李佳偉 ， 劉 龍 ， 李江華 *， 堵國(guó)成 ，2， 陳 堅(jiān) ，2， 孫福新

（1.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；3.宜興協(xié)聯(lián)生物化學(xué)有限公司，江蘇 宜興 214203）

檸檬酸是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，由于它在食品（70%）、藥物和化妝品（12%）以及其它工業(yè)（18%）中的廣泛應(yīng)用，使得檸檬酸成為最具商業(yè)潛力的發(fā)酵產(chǎn)品之一，檸檬酸的產(chǎn)量逐年遞增[1]。采用黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌進(jìn)行深層液體發(fā)酵，已成為當(dāng)今世界檸檬酸生產(chǎn)的主流技術(shù)，檸檬酸發(fā)酵成為好氣發(fā)酵的典型之一[2]。

目前，在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中，關(guān)于檸檬酸發(fā)酵的研究主要包括低值原料的開發(fā)[3]、培養(yǎng)基研究[4]、淺層發(fā)酵的研究[5]、菌體形態(tài)的影響[6-7]、菌種誘變的研究[8-9]、菌體固定化的研究[10]以及溶氧條件對(duì)發(fā)酵過程的影響[10-12]。黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的過程是一個(gè)好氧過程，供氧水平對(duì)檸檬酸產(chǎn)量有至關(guān)重要的作用。文獻(xiàn)報(bào)道的溶氧水平優(yōu)化大部分是對(duì)通氣量的研究，對(duì)攪拌轉(zhuǎn)速的影響的研究很少。作者以可溶玉米漿與玉米清液作為培養(yǎng)基，研究了攪拌轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)溶氧水平優(yōu)化黑曲霉發(fā)酵檸檬酸生產(chǎn)工藝，考察了發(fā)酵過程中菌體量、產(chǎn)物、培養(yǎng)基殘?zhí)堑鹊淖兓闆r，并在攪拌轉(zhuǎn)速優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)行了分批補(bǔ)料發(fā)酵的研究。

1 材料與方法

1.1 菌種

檸檬酸生產(chǎn)菌黑曲霉 CCTCC M2013172：由作者所在實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基 （PDA培養(yǎng)基） 稱取已去皮的馬鈴薯200 g，加水500 mL，煮沸30 min，四層紗布過濾，再加葡萄糖20 g和瓊脂20 g，溶解定容至1 000 mL，趁熱分裝克氏瓶，每瓶50 mL左右，121℃滅菌20 min后取出，擱置成斜面。

1.2.2 發(fā)酵種子培養(yǎng)基 玉米清液，玉米漿，調(diào)節(jié)總糖10 g/dL，總氮0.2 g/dL。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 玉米清液，玉米漿，調(diào)節(jié)總糖

15 g/dL，總氮 0.08 g/dL。

1.3 培養(yǎng)條件

1.3.1 菌種活化及保藏 保藏的菌種轉(zhuǎn)接于克氏瓶斜面上，37℃恒溫箱倒置培養(yǎng)7 d，置于4℃冰箱保藏，一個(gè)月轉(zhuǎn)接一次。

1.3.2 種子培養(yǎng) PDA斜面（麩曲）培養(yǎng)一周，用無菌水洗下孢子，用玻璃珠打散，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以30萬/mL的接種體積分?jǐn)?shù)接入種子搖瓶培養(yǎng)基中，35℃、300 r/min搖床培養(yǎng) 24 h。

1.3.3 發(fā)酵條件 以10%的接種體積分?jǐn)?shù)接入種子液，控制一定發(fā)酵條件，培養(yǎng)至還原糖低于0.5%發(fā)酵結(jié)束。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 菌濃檢測(cè)方法 菌體干濕重測(cè)定：均勻取50 g培養(yǎng)液，用一層絹紗過濾至500 mL燒杯中，用洗瓶沖洗，沖洗量約200 mL左右，沖洗時(shí)邊沖洗邊用玻璃棒攪拌，之后將過濾到燒杯中的菌液通過高速離心機(jī)離心，或用濾紙抽濾后稱濕重，然后于105℃烘箱烘干后稱干重。

1.4.2 產(chǎn)酸測(cè)定方法 發(fā)酵液過濾取上清液1 mL，用0.142 9 mol/L的NaOH滴定（酚酞為顯示劑），滴定的體積即為酸度，單位g/mL。

