異丙基蘋果酸[18]。IPMS受到L-亮氨酸的反饋抑制和反饋阻遏。IPMS和轉(zhuǎn)氨酶B的活性決定了在2-酮異戊酸節(jié)點生成L-亮氨酸或L-纈氨酸的流向。

2 支鏈氨基酸生物合成的相關調(diào)控

支鏈氨基酸合成途徑的調(diào)節(jié)復雜而且具有多樣性：支鏈氨基酸合成途徑中存在一種酶催化多步反應以及多種最終產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)同一個酶的現(xiàn)象。而且三種支鏈氨基酸合成途徑是平行關系；其合成途徑涉及的關鍵酶活性和基因表達都存在多價調(diào)節(jié)機制。

2.1 支鏈氨基酸對乙酰羥酸合酶AHAS的反饋抑制和阻遏

支鏈氨基酸反饋抑制和阻遏的主要是乙酰羥酸合酶AHAS。在C.glutamicum中，僅存在一種AHAS，被三種支鏈氨基酸中的任何一種反饋抑制。對于L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸，其IC50值分別為0.9、3.1、6.0 mmol/L，其中L-纈氨酸的抑制能力最強[16]。需要指出的是，任意兩種支鏈氨基酸組合，甚至全部三種支鏈氨基酸協(xié)同抑制，谷氨酸棒桿菌AHAS被抑制程度都不超過57%。AHAS的小亞基是調(diào)節(jié)亞基，對小亞基進行連續(xù)三個氨基酸的突變（Gly20Asp，Ile21Asp，Ile22Phe），可以完全解除三種支鏈氨基酸的反饋抑制作用[10]。對谷氨酸棒桿菌ilvN上3個相連的氨基酸殘基進行替換，可以得到不受任何支鏈氨基酸反饋抑制的突變體，這說明在C.glutamicum中ilvN上三種支鏈氨基酸的結(jié)合位點為同一個變構(gòu)位點，只是該位點對三種支鏈氨基酸的親和性有所不同。

與 C.glutamicum不同的是，E.coli中存在AHAS I、II、III三種同工酶， 分別由 ilvBN、ilvGM 和ilvIH編碼。三種同工酶在蛋白質(zhì)序列和功能上存在著較大的差異，其中AHAS I對L-纈氨酸敏感，AHAS III對三種支鏈氨基酸都敏感。但是，AHAS II對三種支鏈氨基酸都不敏感。AHAS I基因序列與AHAS II、III具有很大的差別，在功能上主要表現(xiàn)為對2-酮丁酸親和力的不同。AHAS I對2-酮丁酸親和力比對丙酮酸的親和力高了2倍，但是AHAS II、III卻分別高了60倍和40倍。即使在丙酮酸濃度較高的情況下，L-纈氨酸可以完全抑制AHAS I的活性，AHAS III只有部分活性受到抑制。AHAS II對任何一種支鏈氨基酸的抑制作用都不敏感。

2.2 支鏈氨基酸胞外分泌調(diào)節(jié)

支鏈氨基酸在細胞內(nèi)和細胞外的濃度會相差十幾甚至幾十倍。支鏈氨基酸在胞內(nèi)積累會對細胞產(chǎn)生毒害作用，從而影響整體的發(fā)酵產(chǎn)酸水平。支鏈氨基酸必須通過膜透性酶BrnFE轉(zhuǎn)運出去，才可減少這種產(chǎn)物毒害。另外，膜透性酶BrnFE的運輸功能還需要調(diào)節(jié)因子Lrp的輔助才能更好地完成。

3 代謝工程菌種選育狀況

傳統(tǒng)誘變主要通過選育抗結(jié)構(gòu)類似物的菌株，來解除中間產(chǎn)物及最終產(chǎn)物對合成途徑中關鍵酶的反饋抑制和反饋阻遏，達到最終增加產(chǎn)量的目的；傳統(tǒng)誘變也可以選育營養(yǎng)缺陷型菌株或某些藥物耐受型菌株，以提高產(chǎn)量；同樣也可以通過原生質(zhì)體融合技術賦予菌株更多的遺傳標記，達到增加產(chǎn)量的目的。

Katsumada等以谷氨酸棒桿菌和北京棒桿菌作為出發(fā)菌株，通過選育以乙酸為惟一碳源的菌株及以丙酮酸為惟一碳源的丙酮酸類似物敏感型菌株AV1和 AV2，L-纈氨酸的產(chǎn)量達到了 39、36 g/L，比出發(fā)菌株提高了36%[19]。陳寧等通過DES和UV誘變處理出發(fā)菌株TV10，在磺胺胍（SG）、α-氨基丁酸（α-AB）、2-噻唑丙氨酸（2-TA）結(jié)構(gòu)類似物平板上定向篩選出一株L-纈氨酸產(chǎn)生菌TV23，產(chǎn)酸水平提高了19.4%[20]。張偉國等以硫酸二乙酯（DES）和亞硝基胍（NTG）誘變處理，以氨基酸結(jié)構(gòu)類似物定向篩選出一株L-纈氨酸高產(chǎn)菌XQ-8（Leulα-ABhr2-TAhrAHVhr），50 L 罐補料分批發(fā)酵可產(chǎn)酸 72 g/L[21]；以黃色短桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)逐級誘變處理，獲得L-異亮氨酸高產(chǎn)菌株XQ-4（AHVrAECrSGrEthrα-ABrIleHxrSucg）， 可積累 L-異亮氨酸 28～30 g/L[22]。Ikeda由蘇氨酸產(chǎn)生菌FAB-3-1選育乙硫氨酸（Eth）抗性突變株，得到一株L-異亮氨酸產(chǎn)生菌No.14083，流加乙酸可產(chǎn)酸33.5 g/L[23]。宋文軍等根據(jù)代謝控制發(fā)酵原理，定向選育出突變株ISW330（Met-Ethrα-ABrAECr），可產(chǎn) L-異亮氨酸 20.2 g/L[24]。