1.4.3 還原糖測(cè)定方法 3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定溶液中還原糖[13]。

1.4.4 總糖測(cè)定方法 先對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行水解，然后用蒽酮比色法測(cè)定[14]發(fā)酵液中的總糖質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)的影響

考察了黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸過程中攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)于菌體生長(zhǎng)的影響，在其它培養(yǎng)條件 （溫度、pH、通風(fēng)、初糖質(zhì)量濃度）一致的情況下，研究了在不同的攪拌轉(zhuǎn)速（400～800 r/min）下發(fā)酵過程中菌體生物量、發(fā)酵液殘?zhí)且约叭苎醯淖兓闆r，結(jié)果見圖1。

圖1 不同溶氧對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of agitationrate on the growth

由圖1（a）可見，攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)于生物量有著很大的影響，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增大，生物量也相應(yīng)增大，在400 r/min和800 r/min時(shí)，最大生物量分別為29 g/L和50 g/L，相差很大，說明低轉(zhuǎn)速會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢。這是因?yàn)楹谇故呛醚跷⑸铮瑢?duì)于溶氧的要求較高。另外，菌體并未因?yàn)檩^高的轉(zhuǎn)速導(dǎo)致菌絲破碎溶解而致生物量降低，這可能因?yàn)榘l(fā)酵過程中黑曲霉是以菌球形態(tài)存在，對(duì)于攪拌的剪切作用承受能力較大。參考圖1（b），低轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)液中的還原糖消耗相當(dāng)慢，說明低溶氧條件下菌體的代謝活動(dòng)相當(dāng)緩慢。

由圖 1（b）可見，發(fā)酵初期（0～8 h）殘余還原糖的質(zhì)量濃度有上升的趨勢(shì)，攪拌轉(zhuǎn)速越小，還原糖質(zhì)量濃度上升越快。這是因?yàn)樵诎l(fā)酵初期，黑曲霉菌體中的糖化酶會(huì)作用于底物大分子非還原糖（淀粉），將其分解為小分子還原糖為菌體的快速生長(zhǎng)做準(zhǔn)備。在發(fā)酵初期糖化酶水解淀粉產(chǎn)生還原糖的速度大于菌體分解利用的還原糖量，隨著發(fā)酵的進(jìn)行糖消耗速度增大，還原糖質(zhì)量濃度逐漸降低，且與攪拌轉(zhuǎn)速相關(guān)。

由圖1（c）可見，不同的攪拌轉(zhuǎn)速發(fā)酵過程，溶氧水平變化表現(xiàn)出相似的變化，在發(fā)酵前期（8～24 h）內(nèi)保持較低的時(shí)間，說明這段時(shí)間是黑曲霉菌體的快速生長(zhǎng)期，代謝活動(dòng)旺盛需要大量的溶解氧。而發(fā)酵后期需氧量減少，供氧速率高于耗氧速率，溶氧上升，這與微生物的生長(zhǎng)是一致的。

2.2 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)黑曲霉生產(chǎn)檸檬酸的影響

不同攪拌轉(zhuǎn)速下黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酸的情況見圖2。產(chǎn)酸情況在保持恒定的不同的攪拌轉(zhuǎn)速下有較大的差異，這與攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)黑曲霉菌體生長(zhǎng)的影響是基本一致的。在攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min時(shí)，檸檬酸生成量相當(dāng)?shù)?，最終產(chǎn)酸為2.2 g/dL，當(dāng)轉(zhuǎn)速升高到500 r/min時(shí)，檸檬酸生成量有較大的提高，最終產(chǎn)酸量為12.9 g/dL。這說明溶氧水平對(duì)于檸檬酸產(chǎn)量有重要的影響，發(fā)酵過程一定要保持一定的溶氧水平。但產(chǎn)酸量并不完全隨著攪拌轉(zhuǎn)速的提高而升高，在攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min下最終產(chǎn)酸量最大，達(dá)到12.9 g/dL。當(dāng)轉(zhuǎn)速由500 r/min提高到800 r/min，最終產(chǎn)酸量由12.9 g/dL降低至11.1 g/dL。發(fā)酵前半程轉(zhuǎn)速600 r/min時(shí)產(chǎn)酸量較大。

圖2 不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)黑曲霉生產(chǎn)檸檬酸的影響Fig.2 Effect of agitation rate on citric acid production

在發(fā)酵初期（0～8 h）基本沒有產(chǎn)酸，之后的 8～24 h產(chǎn)酸量快速升高，而這階段也是菌體快速生長(zhǎng)的階段，綜合圖1和圖2可以看出，發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酸是相關(guān)聯(lián)的。當(dāng)進(jìn)入發(fā)酵期后，產(chǎn)酸量迅速提高，pH很快降低到2以下，這對(duì)發(fā)酵過程是必要的，因?yàn)橹挥性谳^低的pH下檸檬酸才能大量積累，也會(huì)有效抑制雜菌污染[15-16]。

通過公式γp=dP/dt可以計(jì)算不同轉(zhuǎn)速下檸檬酸產(chǎn)生速率，其中P是檸檬酸產(chǎn)量（g/dL），t為時(shí)間（h）。用Origin軟件對(duì)圖2（a）中的酶活數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合后進(jìn)行插值計(jì)算，可以得到不同攪拌轉(zhuǎn)速下的產(chǎn)酸速率—時(shí)間關(guān)系曲線，如圖2（b）。

由圖2（b）可見，攪拌速率對(duì)最高產(chǎn)酸速率出現(xiàn)的時(shí)間基本沒影響，均出現(xiàn)在32 h左右。較高轉(zhuǎn)速和較低的轉(zhuǎn)速均不利于產(chǎn)酸，轉(zhuǎn)速500 r/min時(shí)產(chǎn)酸速率最大，達(dá)到 0.34 g/（dL·h）。 綜合圖 2（a）和圖2（b）固定轉(zhuǎn)速下500 r/min是最優(yōu)轉(zhuǎn)速。另外，在攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min下，發(fā)酵初期的產(chǎn)酸速率較其它轉(zhuǎn)速高。

不同攪拌轉(zhuǎn)速下黑曲霉的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。其中在轉(zhuǎn)速500 r/min下，產(chǎn)酸量、糖酸轉(zhuǎn)化率最大，為最佳轉(zhuǎn)速。

表1 不同攪拌轉(zhuǎn)速條件下的發(fā)酵參數(shù)比較Table 1 Fermentation parameters in different agitation rate

2.3 兩階段攪拌轉(zhuǎn)速控制對(duì)檸檬酸分批發(fā)酵的影響

根據(jù)文獻(xiàn)[17]并基于上述的分析結(jié)果，提出了檸檬酸分批發(fā)酵過程的攪拌轉(zhuǎn)速兩階段控制策略：發(fā)酵前期（0～16 h）攪拌轉(zhuǎn)速控制 600 r/min，發(fā)酵中后期攪拌轉(zhuǎn)速控制為500 r/min，結(jié)果見圖3及表2所示。

從圖3可以看出，在兩階段攪拌轉(zhuǎn)速控制發(fā)酵過程中，黑曲霉菌體的生長(zhǎng)情況變化不大，但是檸檬酸的積累量有較大的提高，見表1及表2。檸檬酸產(chǎn)量（14.1 g/dL）比最優(yōu)恒定轉(zhuǎn)速（500 r/min）提高了8.5 g/dL，相應(yīng)的糖酸轉(zhuǎn)化率也提高了8.5%，且檸檬酸的合成速率也有提高。因?yàn)榘l(fā)酵初期菌體生長(zhǎng)與檸檬酸的合成相關(guān)聯(lián)，較高的溶氧可以保證菌體的生長(zhǎng)，同時(shí)使體系pH迅速降低到2以下，以抑制雜酸產(chǎn)生，主要積累檸檬酸。發(fā)酵中后期保持一定的溶氧水平就可以維持菌體的代謝，較高的溶氧會(huì)使菌體大量積累而降低產(chǎn)物的合成，而且較高的轉(zhuǎn)速會(huì)影響黑曲霉的菌球形態(tài)，導(dǎo)致產(chǎn)物分泌減少。

2.4 基于兩階段攪拌轉(zhuǎn)速策略分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸

分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)是在分批發(fā)酵過程中補(bǔ)充培養(yǎng)基，而不從體系中排除發(fā)酵液的培養(yǎng)方式。在發(fā)酵工業(yè)中采用分批補(bǔ)料發(fā)酵可以使底物的殘留保持在較低的水平，可以緩和底物抑制，富集高濃度細(xì)胞，延長(zhǎng)代謝產(chǎn)物的積累時(shí)間，獲得更高的產(chǎn)量。