Tsuchida等誘變?nèi)樘前l(fā)酵短桿菌2256獲得突變株 No.218（Met-Ile-2-TAr），最終可積累 L-亮氨酸28 g/L[25]。宋超先篩選出一株利福平（80 mg/L）耐受型菌株，最終可產(chǎn)L-亮氨酸32.1 g/L[26]。謝希賢以谷氨酸棒桿茵TG95為出發(fā)茵株，通過紫外誘變、原生質(zhì)體融合和硫酸二乙酯誘變，定向選育L-亮氨酸產(chǎn)生菌TGL8207，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)L-亮氨酸27.2 g/L，10 L罐補料分批發(fā)酵產(chǎn)酸44.5 g/L[27]。伍時華等采用原生質(zhì)體融合技術，定向選育出一株L-亮氨酸高產(chǎn)菌TQ9806，該菌株經(jīng)5 L罐分批發(fā)酵64 h，產(chǎn)L-亮氨酸22.7 g/L[28]。

目前，大多數(shù)企業(yè)所采用的生產(chǎn)菌種主要是通過常規(guī)誘變所選育的，其遺傳背景不清晰，產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率很難再提高。構(gòu)建基因工程菌是解決產(chǎn)量低和糖酸轉(zhuǎn)化率低的有效方法。構(gòu)建基因工程菌主要是通過表達合成途徑的關鍵基因、敲除或降低支路基因的表達等手段實現(xiàn)的。

Radmacher等在谷氨酸棒桿菌中缺失了ilvA和panBC基因，并過表達了ilvBNCD基因，在40 g/L葡萄糖的情況下?lián)u瓶培養(yǎng)能產(chǎn)L-纈氨酸90 mmol/L[29]。Elisakova等定點突變ilvN解除AHAS的反饋抑制作用，同時缺失競爭途徑中的ilvA和panB基因及過表達ilvBNC基因，在40 g/L葡萄糖的情況下?lián)u瓶培養(yǎng)能產(chǎn)L-纈氨酸130 mmol/L[10]。Blombach等敲除進入TCA循環(huán)的aceE基因以增加前體物質(zhì)丙酮酸的供給，并過表達ilvBNCE基因，分批發(fā)酵可產(chǎn)L-纈氨酸210 mmol/L[30]。Blombach等敲除編碼催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酸的丙酮酸/奎寧氧化還原酶的pqo基因，進一步增加丙酮酸供給；敲除編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的pgi基因，增加經(jīng)過磷酸戊糖途徑的碳流并使更多的NADPH用于L-纈氨酸的生物合成，結(jié)果攜帶質(zhì)粒pJC4ilvBNCE的谷氨酸棒桿菌（ΔaceEΔpqoΔpgi） 菌株分批發(fā)酵能產(chǎn)生 L-纈氨酸48.0 g/L[31]。 Holátko通過定點突變技術，對 ilvD 和ilvE基因的啟動子活性實施了上升調(diào)控；對ilvA和leuA基因的啟動子活性實施了下降調(diào)控，最終菌株可產(chǎn)L-纈氨酸15.9 g/L[32]。侯小虎等定點突變ilvN解除三種支鏈氨基酸的反饋抑制，并串聯(lián)表達ilvEBNrC基因，可產(chǎn)L-纈氨酸31 g/L[33]。

Gusyatiner等通過傳統(tǒng)誘變的方法失活ilvE基因，并過表達tyrB基因，構(gòu)建的菌株E.coli K-12 505/pACYC-tyrB可產(chǎn)L-亮氨酸2.7 g/L[34]。Katashkina等在E.coli中過表達誘變解除反饋抑制的leuA基因并失活ilvE基因，再過表達tyrB基因以及降低sucAB基因啟動子活性，最終可產(chǎn)L-亮氨酸11.4 g/L[35]。

Eggeling等通過基因工程手段加強了2-酮丁酸的供給，使代謝流向L-異亮氨酸的合成途徑，最終可產(chǎn)L-異亮氨酸20 g/L[36]。Ken-ichi等在E.coi K12中過量表達AK III（脫敏），構(gòu)建的菌株葡萄糖轉(zhuǎn)化率為30%[37]。Susanne Morbach等過量表達hom（脫敏）、thrB和ilvA（脫敏）三個基因，構(gòu)建表達菌株SM13，葡萄糖轉(zhuǎn)化率達到22%[38]。尹良鴻串聯(lián)表達解除反饋抑制的ilvA和ilvBN可產(chǎn)L-異亮氨酸30 g/L[39]。

4 展望

目前，我國采用發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)支鏈氨基酸已有十多年的歷史，但與國際先進水平相比，存在產(chǎn)酸水平低、雜酸高、發(fā)酵周期長、提取手段落后、產(chǎn)品純度低和生產(chǎn)過程污染嚴重等問題。解決目前存在的問題，在我國開展此方面的研究對于國內(nèi)支鏈氨基酸產(chǎn)業(yè)化，促進醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。而且國內(nèi)幾乎所有產(chǎn)支鏈氨基酸的菌種，都不可避免地副生另外兩種支鏈氨基酸。深入研究支鏈氨基酸生物合成途徑中的關鍵酶和關鍵因素，有望構(gòu)造高產(chǎn)任意一種支鏈氨基酸且無副生另外兩種支鏈氨基酸的菌株。

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