圖3 采用兩階段攪拌轉(zhuǎn)速控制的發(fā)酵過程曲線Fig.3 Fermentation curveunder two-stage agitation rate

表2 兩階段攪拌轉(zhuǎn)速控制策略的發(fā)酵參數(shù)Table2 Fermentation parameterundertwo-stage agitation rate

根據(jù)圖 1（b）及圖 2（a），在發(fā)酵至 48 h 時(shí)，殘?zhí)橇亢艿颓耶a(chǎn)酸速率降至很低，參照文獻(xiàn)[18-19]，如果能在這時(shí)補(bǔ)充葡萄糖，理論上可以延長(zhǎng)檸檬酸積累的時(shí)間，提高檸檬酸的產(chǎn)量。因此，作者研究將兩階段攪拌策略與分批補(bǔ)料發(fā)酵相結(jié)合進(jìn)行發(fā)酵過程優(yōu)化：發(fā)酵前期（0～16 h）攪拌轉(zhuǎn)速控制為600 r/min，發(fā)酵中后期攪拌轉(zhuǎn)速控制500 r/min，初始總糖質(zhì)量濃度15 g/dL，發(fā)酵至48 h一次性補(bǔ)加葡萄糖50 g，使補(bǔ)入后的發(fā)酵液還原糖質(zhì)量濃度為6 g/dL，結(jié)果見圖4。

圖4 兩階段攪拌轉(zhuǎn)速策略分批補(bǔ)料發(fā)酵過程曲線Fig.4 Fermentation curve of fedbatch fermentation

由圖4可以看出，在發(fā)酵進(jìn)程殘?zhí)橇枯^低的情況下補(bǔ)入葡萄糖后，為菌體的代謝活動(dòng)提供了新的原料，菌體量由45 g/L上升到52 g/L，產(chǎn)酸速率明顯升高。與兩階段攪拌轉(zhuǎn)速控制分批發(fā)酵相比，分批補(bǔ)料發(fā)酵的檸檬酸產(chǎn)量 （17.2 g/dL）提高了22.8%，糖酸轉(zhuǎn)化率（95.5%）提高了2.2%。

3 結(jié)語

通過采用可溶玉米漿與玉米清液作為發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)檸檬酸黑曲霉CCTCC M2013172進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，為了便于測(cè)定生物量使用與生產(chǎn)培養(yǎng)基有所改變，所以產(chǎn)量也有所差異。通過考察攪拌轉(zhuǎn)速等條件對(duì)發(fā)酵過程的影響，發(fā)現(xiàn)黑曲霉生產(chǎn)檸檬酸是生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型的，適當(dāng)?shù)木w質(zhì)量濃度有利于產(chǎn)酸，但是檸檬酸的產(chǎn)量并不是與菌體質(zhì)量濃度呈正比例關(guān)系。

由發(fā)酵結(jié)果可知，在恒定轉(zhuǎn)速400～800 r/min之間，轉(zhuǎn)速500 r/min是最優(yōu)轉(zhuǎn)速，由于發(fā)酵前期菌體的生長(zhǎng)情況與發(fā)酵液pH對(duì)后期的檸檬酸積累有很大影響，所以采用了兩階段攪拌轉(zhuǎn)速策略：發(fā)酵前期（0～16 h）攪拌轉(zhuǎn)速控制為 600 r/min，發(fā)酵中后期攪拌轉(zhuǎn)速控制為500 r/min，檸檬酸產(chǎn)量（14.1 g/dL）與糖酸轉(zhuǎn)化率均比最優(yōu)恒定轉(zhuǎn)速（500 r/min）下提高了8.5%。在此基礎(chǔ)上又進(jìn)行了分批補(bǔ)料發(fā)酵優(yōu)化，與兩階段攪拌轉(zhuǎn)速控制分批發(fā)酵相比，分批補(bǔ)料發(fā)酵的檸檬酸產(chǎn)量（17.2 g/dL）提高了22.8%，糖酸轉(zhuǎn)化率（95.5%）提高了2.2%。

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